重樓皂苷抗膠質瘤作用機制的研究進展

鄭淑嫻 邱鵬程 王媛媛 杜洋 薛玉葉 孫光強 陸云陽 湯海峰

腦膠質瘤(神經膠質瘤)約占所有原發性腦腫瘤和其他中樞神經系統腫瘤的26%，占惡性腦腫瘤的81%，其患者的中位生存期為12～15個月，確診后的5年生存率約為5%[1]，具有發病率高、復發率高、致殘率高、死亡率高和治愈率低的“四高一低”特點[2]。臨床常用治療手段包括手術、化療和放療，但目前臨床一線化療藥如替莫唑胺等耐藥性普遍，作用機制單一，即使與其他化療藥物如貝伐單抗等聯合用藥的治療效果亦不夠理想[3]。因此，開發安全有效的新型抗膠質瘤藥物具有十分重要的意義。

重樓屬(Paris)植物為多年生草本植物，屬于延齡草科(Trilliaceae)，現多歸為百合科(Liliaceae)。2020版《中華人民共和國藥典》收載的中藥重樓(Paridis Rhizoma)是云南重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand. Mazz.]和七葉一枝花[Paris.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效[4]。已從重樓屬植物中分離得到的化學成分包括甾體皂苷類化合物、C21甾體皂苷、五環三萜皂苷、植物甾醇以及黃酮等[5]。甾體皂苷類化合物是重樓屬植物的主要活性成分，亦總稱為重樓皂苷，其藥理活性有抗腫瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化、免疫調節和止血等[6]。重樓皂苷在抗腫瘤方面多有報道，對乳腺癌、卵巢癌、胃癌及喉癌等多種癌癥均有顯著抑制作用[7]。近年來，對重樓皂苷抗膠質瘤的研究也逐步增多，已報道的具有抗膠質瘤活性的單體包括重樓皂苷I(D)[8-9]、Ⅱ[10]、Ⅲ(薯蕷皂苷)[11]、Ⅵ[12]、Ⅶ[13]和H[14]等(見表1，化學結構式見圖1)，但目前尚無綜述對其作用機制進行總結。本文對重樓皂苷抗膠質瘤的作用機制進行綜述，以期為重樓皂苷抗膠質瘤活性的深入研究提供參考。

1 誘導細胞程序性死亡

1.1 誘導細胞凋亡

細胞凋亡是一種高度調節的程序性細胞死亡過程，通過有序有效地清除受損或有害的細胞，在維持組織內環境穩態中發揮重要作用。細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：首先是細胞接受凋亡信號，凋亡信號調控分子間相互作用，從而調節含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)的活性，繼而進入連續的反應過程。因啟動階段的不同，細胞凋亡往往又通過三種通路來實現，分別為線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路[17]。

表1 具有抗膠質瘤活性的7種重樓皂苷

圖1 具有抗膠質瘤活性的7種重樓皂苷化合物結構式

1.1.1 線粒體通路 在重樓皂苷抗膠質瘤的作用機制中，最常出現的凋亡通路為線粒體通路，又稱為內在途徑。B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白在線粒體信號通路中發揮至關重要的作用[18]，其中BCL-2相關X蛋白(BCL2-Associated X，Bax)是一種促凋亡蛋白，當Bax高表達時，可促使細胞發生凋亡[19]；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，當Bcl-2高表達時，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡[20]，所以細胞內Bcl-2/Bax的比例決定了細胞凋亡的敏感性，從而改變線粒體膜的通透性，致使跨膜電位降低，細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)被釋放。Cyt-C是線粒體凋亡途徑中關鍵的調節因子[21]，它可與凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結合，激活Caspase家族中的Caspase-9，進而激活下游蛋白Caspase-3和Caspase-7，從而誘導細胞凋亡[22]。

化合物1通過靶向STAT3抑制膠質瘤細胞的增殖，并降低線粒體膜電位，誘導U251細胞發生凋亡[23]。化合物1還可通過上調Bax和Caspase-3的蛋白表達，降低Bcl-2的蛋白表達，從而誘導U87膠質瘤細胞發生凋亡[24]。化合物3可以誘導促凋亡調節因子(programmed cell death 5，PDCD5)核易位，造成C6膠質瘤細胞DNA和線粒體損傷，下調Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達，上調Bax、Bak和Bid的蛋白表達，使 Bcl-2/Bax比值降低，通過激活線粒體通路誘導細胞凋亡從而抑制細胞增殖[25]。化合物3也可誘導膠質瘤U87MG細胞發生凋亡，其分子機制為上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的mRNA和蛋白表達水平，上調Bax蛋白表達水平，下調Bcl-2蛋白表達，造成Bcl-2/Bax的比值減小，誘導凋亡發生從而抑制細胞增殖[26]。化合物4誘導膠質瘤細胞發生凋亡是通過增加Bax、Caspase-3、8和9的表達水平，降低Bcl-2的表達水平[27]。化合物6可顯著上調SHG44R細胞中凋亡相關蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表達水平，降低Bcl-2的表達水平，使SHG44R膠質瘤細胞通過線粒體通路發生凋亡[28]。

線粒體是產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的重要部位，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的穩定與細胞內ROS的水平密切相關[29]。ROS的累積能破壞線粒體膜，誘導MMP變化，而MMP的穩定有利于維持細胞的正常生理功能[30]。化合物7能增加膠質瘤LN229細胞內ROS水平，并誘導LN229細胞MMP降低，通過ROS介導的線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡[16]。化合物2誘導膠質瘤細胞凋亡也是通過ROS介導的，經化合物2處理后，U87和U251細胞中Bcl-2、AKT和P-AKT的水平降低，Cyt-C、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的水平升高，最終，通過ROS介導的線粒體通路誘導膠質瘤細胞死亡[31]。

1.1.2 死亡受體通路 死亡受體通路又稱為外源性途徑。在此途徑中，死亡受體相關蛋白有TNFR、Fas(CD95、Apo1)和DR3(Apo3)等[32]，相應的死亡配體分別為TNF、FasL(CD95L)、Apo-3(DR3L)和Apo-2L(TRAIL)等[33]。受體與膜上相應的配體結合導致細胞膜中Fas相關死亡域蛋白(Fas-associated with death domain protein，FADD)和TNF-R1相關死亡域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD)聚集，形成凋亡誘導復合物(death-inducing signaling complex，DISC)。DISC包括受體復合物、配體復合物、引發劑procaspase-8、procaspase-10以及其他幾種調節因子和輔助因子[34]。被激活的Caspase-8/10進而激活下游效應器，引起細胞凋亡。

化合物1不僅可以增加膠質瘤U251細胞線粒體膜的通透性，引起線粒體功能障礙，誘導U251細胞通過線粒體通路凋亡，還可以增加胞內c-jun-氨基末端激酶(c-jun-NH2-terminal kinase，JNK)的蛋白表達，通過激活JNK信號通路，促進U251人腦膠質瘤細胞凋亡[35]。在膠質瘤U251細胞中，化合物1和化合物2還能通過促進Fas蛋白的表達，進而上調Caspase-8的水平，從而激活下游蛋白Caspase-3及其通路，誘導膠質瘤細胞通過外源性途徑凋亡[36]。在神經母細胞瘤NB-69細胞中，化合物1誘導的細胞死亡是通過RIPK1、RIPK3、FADD和caspase 8之間形DISC，當Caspase-8被激活，RIPK1和RIPK3不被激活時，會導致細胞凋亡[37]。化合物1也可通過上調細胞內Caspase-8的水平，促進NB-69細胞通過外源性途徑凋亡[38]。化合物1還可以通過上調p-JNK和t-JNK的蛋白表達，誘導U87人腦膠質瘤細胞通過JNK途徑凋亡[24]。JNK途徑是誘導細胞通過死亡受體通路凋亡的主要途徑之一。

1.1.3 內質網通路 內質網是細胞內蛋白質合成的主要場所，也是Ca2+的主要儲存庫[39]。當內質網內鈣離子平衡被破壞或者濃度改變時，會激活內質網膜上的相關蛋白進而引發細胞凋亡[40]。目前尚未有重樓皂苷通過內質網途徑誘導膠質瘤細胞凋亡的報道。

1.2 誘導細胞焦亡

細胞焦亡是由炎性小體引發的一種細胞程序性死亡，又稱為細胞炎性壞死。細胞焦亡的發生依賴于炎性Caspase和GSDMs蛋白家族[41]。其特征是激活Caspase-1形成質膜孔，導致促炎細胞因子的釋放和細胞裂解。細胞通過釋放促炎內容物如白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18擴大或維持炎癥[42]。

化合物6能夠顯著增加膠質瘤SHG44R細胞中Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表達量，上調Cleaved Caspase-1、CleavedN-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3蛋白水平，從而誘導膠質瘤細胞焦亡[28]。

1.3 誘導細胞壞死

細胞壞死是由細胞直接損傷引起的，其機制為：腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的含有受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIPK1)的復合物形成，RIPK1、RIPK3、FADD和Caspase-8之間形成復合物，當Caspase-8未被激活時，RIPK1和RIPK3被激活，MLKL(RIP3底物混合譜系激酶樣結構域)被磷酸化，與細胞膜結合并形成一個孔，使細胞膜被破壞，導致細胞壞死性死亡[43-45]。Watanabe S等[38]發現化合物1可以誘導RIPK1、RIPK3、FADD和caspase-8形成復合物，并通過復合物途徑誘導膠質瘤IMR-32和LA-N-2細胞壞死。

2 誘導細胞周期阻滯

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程。一個完整的細胞周期是由DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、細胞分裂期(M期)和G0期所組成[46]。

調節細胞周期是維持體內平衡的關鍵，細胞間或細胞內通過信號傳遞保持細胞增殖和死亡平衡[47]。與細胞周期密切相關的蛋白有細胞周期蛋白(Cyclins)和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)。在細胞周期的不同時期，不同的Cyclin-CDK復合物驅動著細胞周期的運轉。為了避免細胞的無限增殖，細胞周期中存在抑制系統，即CDKs抑制蛋白，包括P15、P16、P18、P19，以及P21、P27和P57。細胞周期進展受多個細胞周期檢查點的限制，檢查點可能會引起細胞周期停滯，從而使細胞增殖延遲[48-50]。

用不同濃度(2、3、4、5、6、7、8和9 μM)的化合物1處理U251膠質瘤細胞24、48和72小時，發現化合物1能以劑量和時間依賴性方式顯著抑制膠質瘤細胞生長，并使細胞G2/M期細胞增多，G0/G1期細胞減少，表明化合物1在G2/M期誘導U251膠質瘤細胞阻滯[35]。化合物3通過調節DNA拓撲異構酶Ⅰ、P53、CDK2和Caspase A的表達，誘導C6膠質瘤細胞在G0/G1期數量減少，而S期的細胞數量增加，表明化合物3可誘導膠質瘤細胞在S期周期停滯[25]。用不同濃度(0、10、20、30、40和50 μM)的化合物3處理膠質瘤U87MG細胞48小時，經Western blot檢測發現Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達下降，誘導膠質瘤細胞在G0/G1期阻滯[26]。化合物4通過下調細胞Cyclin B1的水平，使細胞在G2/M期累積，影響細胞周期進展從而抑制膠質瘤細胞生長增殖[27]。用25、50或100 g/mL化合物6處理U251膠質瘤細胞能上調P21和P27蛋白的表達水平，抑制Cyclin D1和S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase associated protein，Skp2)蛋白的表達，使細胞在G1期聚集，在S期和G2期細胞數量減少，誘導膠質瘤細胞周期停滯在G1期[51]。

與非耐藥株相比，耐替莫唑胺的膠質瘤細胞株可能具有自發性的周期阻滯現象，這可能幫助耐藥株抵抗替莫唑胺的化療藥物壓力。用不同濃度(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8和16 μg/mL)化合物5處理U87R和SHG44R膠質瘤細胞后，發現化合物5能劑量依賴性抑制膠質瘤細胞增殖 ，并且上調Cyclin D1的蛋白表達，下調周期抑制蛋白P21和P27的水平，打破耐藥膠質瘤U87R和SHG44R的自發性周期阻滯現象[52]。

3 誘導細胞自噬

自噬是一種細胞分解代謝的過程。在此過程中，細胞自身蛋白質和細胞器被隔離成囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物[53]，因此被認為是一種新型的程序性細胞死亡，又稱為 Ⅱ 型程序性細胞死亡[54]。

與自噬有關的細胞因子如微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬相關基因Beclin-1和泛素結合蛋白P62。LC3是自噬標記物，分為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩個亞型。LC3-Ⅰ是一種可溶性蛋白質，細胞發生自噬時，游離在細胞質中的LC3-Ⅰ會與自噬體膜表面的磷脂酞乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬體膜的必需組分，能與自噬體膜穩定結合。自噬體與溶酶體融合后，自噬體內成分被溶酶體降解，同時LC3-Ⅱ也被降解，所以LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ的量反映了自噬的發生過程及程度[55-56]。P62是一種典型的自噬受體，它參與泛素化蛋白質的蛋白酶體降解，蛋白酶體抑制引起的蛋白毒性應激可通過P62磷酸化來激活自噬[57]。Beclin-1是自噬過程中關鍵的調控蛋白[58]，是第一個被發現能夠介導自噬的哺乳動物因子，也是自噬體形成所需的上游分子[59]。調控自噬過程的常見通路有：AMPK-mTORC1通路、PI3K/AKT/mTORC1通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路。

LIU W等[27]通過Western blot發現化合物4可以上調LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達水平，從而誘導膠質瘤細胞自噬。化合物5能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，降低P62蛋白水平，可能通過抑制AKT/mTORC1信號通路來誘導膠質瘤細胞自噬，ROS的過度產生抑制AKT活性，進而抑制mTORC1復合物活性[60]。

4 抑制細胞遷移與侵襲

腫瘤細胞向周圍組織和血管的侵襲和遷移是腫瘤轉移的關鍵步驟，腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要原因。細胞的侵襲和遷移主要與上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關[61]，腫瘤細胞在EMT過程中，其上皮標記物鈣黏蛋白E-cadherin會顯著減少，間充質標記物N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)和Snail蛋白的表達會增加[62]，使得細胞骨架變為波形細胞骨架，導致癌細胞黏附能力減弱、侵襲遷移能力變強。

化合物2處理過的膠質瘤細胞遷移侵襲能力明顯下降。經Transwell實驗檢測，高劑量和低劑量化合物2均能顯著抑制U87和U251膠質瘤細胞的遷移和侵襲[31]。化合物6也經Transwell實驗和侵襲實驗顯示對U251膠質瘤細胞有抑制遷移和侵襲的作用[51]。化合物2還能通過抑制Snail的表達水平，促進E-cadherin表達水平升高，進而抑制膠質瘤T98G和LN18細胞的侵襲能力[63]。化合物4通過促進膠質瘤細胞中E-cadherin蛋白的表達，下調N-cadherin蛋白的水平從而抑制膠質瘤細胞的遷移與侵襲[27]。化合物5通過下調N-cadherin、β-catenin、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Smad2的蛋白水平呈劑量依賴性抑制膠質瘤細胞的遷移[52]。

表2 重樓皂苷的抗膠質瘤作用及機制概覽

5 聯合用藥及逆轉耐藥

臨床治療膠質瘤過程中，化療藥物的耐藥性是治療失敗的主要原因之一[64]。常用傳統化療藥物有卡莫司汀、順鉑和替尼泊苷，但它們的有效率只有20%左右。最新化療藥物替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的有效率也只有35%[65]，并且重復使用亞致死量可誘導膠質瘤耐藥性[66]。據報道，重樓皂苷對耐藥膠質瘤有顯著的治療作用，與TMZ聯合使用，協同作用明顯，能降低膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性。

0.4 μmol/L 化合物5 和90 μmol/L TMZ聯合處理U251膠質瘤細胞會導致 MGMT mRNA 表達水平顯著下調，細胞死亡率高達 80%，表明化合物5可以通過抑制 MGMT 的表達從而降低膠質瘤細胞對TMZ的耐藥性[67]。0.4 μmol/L化合物5與TMZ聯合處理膠質瘤U251和U87MG細胞，能增加TMZ對膠質瘤細胞的毒性，使膠質瘤細胞對TMZ敏感[60]。化合物5還能抑制TMZ耐藥膠質瘤細胞SHG44R和U87R增殖和遷移[52]。化合物6也能誘導耐TMZ膠質瘤SHG44R細胞凋亡，抑制細胞生長增殖[28]。

6 討論

重樓在中國分布廣泛，具有悠久的藥用歷史。在民間重樓被用作抗癌藥物，包含重樓的中成藥如樓蓮膠囊和金復康口服液常用于癌癥的輔助治療，以提高療效和減少副作用[68-69]。藥理研究表明重樓具有多種活性，其主要的活性成分為重樓皂苷。近年來，重樓皂苷的抗腫瘤作用廣受關注，但目前對重樓皂苷抗膠質瘤作用及機制的研究相對較少，尚無相關總結。本文對重樓皂苷抗膠質瘤的作用及機制進行綜述，總結其抗膠質瘤的作用機制主要包括：(1)誘導膠質瘤細胞程序性死亡(如凋亡、焦亡和壞死等)； (2)抑制膠質瘤細胞增殖及誘導細胞周期阻滯；(3)誘導膠質瘤細胞自噬；(4)抑制膠質瘤細胞遷移侵襲；(5)聯合用藥逆轉膠質瘤細胞耐藥性，增加膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性。已發現的具有抗膠質瘤活性的單體包括重樓皂苷I(D)、Ⅱ、Ⅲ(薯蕷皂苷)、Ⅵ、Ⅶ和H等。這些作用機制的研究涵蓋了膠質瘤細胞惡性生物學行為的多個方面和臨床治療中的難點，也再次證實了中藥通過多靶點和多通路發揮抗腫瘤作用的特性。這些研究不僅初步揭示了重樓皂苷抗膠質瘤的化學成分、相關蛋白與信號通路，并將相關蛋白或信號通路與重樓皂苷中的單體化合物對應起來，有助于深入認識重樓皂苷發揮抗膠質瘤活性的構效關系。

目前對重樓皂苷抗膠質瘤的研究尚較為粗淺，對活性皂苷大多僅檢測了細胞表型(見表2)，對其作用機制的研究也主要是通過Western blot等方法測定了細胞表型中的相關蛋白，未通過基因表達譜芯片等技術對其抗膠質瘤過程中的功能基因進行全面探討。目前，從重樓屬植物中已發現了數以百計的甾體皂苷成分，但開展過抗膠質瘤活性篩選的皂苷屈指可數，所發現的7種抗膠質瘤皂苷缺乏結構多樣性，導致構效關系尚無法明確。此外，由于皂苷本身具有溶血特性和注射毒副反應，導致多數實驗研究止步于細胞水平。今后，應對已發現的重樓皂苷進行抗膠質瘤活性普篩，在結構多樣性的基礎上闡明其全面的藥理活性和具體作用途徑，進而建立系統的重樓皂苷抗膠質瘤的構效關系結論。同時，可通過嘗試不同劑型和給藥方式如間質化療[70]等來規避重樓皂苷的溶血毒副反應。綜上所述，要將重樓皂苷開發為抗膠質瘤新藥并指導臨床應用，需進一步加大對重樓皂苷抗膠質瘤作用及機制研究的深度和廣度。