鹽酸多西環素片在豬體內的殘留消除規律研究

趙富華，陸連壽，劉自揚，李 萌，李思奇，郭桂芳，吳琴堯 ，曹玉穎， 邱基程，李淑媛，張 璐，龔曉會， 郭燕熒，張希墨*，曹興元*

(1 中國獸醫藥品監察所，北京 100081； 2 中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3 國家獸藥殘留基準實驗室，北京 100193)

多西環素為第二代半合成的四環素衍生物，為廣譜、高效抗生素，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、螺旋體、立克次體、支原體、衣原體等均有抑制作用[1]。鹽酸多西環素的組織穿透力強、體內分布廣和生物利用度高[2]，與同類產品比較，它有價格便宜，胃腸道副作用小，靜脈給藥不會造成靜脈炎等優點，已被廣泛用于獸醫臨床。農業農村部、國家衛生健康委員會和國家市場監督管理總局聯合發布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)，多西環素在豬組織中的最高殘留限量(MRL)：肌肉100 μg/kg、肝300 μg/kg、腎600 μg/kg、皮+脂肪300 μg/kg[3]。同時，農業部《獸藥停藥期規定》規定了鹽酸多西環素片的休藥期為28日，但未明確動物的類型[4]。本試驗的主要目的在于研究口服給予鹽酸多西環素片后，多西環素在豬組織中的殘留消除規律，并計算出休藥期，為鹽酸多西環素片在臨床應用提供科學的依據，保障動物性食品安全和人民健康。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 鹽酸多西環素片：10 mg/片，批準文號為獸藥字030462604，河北遠征禾木藥業有限公司提供。多西環素對照品：含量≥98.7%，批號為20104，購自德國Dr. Ehrensorfer公司；Oasis HLB固相萃取柱(HLB柱)：500 mg/6 mL，Waters公司；超純水：由Milli-Q超純水儀制取；乙腈、甲醇色譜純；三氟乙酸、二氯甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、枸櫞酸、磷酸氫二鈉、草酸、硫酸、鎢酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器設備 高效液相色譜儀：Agilent 1260 高效液相色譜串聯紫外檢測器；分析天平，R200D，德國Sartofius公司；天平，MP2002，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；研磨杯，SQ2119 N，上海帥佳電子科技公司；高速冷凍離心機，Centrifuge 5804R，德國Eppendorf公司；多管渦旋混合器，VX-III，北京踏錦科技有限公司；固相萃取裝置：Waters 200606，美國Waters公司；氮吹儀，N-EVAP-112，美國Organomation Associate公司；無油真空泵，F-50，天津市科億隆實驗設備有限公司。

1.3 試驗動物 三元雜交健康豬30頭，去勢雄性豬，3-4月齡，體重約50 kg，由萊西市某豬養殖廠提供。其中對照組5頭，給藥組25頭。

1.4 給藥方案 用EXCEL隨機數字表法對30頭豬進行隨機分組，分為6組，每組5頭，其中1組為不用藥的空白對照組，另外5組豬以口服方式給藥，每頭豬給藥劑量為0.5片/kg。

1.5 標準溶液的制備 標準儲備液(100 μg/mL)：準確稱取適量的多西環素，用甲醇溶解后轉移至100 mL容量瓶，再用甲醇定容。標準工作溶液：根據需要用流動相將多西環素標準儲備液稀釋成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的標準工作溶液。

1.6 組織采集 最后一次給藥后分別在12 h、1 d、3 d、6 d和8 d，隨機抽取5頭豬進行屠宰，快速取其肌肉、脂肪、肝臟和腎臟等組織(每種組織樣品均250 g)，用濾紙吸取臟器表面血液。所取樣本做好標記、包裝，于-20 ℃保存。未用藥豬在12 h后屠宰，采用上述方法采集相同組織作為空白對照。

1.7 樣品前處理

1.7.1 提取 脂肪：稱取均質試料1±0.01 g于10 mL離心管中，加ACN： H2O=1:9的溶液2 mL，渦旋混勻1 min，40 ℃超聲5 min，4 ℃下12000 rpm高速離心10 min，取上清液于另一離心管。將殘渣重復上述步驟重復提取一次，合并兩次上清液，-80 ℃冷凍除脂5 min，4 ℃下12000 rpm離心5 min，取上清液，直接過濾膜，上機檢測。

肌肉、肝臟：稱取均質試料5±0.05 g于50 mL離心管中，加 EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液5 mL、7%鎢酸鈉溶液5 mL，渦旋1 min，4 ℃下8500 rpm離心5 min，取上清液。殘渣用EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20 mL、10 mL重復提取，合并三次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

腎臟：稱取均質試料2±0.02 g，于50 mL離心管中，加 EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液2 mL、7%鎢酸鈉溶液2 mL，渦旋1 min，4 ℃下8500 rpm離心5 min，取上清液。殘渣用EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL、10 mL重復提取，合并三次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

1.7.2 凈化 HLB柱依次用甲醇5 mL、水5 mL和EDTA· 2 Na-Mcllvaine緩沖溶液5 mL活化，取備用液過柱，待備用液全部流出后，依次用水、5%甲醇溶液各10 mL淋洗，抽干30 s，用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液于刻度試管中，于40 ℃水浴氮氣吹至0.5～1.0 mL，用0.01 mol/L草酸溶液定容至2.0 mL，過濾，供高效液相色譜測定。

1.8 色譜條件 色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)；流動相：A：0.01 mol/L三氟乙酸溶液，B：乙腈；梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm；進樣量：50 μL。見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution program

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 線性與范圍 精密量取濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的標準液各50 μL，供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。其線性方程為Y=0.044x-0.414，R2=0.999，多西環素在50 μg/mL～5000 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.2 檢測線與定量限 取6個空白組織樣品，按照上述樣品前處理的方法處理，測得基線噪音值，按照信噪比(S/N) = 3 為檢測限(LOD)，S/N=10 為定量限(LOQ)。本方法在豬的肌肉組織中檢測限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg；在豬的肝臟組織、腎臟組織、皮+脂肪的檢測限為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg。

2.1.3 準確度與精密度 在空白組織中添加多西環素標準工作溶液，使肌肉組織中的濃度為50 μg/kg，100 μg/kg，200 μg/kg時，腎臟組織中的多西環素濃度為100 μg/kg，600 μg/kg，1200 μg/kg時，肝臟組織和脂肪組織中濃度為100 μg/kg，300 μg/kg，600 μg/kg時，平均回收率在60.32%～116.80%之間，批內、批間變異系數均小于15%，表明該方法符合組織中藥物分析的準確度和精密度要求，見表2。鹽酸多西環素標準溶液在1.8色譜條件下，待測藥物鹽酸多西環素在圖譜中能夠呈現較好的峰形，并與其他雜質峰達到良好的分離效果，詳見圖1。

表2 多西環素在豬肌肉和腎臟中的回收率及變異系數Tab 2 Recovery and coefficient of variation of doxycycline in pig muscle and kidney

圖1 鹽酸多西環素標準溶液色譜圖(100 ng/mL)(a)、空白肌肉組織色譜圖(b)、空白肌肉組織添加100 ng/mL色譜圖(c)Fig 1 Chromatography of doxycycline hydrochloride standard solution (100 ng/mL)(a)、Chromatography of blank muscle tissue (b)、Chromatography of blank muscle with 100 ng/mL(c)

2.2 藥物殘留的測定 每個采樣時間的每個組織的多西環素殘留量如表3所示。

表3 豬組織樣品中多西環素在各組織中的殘留量Tab 3 Residues of doxycycline in tissues after administration

續表

2.3 休藥期計算 使用WT 1.4軟件按95%置信區間計算鹽酸多西環素在豬肌肉、肝臟和腎臟組織中的休藥期分別為2.4日、6.5日、3.5日，見圖2-圖4。

圖2 鹽酸多西環素片在豬肌肉中休藥期計算圖Fig 2 Calculation chart of drug withdrawal period of doxycycline hydrochloride tablets in pig muscle

圖3 鹽酸多西環素片在豬肝臟中休藥期計算圖Fig 3 Calculation chart of drug withdrawal period ofdoxycycline hydrochloride tablets in pig liver

圖4 鹽酸多西環素片在豬腎臟中休藥期計算圖Fig 4 Calculation chart of drug withdrawal period of doxycycline hydrochloride tablets in pig kidney

3 討論與結論

我國動物性食品生產量居世界前列，但質量與世界先進水平相比還存在差距，獸藥殘留超標是其中之一。因此在嚴格規范獸藥使用原則的前提下，還要加強動物性食品中獸藥殘留檢測技術及方法的研究。目前，抗生素已被廣泛用于預防或治療牲畜傳染病[5]，加大對抗生素及其代謝物檢測研究力度，有助于積累其對環境持久性和生態毒性的科學證據[6-7]，為獸藥使用安全、食品安全與人民健康提供保障。

目前，已有研究報道了鹽酸多西環素在動物體內的殘留消除規律，楊秋實[8]以10 mg/kg體重劑量給豬頸部肌肉注射鹽酸多西環素，隔天再次注射，發現組織中多西環素殘留由高到低順序為：腎臟>肝臟>肌肉>皮+脂肪；黃聚杰[9]以20 mg/kg的劑量給花鱸口服鹽酸多西環素，發現組織中多西環素殘留由高到低順序為：血漿>腎臟>肝臟>肌肉；翟克影[10]等人給豬單次灌服5 mg/kg體重劑量連續給藥4日，發現組織中多西環素殘留由高到低順序為：腎臟>肝臟>肌肉>皮+脂肪；王金花[11]等人以2.5 mg/kg單劑量肌肉注射豬，發現組織中多西環素殘留由高到低的順序為：腎臟>皮+脂肪>肌肉>肝臟；本次試驗結果與上述試驗結果基本一致，給藥后殘留濃度順序依次為：腎臟>肝臟>肌肉>脂肪。

此外，有研究報道了不同劑型的鹽酸多西環素在豬體內的休藥期，黃耀凌[12]等人的試驗中，自制鹽酸多西環素注射液以10 mg/kg體重劑量對豬肌內注射給藥，連續給藥3日，建議休藥期為42日，休藥期較長；李媚[13]等人以10 mg/kg體重劑量于試驗豬頸部肌內注射長效鹽酸多西環素注射液，給藥2次，給藥間隔時間為48 h，建議休藥期為28日；劉欣[1]等人以10 mg/kg體重劑量服用鹽酸多西環素顆粒后，連續給藥5日，建議休藥期為12日。本文采用HPLC-VWD方法檢測了豬按照5 mg/kg體重劑量口服鹽酸多西環素片后在不同時間點各組織中多西環素的殘留量，使用WT 1.4軟件按95%置信區間計算出鹽酸多西環素片的休藥期為7日。上述試驗中的休藥期均比本試驗的休藥期長，但是殘留結果與本試驗結果基本相似，其原因可能與劑型和給藥方式不同有關，鹽酸多西環素在豬體內主要通過肝臟和腎臟進行代謝，且消除速度較慢，不同劑型和給藥方式對其影響明顯。

綜上所述，建議鹽酸多西環素片在豬體內的休藥期為7日。