白果內酯標準樣品的研制

付瑞明，胡金春，孟兆青，李強，曹桂云，王岱杰，閆慧嬌*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省分析測試中心 山東省大型精密儀器分析應用技術重點實驗室， 山東 濟南 250014；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000)

標準樣品作為均勻的、確定了特性值的材料或物質[1]，在儀器校準、分析檢測和質量控制中必不可少。隨著中醫藥的國際化，其生產及科研工作中都急需與ISO對接的標準樣品，而我國研發的中藥標準樣品難以滿足相關行業的發展需要[2]，研制具備量值傳遞功能且可溯源的有證國家標準樣品具有重要的現實意義。

銀杏是原產于我國的重要經濟樹種，銀杏葉已收錄于《中國藥典》2015年版一部[3]，是出口創匯的重要中藥品種，富含大量的次生代謝產物，其中最具藥用活性的成分是銀杏類黃酮與萜內酯[4]。銀杏葉提取物已經成為制藥、保健品和化妝品行業最受歡迎的成分之一，銀杏葉制劑在國內外市場供不應求，年銷售總額達100億美元，是全球領先的植物藥品種[5]。

白果內酯(bilobalide)是一類具有特殊結構的倍半萜內酯類化合物[6-9](圖1)，是銀杏葉中的主要活性成分，也是控制銀杏葉藥材質量和成藥標準的重要指標[10-12]。白果內酯是用于治療神經、腦和脊髓等相關疾病的藥物[13-15]，對銀杏葉制劑的療效和產品質量控制起著關鍵的作用。目前市場上白果內酯純品主要為對照品，尚缺乏具備溯源性的國家標準樣品。因此，本研究建立了銀杏葉中分離純化白果內酯的方法，根據GB/T15000.3—2008/ISO Guide 35:2006[16]研制了白果內酯國家標準樣品，為銀杏葉藥材及相關制劑等產品的分析檢測及質量控制提供實物標準支撐。

圖1 白果內酯的化學結構式Fig.1 Chemical structure of bilobalide

1 材料

1.1 藥材與試劑

銀杏葉(銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉)(濟南建聯中藥店)；色譜純甲醇、乙腈(山東禹王試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)，600 MHz核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)，6520 Q-TOF液質聯用儀(美國安捷倫公司)，R-3旋轉蒸發儀(瑞士布奇公司)，10N冷凍干燥儀(寧波新芝有限公司)。

2 方法與結果

2.1 白果內酯單體的制備

圖2 白果內酯的制備液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of bilobalide purified using preparative LC

2.2 純度分析

分別采用高效液相色譜(high performance liguid chromatography,HPLC)、薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)、液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、熱重(thermogravimetric,TG)分析技術進行樣品純度分析。

2.2.1 HPLC法

圖3 白果內酯的等度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC Chromatogram of bilobalide by equivalent elution

圖4 白果內酯的梯度洗脫HPLC圖譜Fig.4 HPLC Chromatogram of bilobalide by gradient elution

2.2.2 TLC法

2.2.3 LC-MS法

色譜柱Navo-micro C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫0～30 min，10%～100%A；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；時間30 min。MS條件：電噴霧離子源ESI，毛細管電壓4.0 kV，載氣普氮流速10 L/min，溫度300 ℃，掃描范圍為m/z=100～1000。從樣品總離子流圖(圖5～6)中未發現明顯雜質峰存在。

圖5 白果內酯正離子模式下總離子流圖Fig.5 Chromatogram of the total ion flow of bilobalide in the cation mode

圖6 白果內酯負離子模式下總離子流圖Fig.6 Chromatogram of the total ion flow of bilobalide in the anion mode

2.2.4 TG分析

初溫30 ℃，以10 ℃/min的速率升溫，至最終溫度600 ℃，氣體N2；流量 100 mL/min。從TG分析圖譜(圖7)可以看出，TG曲線在28.1～280.9 ℃范圍內為水平線，該溫度范圍內穩定性良好，316.7 ℃之后開始分解。多種方式的聯合檢驗可判斷出樣品純度高，雜質含量較少。

圖7 白果內酯的TG曲線Fig.7 The TG curve of bilobalide

2.3 結構表征

表1 白果內酯的核磁共振氫譜數據Table 1 1H-NMR data of bilobalide

表2 白果內酯的核磁共振碳譜數據Table 2 13C-NMR data of bilobalide

續表2

2.4 均勻性檢驗

依據GB/T 15000.3—2008 第7章工作導則[16]要求，均勻性檢驗在相對獨立和潔凈空間進行分裝，隨機抽取10瓶，分別從每瓶中取樣至4 mL棕色瓶，每份樣品1.0 mg溶于1.0 mL色譜純的甲醇，HPLC分析，以峰面積計算樣品的純度值，樣品純度總平均值為99.86%。以F檢驗確定白果內酯標準樣品的均勻性數據是否符合正態分布，分析樣品的瓶間均勻性和瓶內均勻性(圖8)。

圖8 均勻性檢驗結果Fig. 8 Measurement data of the homogeneity test

從均勻性檢驗的方差分析(表3)可見，瓶間自由度為9，瓶內自由度為20，經查表得F0.05(9，20)=2.94，由于F=SM瓶間/SM瓶內=1.25

表3 均勻性檢驗方差分析Table 3 Variance analysis of the homogeneity test

2.5 穩定性檢驗

樣品分裝后于2～8 ℃保存。選擇兩年實驗周期，對制備的白果內酯標準品取樣進行HPLC分析，每份樣品重復測定5次，統計分析采用t檢驗法[16]。隨著時間的延長，24個月內檢測值未見顯著升高或降低，以直線為經驗模型觀察斜率值，預測穩定性變化，結果顯示變化不顯著，未觀測到明顯的不穩定性，即本樣品在兩年內的長期穩定性良好。穩定性檢驗結果見圖9。

圖9 穩定性檢驗結果Fig.9 Measurement data of the stability test

2.6 定值檢測

按照GB/T15000.3—2008標準要求，采用8個實驗室協作實驗定值，共隨機抽取24瓶樣品，平均寄送至8家實驗室，每份樣品重復檢測2次，通過峰面積歸一化法讀取純度[16, 19]。白果內酯純度定值結果見圖10，樣品純度總平均值，即協作實驗室測定的白果內酯標準值為99.88%。

圖10 協作定值數據Fig.10 Data of collaborative certification

標準樣品的定值結果為標準值99.88%，代入數據計算得白果內酯標準樣品的最終不確定度為0.22%。

3 結論

本文建立了一種銀杏葉中白果內酯單體的分離制備方法，具有制備成本低及效率高的特點，可以實現較大量地從銀杏葉中分離制備出高純度白果內酯單體成分。基于該技術并經8家實驗室協作定值，成功研制出標準值為99.88%的白果內酯國家標準樣品，95%置信區間的不確定度為0.22%，樣品均勻性符合國家標準，2～8 ℃條件下24個月內的長期穩定性良好，順利通過專家組驗收。該研究解決了白果內酯及相關產品缺乏國家標準樣品的問題，為我國銀杏葉藥材及相關制品的生產質量控制及分析檢測提供了物質基礎。