多重基因甲基化分析在宮頸癌診斷中的應用研究

王娟娟，榮婷婷，鄭英霞，朱威南，沈立松

上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092

宮頸癌是一種可預防、可治愈的疾病，卻也是全球女性中發病率和病死率均排名第4位的癌癥[1]。據GLOBOCAN 2020年的數據，全球宮頸癌每年新發病例近60萬例，病死病例約34.2萬例[2]。早期發現的宮頸癌患者其5年生存率為92%，而宮頸癌篩查成為提高早診率、降低病死率的主要途徑。巴氏涂片法是最早用于宮頸癌篩查的檢測方法，但靈敏度低，容易發生漏檢[3]。液基細胞學雖然提高了細胞學檢查的準確性，但靈敏度和特異度與傳統的細胞學檢查方法沒有明顯差異[4]。人乳頭瘤病毒(HPV)檢測具有很高的靈敏度和陰性預測值[5]，但不足以提供準確的預測，因為并非所有HPV亞型感染都將導致子宮頸癌的發生[6]。本研究針對CADM1、C13ORF18、PCDHA4和TERT 4種基因，收集不同病變類型的宮頸脫落細胞標本，檢測每個基因的甲基化水平，研究其單項或聯合檢測與宮頸癌發生、發展的聯系，并結合高危HPV檢測及病理結果，綜合分析它們在識別宮頸癌及癌前病變中存在的價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年9月至2020年8月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院婦科就診的101例女性患者的宮頸脫落細胞，其中低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)51例作為LSIL組，高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)28例作為HSIL組，宮頸癌22例作為宮頸癌組，101例患者均在陰道鏡下活檢獲得組織標本進行病理學確診。其中有76例患者進行TCT檢查。同時，采集20例健康女性的宮頸脫落細胞作為對照組。本研究經本院倫理委員會批準，所有入組研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器和試劑檢測均嚴格按說明書進行操作。SLAN-96S實時定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司)、Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(Eppendorf公司)、GL-1800恒溫金屬浴(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、電泳儀(上海天能科技有限公司)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000(賽默飛世爾科技公司)。核酸提取試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、HPV高危亞型檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、PCR檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、M.SssI酶(NEB公司)、核酸提取或純化試劑(蘇州海苗生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1宮頸脫落細胞的基因組DNA提取 采用Autrax全自動核酸提取工作站提取宮頸脫落細胞中的人基因組DNA和HPV DNA，提取的DNA使用NanoDrop 2000進行測量，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2MSP甲基化引物設計 利用MethPrimer、NCBI primer-blast等網站進行5個基因甲基化和非甲基化引物的設計(ACTB為內參基因，具體序列見表1)，并將引物送出合成。

表1 9對基因引物序列表

續表1 9對基因引物序列表

1.3.3HPV DNA的檢測 采用HPV高危亞型檢測試劑盒對脫落細胞基因組DNA進行HPV16/18的PCR檢測。

1.3.4陽性對照制作 提取對照組外周血白細胞的基因組DNA，采用M.SssI酶處理后作為甲基化引物的陽性對照待用。

1.3.5重亞硫酸鹽修飾 采用核酸提取或純化試劑對提取的人脫落細胞基因組DNA和M.SssI酶處理后的陽性對照DNA進行重亞硫酸氫鹽處理并純化，按試劑盒說明書操作。目的是將DNA中的非甲基化C轉化為U，然后通過PCR擴增轉化為T。

1.3.6配制PCR反應混合液 按照廠家(上海之江生物科技股份有限公司)說明書配制PCR反應混合液，將重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA加入混合液，上機進行PCR擴增，擴增條件如下：95 ℃，15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環；72 ℃，10 min。

1.3.7瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度3%，電壓120 V。

2 結 果

2.1各組一般資料比較 121例女性的年齡(46.91±13.89)歲，其中對照組(44.00±12.85)歲，LSIL組(45.69±13.37)歲，HSIL組(44.93±15.01)歲，宮頸癌組(54.91±12.40)歲。宮頸癌組≥55歲人數比例高于對照組、LSIL組和HSIL組(P<0.01)。對照組和不同病變程度的宮頸病變組中，HPV16/18的陽性率隨著病變程度增加呈上升趨勢(P<0.01)。76例患者的TCT檢查結果見表2。

表2 各組一般資料情況(n)

2.2瓊脂糖凝膠電泳結果 4對甲基化引物、4對非甲基化引物及1對人基因組內參引物的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后確認目的基因長度，見圖1，并送上海生工進行克隆測序，確定目的基因序列。

2.34組間4種基因的甲基化水平差異分析 CADM1和PCDHA4基因的甲基化陽性率在LSIL組、HSIL組、宮頸癌組和對照組4組間的差異無統計學意義(P>0.05)，C13ORF18和TERT基因的甲基化陽性率在4組間的差異均有統計學意義(P<0.01)。CADM1基因的甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL+宮頸癌組3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；PCDHA4基因的甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL+宮頸癌組3組間隨著病變程度增加而升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4種基因在不同宮頸病變患者及對照組中的甲基化陽性情況

2.4C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項或聯合檢測時對于宮頸癌的診斷效能 C13ORF18基因甲基化檢測與HPV16/18二者聯合檢測，以及C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18三者聯合檢測時，特異度均為96.97%，但三者聯合檢測具有更高的陽性預測值(75.00%)。TERT基因甲基化單項檢測靈敏度和陰性預測值均最高，分別為86.36%、94.74%。見表4。

表4 不同檢測方法對宮頸癌的診斷效能(%)

2.5C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項或聯合檢測在TCT檢查結果為不能明確意義的不典型鱗狀細胞(ASCUS)患者中區分高級別及以上病變的診斷效能 當TCT檢查結果為正常或ASCUS時，HPV16/18檢測篩查高級別級以上病變的檢測靈敏度最好(分別為100.00%和71.43%)，且具有較好的陰性預測值。C13ORF18基因甲基化檢測具有較好的特異度，均高達100.00%，且具有較好的陽性預測值。HPV16/18與C13ORF18基因甲基化聯合檢測的靈敏度低于HPV16/18單項檢測，同時與C13ORF18基因甲基化單項檢測比較，雖特異度一致，但靈敏度沒有提高，甚至在ASCUS的TCT結果診斷中明顯下降。TERT基因甲基化檢測無論是單項還是聯合HPV16/18檢測,靈敏度均不及HPV16/18單項檢測，特異度也不及C13ORF18基因甲基化單項檢測，見表5、6。

表5 C13ORF18甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項或聯合檢測在正常TCT結果中診斷高級別及以上病變的診斷效能(%)

表6 C13ORF18甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項或聯合檢測在ASCUS的TCT結果中診斷高級別及以上病變的診斷效能(%)

3 討 論

高危HPV亞型的感染是導致宮頸癌發生的主要原因[7]，但是高危HPV亞型感染并不一定能夠促使最終發展為宮頸癌，僅有少部分人HPV持續性感染會發展為子宮頸病變。本研究中宮頸癌組的女性年齡明顯高于對照組、LSIL組和HSIL組，且HPV16/18的陽性率隨著宮頸病變程度的增加而增高，也證實了高危HPV亞型的持續感染在子宮頸癌及癌前病變中的關鍵作用。

目前對于宮頸癌的篩查策略主要采用細胞學檢查或主要的高危HPV亞型檢測，分別側重于檢測異常細胞和是否存在高危HPV亞型感染。傳統宮頸巴氏涂片可以診斷宮頸癌病變，但靈敏度低，假陰性率非常高，容易導致臨床誤診和漏診[8]。TCT檢查提高了細胞學檢查的陽性率，但其受標本采集及制片的影響[9]，本研究中76例患者的TCT檢查結果也證實了細胞學檢查的局限性；而高危HPV亞型篩查不能區分一過性感染和持續性轉化感染，降低了篩查的特異度，這表明需要采取更加客觀的篩查策略。

DNA甲基化是修飾DNA的一種方式，其不改變基因組DNA，僅改變表觀遺傳表現，是細胞維持基因穩定和調節基因表達的主要因素[10]。DNA甲基化主要機制是在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的催化作用下，使胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)5′端C原子與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的活性甲基發生共價結合，形成DNA的甲基化修飾。CpG島中的大多數CpG在正常細胞中通常未甲基化，CpG的超甲基化是在腫瘤細胞中經常觀察到的變化之一，這可能導致腫瘤抑制基因沉默[11]。因此，基因甲基化可能是宮頸癌診斷的潛在生物標志物。目前在宮頸組織中已檢測出超過 100 種基因甲基化標志物[12]，趙娟等[13]研究發現，宮頸癌和癌旁組織中的 SALL3 基因啟動子區甲基化水平明顯高于正常宮頸組織。盡管如此，病理組織標本取樣煩瑣，并不適用于一般人群篩查。有報道顯示，宮頸脫落細胞基因甲基化檢測可應用于宮頸癌早期篩查，并可能成為更加靈敏、特異的手段[14]。近年來國內也有許多關于宮頸脫落細胞如PAX1[15]、FAM19A4[16]等基因甲基化的研究，結果也提示了宮頸脫落細胞基因甲基化的檢測在宮頸癌及癌前病變篩查中具有一定臨床應用價值。

CADM1，又稱肺癌腫瘤抑制因子1(TSLCl)，主要發揮維持細胞間黏附穩定及細胞骨架構建的功能。在許多實體瘤(如胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、食道癌和宮頸癌)中，CADM1經常被啟動子高甲基化滅活[17]，有研究發現，CADMl與MAL基因甲基化異常與高級別宮頸病變更高的陽性率相關[18]。C13ORF18為13號染色體開放閱讀框18，C13ORF18的啟動子甲基化會導致細胞周期的破壞，可能是宮頸癌發生的早期事件[19]。原鈣黏蛋白(PCDH)是細胞黏附分子超家族中最大的一員，分為α、β、和γPCDH基因簇(根據人類基因組組織命名法分別對應PCDHA@、PCDHB@和PCDHG@)，在5q31號染色體上串聯分布，PCDHA4是PCDHA@中的一種。有研究顯示，與HPV檢測相比，對于宮頸上皮內瘤變2級病變的早期檢測，PCDHA4的甲基化檢測具有相同的靈敏度，但特異度更高[20]。TERT是細胞內一種與癌變密切相關的反轉錄酶，其基因啟動子區異常甲基化已被證實存在于包括宮頸癌[21]在內的多種腫瘤組織中。

GUSTAFSON等[22]對液基細胞學標本中15種基因甲基化進行研究，結果顯示，CADMl基因甲基化檢測是區分高級病變與正常及低級別病變最好的標志物。VAN BAARS等[23]的研究也顯示了相似的結果，CADM1基因甲基化隨著病變嚴重程度的增加而增加，并且是病變特異性的標志物。而本研究結果表明，CADMl基因甲基化陽性率在4組間差異無統計學意義(P>0.05)，并在低級別和高級別及以上病變之間差異無統計學意義(P>0.05)，這可能是由研究人群的種族、地域差異造成的。

WANG等[20]的研究顯示，正常對照、癌前病變(CIN)1級、CIN2/3級和子宮頸癌中PCDHA4基因甲基化陽性率隨著病變程度增加明顯增高，而本研究中該基因甲基化陽性率在4組間差異無統計學意義(P>0.05)，可能原因為本研究宮頸癌患者例數太少。然而，該基因甲基化陽性率在對照組、LSIL組和HSIL+宮頸癌組3組間差異有統計學意義(P<0.05)，說明PCDHA4基因的甲基化檢測有助于區分低級別和高級別及以上的病變。

YANG等[24]等的研究顯示，對于區分正常和CIN2級及以上的病變，C13ORF18基因甲基化是良好的檢測標志物。也有試驗證實，宮頸刮片中的C13ORF18啟動子甲基化與高級別病變密切相關[25]。本研究結果顯示，對照組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌4組間的C13ORF18基因甲基化陽性率隨著病變程度的加深而明顯增高(P<0.01)，且C13ORF18基因甲基化單項檢測用于診斷宮頸癌，顯示出了較好的特異度(93.94%)，并優于HPV16/18(75.76%)和TERT基因甲基化(54.55%)單項檢測。

EIJSINK等[26]的研究顯示，TERT基因甲基化陽性率在正常、CIN1、CIN2、CIN3和宮頸癌的冰凍宮頸組織中分別為8%、16%、14%、51%、90%，而本研究中該基因在宮頸脫落細胞中也有相似的結果，該基因甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌組中隨著病變程度增加而增加(P<0.05)，TERT基因甲基化單項檢測用于診斷宮頸癌的靈敏度為86.36%，高于C13ORF18基因甲基化(59.09%)和HPV16/18(68.18%)單項檢測，但特異度比C13ORF18基因甲基化和HPV16/18單項檢測低。

對C13ORF18基因甲基化、TERT基因甲基化聯合HPV16/18檢測診斷宮頸癌的綜合分析結果顯示，C13OFR18基因甲基化檢測聯合HPV16/18檢測可以略微提高檢測特異度(從93.94%提升至96.97%)，但是靈敏度大大降低(從59.09%降至45.45%)；TERT基因甲基化檢測聯合HPV16/18檢測可以提高特異度至85.86%，但不及C13ORF18基因甲基化單項檢測的特異度高，且靈敏度較低；三者聯合檢測特異度與C13OFR18基因甲基化檢測聯合HPV16/18檢測的特異度相同，但檢測靈敏度較低。

此外，本研究結果顯示，HPV16/18檢測和C13ORF18基因甲基化檢測可能有助于對于細胞學檢查后進一步進行危險分層。對于正常或ASCUS的TCT檢查結果，HPV16/18檢測對于區分宮頸高級別及以上病變具有很高的靈敏度(分別為100.00%和71.43%)，而C13ORF18基因甲基化檢測的特異度均高達100.00%。

綜上所述，宮頸脫落細胞CADM1、PCDHA4、TERT和C13ORF18這4種基因中，TERT基因和C13ORF18基因甲基化單項檢測在宮頸癌及癌前病變的篩查中體現了較好的臨床價值，但是聯合HPV16/18的篩查并不能明顯提高診斷性能。HPV16/18檢測和C13ORF18基因甲基化檢測對于細胞學檢查后進一步進行危險分層具有一定的臨床意義。本研究樣本量尤其是宮頸癌患者病例較少，宮頸癌標本臨床資料不夠全面，未來可擴大研究人群，補充臨床資料，并結合更多的基因進一步研究。