呼吸道感染常見細菌分泌MPT64蛋白或其抗原類似物情況分析

徐杰平 劉雪玲 黃土星 陳龍輝 李秀群 杜青林

1清遠市清新區人民醫院檢驗科，清遠 511800；2清遠市清新區人民醫院呼吸內科，清遠 511800

結核病侵擾人類至少有7 000余年的歷史，雖然人們在結核病控制中已經取得了非常重大的成就，但迄今為止結核病仍為全球重大公共衛生問題；而且其病原學確證率，包括最先進的分子檢測結果在內，一直都在60%以下［1］。因此，探討準確、早期、快速、簡便、經濟的結核病試驗診斷方法一直為人們所關注。結核分枝桿菌特異性分泌蛋白MPT64不僅能準確鑒定結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，而且易于在大多數結核病患者樣本中檢測到，被認為是一種應用前景廣闊的免疫學診斷標志物，對其檢測方法學的研究也正層出不窮［2-3］。但是，劉少娟等［4］報道25株金黃色葡萄球菌增菌液MPT64檢測全部陽性，而孟繁榮等［5］則報道檢測痰液MPT64對肺結核診斷的特異度僅為69.44%，如此低的特異度是否來源于呼吸道其他感染病的干擾？我們的前期研究結果表明，一些肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性［6］。為確證試驗結果，我們借鑒支持向量機（support vector machine，SVM）監督機器學習方法原理，在前期研究的基礎上增加樣本量進一步進行深入分析，現報道如下。

資料與方法

1、一般資料

1.1、細菌標準參考株 共7株，包括ATCC25923金黃色葡萄球菌、ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC35218大腸埃希菌、ATCC29212糞腸球菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC1766嗜麥芽窄食單胞菌，由廣州市胸科醫院惠贈。

1.2、臨床分離株 共80株，為2019年3月至2020年12月間清新區人民醫院呼吸內科、重癥醫學科、康復醫學科、新生兒科、神經內科、冠心病監護病房、心血管內科送檢的合格痰標本培養分離株，包括肺炎克雷伯菌25株、銅綠假單胞菌20株、嗜麥芽窄食單胞菌14株、大腸埃希菌9株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動桿菌3株以及表皮葡萄球菌、奇異變形桿菌、阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌各1株。依細菌分離時間先后將樣本分為訓練集樣本組和測試集樣本組：訓練集樣本組為文獻［6］樣本，包括肺炎克雷伯菌9株、銅綠假單胞菌15株、嗜麥芽窄食單胞菌8株、大腸埃希菌8株、金黃色葡萄球菌5株、鮑曼不動桿菌3株、表皮葡萄球菌以及奇異變形桿菌各1株；測試集樣本組則包括肺炎克雷伯菌16株、銅綠假單胞菌5株、嗜麥芽窄食單胞菌6株和大腸埃希菌、阪崎腸桿菌、陰溝腸桿菌各1株。

2、方法

2.1、細菌分離培養和菌種鑒定 痰標本細菌分離培養采用廣州環凱生物技術有限公司血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板進行，細菌鑒定應用法國梅里埃ATB細菌鑒定系統和API 20E、API 20NE、APISTAPH目測鑒定紙條進行，試驗操作嚴格按儀器與試劑說明書進行。

2.2、菌落生理鹽水沖刷液制備和凍存 選取3～4處細菌生長旺盛區，每次選擇一處用滅菌生理鹽水約0.3 ml輕輕沖洗菌落，浸潤3～5 min，吸入1支凍存管，如此反復3～4次，-20℃凍存細菌菌落沖洗液3～4管。標準參考菌株復蘇培養及菌落生理鹽水沖洗液制備均委托廣州市胸科醫院檢驗科實驗室進行。

2.3、MPT64檢測 在冰箱中取出-20℃凍存的細菌菌落沖洗液，室溫凍融30 min，37℃水浴約15 min，等完全溶解后應用杭州創新生物檢控技術有限公司生產的凱必利結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒進行MPT64檢測，試驗操作嚴格按試劑說明書進行。其中7株細菌參考菌株菌落沖洗液MPT64檢測委托廣州市胸科醫院肺部疾病研究所實驗室進行；文獻［6］已檢測的陰性和陽性結果樣本不再實施檢測而沿用原來檢測結果，對其1例可疑結果樣本進行重新檢測。

3、數據處理

應用頻數分布分別對訓練集樣本、測試集樣本和全部檢測樣本進行統計學描述，計算其MPT64陽性檢出率（%）。

結 果

1、參考菌株菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測

ATCC29212糞腸球菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性，ATCC25923金黃色葡萄球菌、ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC25922大腸埃希菌、ATCC35218大腸埃希菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC1766嗜麥芽窄食單胞菌等菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結果均陰性。

2、呼吸道感染細菌常見臨床分離株80株細菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測

訓練集樣本組、測試集樣本組、全部樣本細菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測的陽性率分別為26.0%（13/50）、10.0%（3/30）和20.0%（16/80），具體見表1。另外，文獻［6］的訓練集樣本組原1例可疑陽性的樣本，經復核檢測結果為陰性。

表1 呼吸道感染細菌常見臨床分離株80株細菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測結果（株）

討 論

MPT64最先在牛結核分枝桿菌弱毒株BCG的培養濾液中發現（亦稱MPB64），為結核分枝桿菌早期高豐度分泌抗原，迄今為止的研究顯示，在分枝桿菌中，僅結核分枝桿菌復合群分泌MPT64，其他常見的可致病非結核分枝桿菌菌種則不分泌。因此，分枝桿菌培養濾液或菌落洗刷液MPT64檢測已成為區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌兩大菌群的準確、快速、簡便試驗方法［7-8］。由于上述呼吸道感染常見細菌與分枝桿菌分離培養方法完全不同，在分枝桿菌培養物中不會混雜這些細菌，因此本研究所顯示的某些細菌菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性的情形不會對結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌分群鑒定試驗造成任何影響。

然而對于MPT64檢測，人們目前最為關注的當屬其在結核病診斷等領域的應用［9-10］。此時，呼吸道感染常見細菌與結核分枝桿菌分泌物則會同時出現于檢測樣本，本文的研究結果顯示，在80株呼吸道感染細菌常見臨床分離株中，其菌落生理鹽水沖洗液MPT64檢測陽性達20.0%，在肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌中則高達25.0%。這些數據深刻表明應用臨床樣本直接檢測MPT64在結核病診斷中將存在很高的假陽性，如何克服假陽性對結核病診斷的影響值得系統、深入研究。從表1我們還可看到，在訓練集樣本組和測試集樣本組中，肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌等同種細菌其MPT64陽性檢出率大不相同；劉少娟等［4］則報道25株金黃色葡萄球菌增菌液MPT64檢測全部陽性。這些結果提示，呼吸道感染常見細菌是否分泌MPT64或其抗原性類似結構物，同種細菌具有相當大的個體差異性。同種細菌所表現出的巨大個體差異，則大大增加了相關問題研究的難度，但我們必須努力而為之。

至于在這些呼吸道感染常見細菌分泌物MPT64檢測陽性，檢測到的究竟是結核分枝桿菌MPT64分泌蛋白還是其抗原類似物，Chikamatsu等［8］在92種非結核分枝桿菌中均未發現MPT64檢測陽性菌，從細菌種屬關系方向上看，在這些呼吸道感染常見細菌分泌物檢測到的MPT64應為其抗原類似物居多。從MPT64分泌通道看，其主要通過Ⅶ型分泌系統（T7SS）排出菌體［11］，目前人們也發現金黃色葡萄球菌等細菌中有T7SS的存在［12］，而T7SS則對其作用底物有著特定的結構要求［13］，類似于MPT64抗原性類似結構物在這些細菌通過其T7SS分泌則存在相當的可能性。不過這些都是我們對這些科學問題的樸素思考和粗淺推測，其內在機制究竟如何，事關MPT64檢測的價值評估，意義重大，不可等閑視之，亟待深入探索。

綜而觀之，對于應用MPT64檢測進行結核診斷的臨床價值評價，還需要從更為多樣的細菌種類、各類真菌中展開，也需要增大各種細菌的研究樣本量，以全面深入了解其影響因素、影響程度及導致這些影響的內在機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突