茉莉花香氣相關基因JsTPS啟動子的克隆與活性分析

林俊杰 李小婷 陳雪津 崔萌 吉玉婷 葉乃興 陳桂信

摘 ?要：以茉莉（Jasminum sambac）的花苞為材料，采用染色體步移技術，分離出JsTPS基因的5端調控序列，對該啟動子序列進行順式作用元件預測。根據茉莉花TPS基因啟動子的順式作用元件分布，擴增出5個不同片段長度的啟動子，分別命名為JsTPS-1（494 bp）、JsTPS-2（689 bp）、JsTPS-3（1016 bp）、JsTPS-4（1466 bp）和JsTPS-5（2040 bp），應用GATEWAY技術，構建5個不同長度融合GUS基因的植物表達載體，用農桿菌GV3101侵染煙草葉片，對轉化后的煙草葉片進行GUS染色。檢測不同片段長度啟動子活性，找出該啟動子的關鍵活性區域，對其功能進行初步分析，序列分析結果表明：克隆得到的JsTPS啟動子序列長度為2040 bp，該序列包含TATA-box、G-box、CAAT-box等啟動子核心元件、光響應元件（ACE、ATCT-motif、Box 4、3-AF1 binding site、G-Box、Sp1和GT1-motif）和激素響應元件[茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、ABRE脫落酸響應元件、生長素響應元件（TGA-box、TGA-element）、水楊酸響應元件（TCA-element）、赤霉素響應元件（GARE-motif）]等，說明該基因的表達可能受到光照、激素（ABA、生長素、茉莉酸、茉莉酸甲酯和水楊酸）的誘導。GUS染色結果表明：其JsTPS-1啟動子幾乎不染色，JsTPS-2染色相對較弱，而JsTPS-3的染色程度高于JsTPS-4、JsTPS-5，且是5個不同缺失片段中染色最深的片段;GUS酶活性檢測結果顯示，不同缺失片段長度酶活性與染色結果一致，JsTPS-1的GUS酶活性最低，隨著啟動子片段加長，GUS酶活性增強，在片段長度為JsTPS-3時酶活性最強，在JsTPS-4、JsTPS-5片段長度，GUS酶活下降。JsTPS啟動子至少包括–788～0 bp這段區域才能驅動JsTPS起始轉錄，相比較其他片段，發現在–1016～0 bp區域時啟動子的活性表現最強。推測可能在–1016～–689 bp中含有水楊酸響應（TCA-element）、光響應（3-AF1 binding site）等元件增強啟動子的活性，而在–1466～–1016 bp中含有赤霉素負調控響應元件減弱JsTPS啟動子的活性。本研究為進一步開展調控茉莉花香氣釋放研究提供理論基礎。

關鍵詞：茉莉花;萜類合成酶;啟動子;順式作用元件;啟動子活性

中圖分類號：S685.16 ? ? ?文獻標識碼：A

Cloning and Activity Analysis of JsTPS Promoter of Jasminum sambac Aroma Related Gene

LIN Junjie， LI Xiaoting， CHEN Xuejin， CUI Meng， JI Yuting， YE Naixing*， CHEN Guixin*

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Jasmine （Jasminum sambac） bud was used as the material， and the chromosome walking technology was used to isolate the 5 end regulatory sequence of JsTPS， and predict the promoter cis-acting element for this sequence. According to the cis-acting element distribution of the TPS gene promoter in jasmines， 5 promoters with different fragment lengths were amplified， named JsTPS-1 （494 bp） and JsTPS-2 （689 bp） ， JsTPS-3 （1016 bp）， JsTPS-4 （1466 bp） and JsTPS-5 （2040 bp）， then 5 plant expression vectors with different fragment lengths fused with GUS gene by GATEWAY technology were constructed. Tobacco leaves were infected with GV3101 Agrobacterium to perform Gus staining. Sequence analysis showed that the sequence length of the cloned JsTPS promoter was 2040 bp. It contained the core elements of the promoter such as TATA-box， G-box， CAAT-box and light response elements （ACE，ATCT-motif， Box 4， 3-AF1 binding site， G-Box， Sp1 and GT1-motif）， hormone-related response elements such as methyl jasmonate response Element （TGACG-motif， CGTCA-motif）， ABRE abscisic acid response element， auxin response element （TGA-box， TGA-element）， salicylic acid response element （TCA-element）， gibberellin response element （GARE-motif）， etc.， which indicating that the expression of this gene may be induced by light and hormones （ABA， auxin， jasmonic acid， methyl jasmonate and salicylic acid）. The results of GUS staining showed that the JsTPS-1 promoter hardly stained， and the staining of JsTPS-2 was relatively weak. The staining degree of JsTPS-3 was higher than that of JsTPS-4 and JsTPS-5， and it was stained in five deepest deletion fragments. According to the GUS enzyme activity test results， the enzyme activity results of different missing fragment lengthswere consistent with the staining results. The GUS enzyme activity of JsTPS-1 was the lowest. As the promoter fragment lengthened， the GUS enzyme activity increased. When the fragment length was JsTPS-3， the activity was the strongest. The JsTPS promoter must include at least –788 bp to 0 bp to drive initiate transcription. Compared with other fragments， it is found that the promoter activity is the strongest in the region of –1016 bp to 0 bp. It is speculated that –1016 bp to –689 bp may contain salicylic acid response （TCA-element）， light response （3-AF1 binding site） and other elements to enhance promoter activity， while –1466 bp to –1016 bp contains gibberellin negative regulatory response elements to weaken the activity of the JsTPS promoter. The study would provide a theoretical basis for further research on regulating aroma release of jasmine.

Keywords： Jasminum sambac; terpene synthase; promoter; cis-acting elemen; promoter activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.006

茉莉花[Jasminum sambac （L.） Ait.]是木犀科素馨屬的花卉，原產印度，具有較高的經濟價值。茉莉用途廣泛，是一種重要的香料作物，花朵可用于窨制花茶、制作香水和提取精油等。茉莉花萃取香氣的方法有很多，比如PRAGADHEESH等[1]和李麗華等[2]通過固相微萃取（SPME）等方法可萃取茉莉花香氣成分，而在茉莉花當中芳香化合物[3-4]成分中主要有萜烯類化合物、酯類、酸類、醇類和酮類及其他化合物等，其中成分含量最高的是酯類，其次是萜烯類化合物，而α-法尼烯則是萜烯類化合物中含量最多的一類。根據報道，現已發現兩條合成途徑合成萜烯類化合物，其中一條為甲羥戊酸途徑（MEV），生成三萜和倍半萜類化合物如α-法尼烯等;另一條為甲基赤蘚醇磷酸（methylerythritol phosphate， MEP）途徑，合成多種單萜和雙萜化合物[5]。

萜類合成酶（TPS）是MEV途徑的末端酶類，它們都能夠催化FPP和GPP生成萜烯類化合物，在TPS家族中包括了7個亞家族，其中含有一個α-法尼烯合成途徑的分支[6-7]。由于TPS基因家族的多樣性，并且TPS基因是倍半萜和三萜等特類化合物合成最下游的基因，導致了萜類芳香物質的豐富多樣性，在植物芳香物質的合成中起到了重要作用[8]。在植物香氣調控研究中，已經在佛手[9]、臘梅[10]、百合[11]、桂花[12-13]、茶樹[14]中分離出TPS家族基因并對該類基因調控芳香性物質進行了較深入的研究。萜類合成酶不僅在香氣物質合成起到了關鍵作用，這些萜類合成酶通過基因調控參與合成并釋放萜類物質來抵抗外界的脅迫以及病蟲害等，研究中發現，在植物中TPS基因對外界脅迫具有調控作用[15]。前人對茉莉花香氣成分有了大量的研究分析，但對于這些調控基因的功能進行深入驗證的研究比較少。TPS是合成倍半萜α-法尼烯最下游的關鍵酶類，目前只有關于其基因的分析報道，對啟動子方面還未有研究，茉莉花的產香機制還未有透徹的研究。研究TPS基因啟動子在茉莉花香氣中的作用為改良茉莉品質及遺傳提供理論基礎。

本研究以雙瓣茉莉為材料，采用染色體步移技術，分離出JsTPS基因的5端上游調控序列，對該序列進行啟動子進行順式作用元件預測，應用Gateway技術，構建5個不同片段長度的5端調控序列融合GUS基因的植物表達載體，用農桿菌GV3101侵染煙草葉片，建立瞬時表達體系，對轉化的煙草葉片進行GUS染色，檢測不同片段長度5端調控序列的活性，找出該啟動子的關鍵活性區域。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗材料 ?以福建農林大學茉莉花種植資源圃的茉莉花為材料。采摘盛花時期的茉莉花朵用液氮速凍，研磨成粉末狀，–80℃保存備用。gateway載體pDNOR207、pMDC163和本氏煙草種子由本課題組提供。

1.1.2 ?試劑 ?多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京天根）、Genome Walking Kit（TaKaRa）、Mach1-T1、pBM16A-T（北京博邁德）、農桿菌GV3101（北京全式金）、GUS染色試劑盒（北京中科瑞泰）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茉莉花JsTPS基因啟動子的擴增 ?根據JsTPS基因序列，設計3條特異性引物（表1），分別命名為JsTPS-SP1、JsTPS-SP2、JsTPS-SP3。以基因組DNA為模板，參照Genome Walking kit試劑盒染色體步移步驟，連續3輪PCR擴增，擴增產物連接pBM16A-T載體并轉化Mach1-T1感受肽，菌液驗證正確后送至上海尚亞生物技術有限公司測序，將獲得的啟動子序列用PlantCARE軟件進行順式作用元件預測。

1.2.2 ?JsTPS基因啟動子缺失片段載體構建 ?根據JsTPS啟動子順式作用元件預測結果，按順式作用元件位置設計5個不同長度的啟動子5端缺失片段，分別在5端ATG上游494、689、1016、1466、2040 bp處設計特異性引物作為上游引物，分別命名為qJsTPS-F1、qJsTPS-F2、qJsTPS-F3、qJsTPS-F4、qJsTPS-F5，以qJsTPS-R為下游引物（表2），并在引物前加上能與載體特

異性結合的attB接頭引物。將擴增后的產物在BP酶的作用下構建到入門載體pDONR207上，結果正確的再通過LR酶構建到表達載體pMDC163上，將檢測正確的表達載體轉化農桿菌GV3101。

1.2.3 ?農桿菌轉化本氏煙草與GUS染色分析 ?將構建成功的5個不同片段pMDC163-JsTPS表達質粒分別轉化到農桿菌GV3101中，PCR菌液驗證后擴大培養，OD600值為0.8左右，將培養基更換為重懸緩沖液[10 mmol/L MES-KOH（pH 5.6、10 mmol/L MgCl2、150 μmol/L乙酰丁香酮]，調整OD600值為0.8左右，室溫靜置3～5 h后，將其注射到生長4周左右的本氏煙草葉片中，暗培養1 d正常培養1 d后備用。

取侵染后的煙草葉片進行GUS染色，將煙草葉片剪成若干個邊長為0.5 cm的方塊浸沒在GUS染液中，37℃避光培養12 h左右，之后將材料轉入95%無水乙醇中脫色2～3次，至陰性對照材料為白色，且出現的藍色底物不再褪色，在激光共聚焦顯微鏡FV1200下對注射的葉片進行鏡檢。

根據Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書進行煙草葉片的總蛋白提取及濃度測定。根據GUS基因定量檢測試劑盒的方法和熒光分光光度計檢測GUS基因的活性。

2 ?結果與分析

2.1 ?JsTPS啟動子的分離與順式作用元件分析

以茉莉花DNA為模板，通過染色體步移技術和測序確定獲得1條2040 bp的啟動子序列（圖1）。將啟動子序列導入PlantCARE網站后，對其順式作用元件進行預測，部分元件結果顯示（圖2、表3）：該序列含有關鍵啟動子核心元件如TATA-box、G-box、CAAT-box等;其中還主要包含了一些激素和環境相關的響應元件，如：光響應元件（ACE、ATCT-motif、Box 4、3-AF1 binding site、G-Box、Sp1、GT1-motif）、茉莉酸甲酯響應元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、脫落酸響應元件（ABRE）、生長素響應元件（TGA-box、TGA-element）、水楊酸響應元件（TCA-element）、赤霉素響應元件（GARE-motif）、無氧誘導所必需的順式作用調節元件ARE、能與MYB結合的位點CCAAT-box等。根據這些功能元件，可初步推測JsTPS啟動子在茉莉花的生長發育過程中，主要受環境和激素的調控。

2.2 ?JsTPS啟動子缺失片段的擴增

根據JsTPS啟動子順式作用預測結果，設計5個不同缺失啟動子片段，本研究根據JsTPS啟動子的順式作用元件分析預測結果，通過構建5個不同缺失程度的啟動子片段，并進行PCR擴增（圖3），分別命名為：JsTPS-1（494 bp）、JsTPS-2（689 bp）、JsTPS-3（1016 bp）、JsTPS-4（1466 bp）和JsTPS-5（2040 bp）。JsTPS-1保留了部分響應元件如GARE-motif赤霉素響應元件、Box 4光響應元件、CGTCA-motif和TGACG-motif茉莉酸甲酯響應元件、ABRE脫落酸響應元件、TGA- element生長素反應元件等;JsTPS-2中多了2個跟光有關的調控元件（BOX-4和G-box）、1個TGA-box生長素調節元件;JsTPS-3中增加了水楊酸參與調控的響應元件（TCA-element）、光響應元件（3-AF1 binding site）等;啟動子片段JsTPS-4中增加了光反應元件（ACE、ATCT- motif）、赤霉素響應元件（TATC-box）;在JsTPS-5中增加了脫落酸響應元件（ABRE）和光相關調控元件（GT1-motif）。

2.3 ?JsTPS啟動子缺失片段載體的構建

利用Gateway技術，將擴增產物5個缺失目的片段通過BP反應構建到入門載體pDONR207上，在通過LR反應重組置換到pMDC163植物表達載體上，菌液驗證結果如圖4顯示，成功構建5個不同缺失片段的植物表達載體。將其結果分別命名為pMDC163-JsTPS-1、pMDC163-JsTPS-2、pMDC163-JsTPS-3、pMDC163-JsTPS-4、pMDC163- JsTPS-5。

2.4 ?農桿菌的轉化煙草與GUS染色分析

將構建好的載體轉化農桿菌GV3101，并注射煙草，為了研究侵染煙草后該基因啟動子不同缺失片段在表達上的差異，對其進行GUS染色，結果如圖所示（圖5）：在不同啟動子缺失片段的瞬時表達中，煙草葉片呈現不同程度的染色情況。在含有pMDC163-JsTPS-1的煙草葉片中，3個生物重復只有1個葉片有非常微弱的淺藍色斑點，其他葉片則沒有發現染色情況;含pMDC163- JsTPS-2的葉片中，在顯微鏡中能觀察到稀疏分散的藍色斑點，且斑點多數分布在葉脈周圍。而侵染進pMDC163-JsTPS-3基因的煙草葉片用肉眼可直觀地觀察到葉片完全染色，且呈深藍色;而在含有pMDC163-JsTPS-4和pMDC163-JsTPS-5的煙草葉片GUS染色結果顯示，可以觀察到均勻的藍色，但染色程度沒有pMDC163-JsTPS-3的深，只有在葉脈周圍分布深藍色斑點。

在GUS酶活性測定中（圖6）JsTPS-1的GUS酶活最低，隨著啟動子片段加長，GUS酶活性增強，在片段長度為JsTPS-3時酶活性最強，在JsTPS-4、JsTPS-5時，GUS酶活下降。結合順式作用元件預測結果，TATA-box集中在–788～0 bp區域內，而JsTPS-1啟動子片段長度僅483 bp且該啟動子沒有出現轉錄活性，JsTPS-2啟動子只出現微弱的啟動活性，說明TATA-box是JsTPS起始轉錄的必須元件，在JsTPS啟動子中至少要包括–788～0 bp這段區域才能驅動JsTPS起始轉錄。JsTPS-3啟動子（1016 bp）啟動子活性最強，說明在–1016～–689 bp中可能含有增強啟動子活性的關鍵元件，能啟動GUS基因高度表達，并且與其他片段的啟動子有明顯差異。隨著片段變長，JsTPS-4、JsTPS-5啟動子的活性出現下調現象，說明在–1466～–1016 bp中含有負調控元件減弱JsTPS啟動子活性。根據順式作用元件預測結果，水楊酸響應元件（TCA- element）、光響應元件（3-AF1 binding site）可能具有增強JsTPS的啟動子活性的功能。

3 討論

啟動子包含了許多能夠響應基因表達的關鍵調控元件，啟動子的順式作用元件預測對研究基因在植物體內調控表達具有重要作用。為進一步探究啟動子的功能、活性，通常構建啟動子缺失片段植物表達載體，通過在植物上瞬時表達或者穩定遺傳表達，研究該基因啟動子的組織特異性和啟動子活性區域。本試驗通過克隆獲得茉莉花JsTPS啟動子序列，并預測其順式作用元件，通過瞬時表達找出啟動子的活性區域，對其功能進一步分析鑒定。

通過克隆獲得JsTPS 5端上游調控序列，順式作用元件預測結果表明，該基因啟動子序列含有關鍵啟動子核心元件如TATA-box、CAAT-box、G-Box等，還包含了與激素、光相關的響應元件，說明該基因可能受光照條件和激素的影響。在對青蒿[16]的TPS啟動子研究中發現，該植物TPS基因啟動子受茉莉酸和脫落酸的調控。在其他植物中如鐵皮石斛[17]、百合[11]等多數都含有晝夜規律調控的元件，但未在茉莉花JsTPS啟動子中預測到該功能元件，并且JsTPS中也還未預測到跟逆境脅迫相關的順式作用元件。研究發現，激素響應的元件可以間接參與調控植物的脅迫反應， MARIANGELA等[18]通過試驗發現，沉默TPS基因的植物顯示出與對照組有不同組成的揮發物釋放，從而減少蚜蟲吸引力。許多單萜類物質具有抗氧化性也說明了TPS基因可能間斷地參與了植物生長歷程中抗逆脅迫的調控。因此JsTPS可能參與調控茉莉花基因抗逆性和香氣物質產生，是否受各類激素的調控，還需要進一步對JsTPS基因進行功能驗證。

本研究運用JsTPS啟動子順式作用元件的預測分布情況，構建出了5個不同長度啟動子融合植物表達載體，再轉化煙草葉片，讓外源基因JsTPS瞬時表達在植物葉片上。GUS染色和活性檢測結果顯示，插入最短片段的啟動子幾乎沒有出現染色的情況，說明–493～0 bp啟動子片段活性低，之后隨著JsTPS啟動子長度的增長，啟動子活性增強。根據預測的TATA-box元件位置在–782～0 bp之間，研究發現該元件對基因的起始轉錄起到重要作用，可能由于片段JsTPS-1和JsTPS-2沒有包含該核心啟動元件所以顯示出微弱的染色情況，但隨著長度越長，轉錄表達的活性就越來越高。插入外源基因JsTPS-3的植株染色結果表示，肉眼可直觀觀察到該片段啟動子GUS染色顏色比前2個片段顏色深，而TATA-box元件都定位在JsTPS-3內，所以判斷TATA-box是JsTPS基因起始轉錄的關鍵元件之一。結合JsTPS啟動子的GUS基因酶活性檢測結果，與GUS染色的結果一致，在不同片段長度的啟動子中JsTPS-3的酶活表達最高，染色最深，所以判斷JsTPS-3具有強啟動子活性的區域或元件。而在pMDC163- JsTPS-4和pMDC163-JsTPS-5的GUS染色和酶活性檢測中發現，這2個區域的啟動子活性沒有pMDC163-JsTPS-3啟動子活性高，pMDC163- JsTPS-4和全長片段的啟動子GUS活性表達量基本一樣。在刺梨[19]的GGP啟動子研究中發現全長片段比缺失片段的啟動子活性強，推測–1949～ 2089 bp是具有增強啟動活性的區域，第二個缺失片段長度的啟動子表達量出現下調的現象，說明在該區域出現減弱啟動子活性的負調控區域或元件。該研究結果與本研究相似，依此推斷在pMDC163-JsTPS-3到pMDC163-sTPS-4之間的區域，即–1016～–1466 bp片段內含有負調控作用的元件。在構建啟動子缺失片段載體時候JsTPS-3比前2個片段增加了水楊酸參與調控的響應元件（TCA-element）、光響應元件（3-AF1 binding site），該啟動子的啟動活性明顯高于前2個片缺失片段，所以本研究推斷水楊酸響應元件和3-AF1光響應元件可能增強啟動子高表達。隨著片段變長，JsTPS-4、JsTPS-5啟動子的活性出現下調現象，JsTPS-4增加了一個TATC-ox赤霉素響應元件，沒有啟動活性的JsTPS-1也包含了一個TATC-box赤霉素響應元件，說明TATC-box赤霉素響應元件可能抑制JsTPS啟動子活性。

在崔萌等[20]的研究中發現，JsGDS啟動子不同的片段長度、元件缺失或增加都可能導致其在植物不同組織中的表達活性，導致功能性不同。在白樺[21]JMJ18啟動子活性檢測中發現，在瞬時轉化表達的組培苗中不同部位都具有GUS染色情況，證明該基因在植物各組織內都能表達并發揮功能。因此需要對JsTPS啟動子進行組織表達活性試驗，更近一步探究啟動子在茉莉花中的功能。目前研究啟動子組織特異性的方法除了通過穩定遺傳轉化到煙草、擬南芥等模式植物中，有的通過原體組培苗上瞬時表達就可以進行研究，這種方法相比前者周期更短，能夠快速鑒定啟動子的功能活性以及組織特異性。

綜上所述，本研究克隆獲得的JsTPS 5端上游調控序列，順式作用元件預測發現JsTPS基因啟動子含有與多種激素、光相關的響應元件。GUS染色結果與酶活性檢測表明，JsTPS啟動子至少包括–788～0 bp這段區域才能驅動JsTPS起始轉錄，相比較其他片段，發現在–1016～0 bp區域時啟動子的活性表現最強。推測可能在–1016～–689 bp區域內的水楊酸響應（TCA-element）、光響應（3-AF1 binding site）等元件增強啟動子的活性，而在–1466～～1016 bp區域中含有赤霉素負調控響應元件從而減弱JsTPS啟動子的活性。本實驗探究了JsTPS啟動子的基礎功能，但對JsTPS基因啟動子的一些元件是否發揮作用還未進一步確定，所以還需要對植物進行不同處理來研究激素在JsTPS啟動子中的調控作用，以及這些響應元件在JsTPS啟動子的功能。

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