一株多黏類芽胞桿菌 Paenibacillus polymyxa 菌株P1防治廣東菜心根腫病的研究

張瑩瑩 郝文娟 李宏玉 馬艷 毛偉力

摘要

蕓薹根腫病是一種危害極大的世界性病害。對此病害的防治多采用化學藥劑，但過多地使用化學農藥，不僅會導致病原菌的抗藥性和藥劑防效的不穩(wěn)定，還會造成環(huán)境污染和食品安全等問題。篩選生防菌株并將其開發(fā)成有效的生物農藥，是防治根腫病并保持綠色農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新途徑。本研究選用了多種生防菌對蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron.的休眠孢子進行拮抗測試，篩選出一株能抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa菌株 P1。通過液體發(fā)酵和劑型處理，將P1制成懸浮劑（P1SC），用于室內生測和大田試驗，測定其對廣東菜心根腫病的防治效果。盆栽試驗結果表明，對菜心根腫病的防治效果與所使用的P1SC濃度呈正相關，當施用P1SC 中P1的濃度≥1×106 cfu/mL時，對菜心根腫病的防治效果（83.0%）與化學農藥氟啶胺（500 mg/L）的防治效果（100.0%）沒有顯著性差異，但顯著高于（P≤0.05）一種商品枯草芽孢桿菌（2×107 cfu/mL）的防治效果（29.8%）。 2018年的大田試驗結果表明，P1SC處理（4 L/667m2）對菜心根腫病的防治效果（53.3%）顯著高于（P≤0.05）枯草芽孢桿菌處理（2 kg/667m2，30.9%），與500 g/L氟啶胺SC（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）沒有顯著差異（P≤0.05）;而在2019年，P1SC處理對菜心根腫病的防治效果（62.4%）顯著高于（P≤0.05）500 g/L氟啶胺SC（34.6%）和枯草芽孢桿菌處理（31.4%）。

??關鍵詞

十字花科;蕓薹根腫菌;休眠孢子;多黏類芽胞桿菌;防治效果

中圖分類號：

S476

文獻標識碼：B

DOI：10.16688/j.zwbh.2020644

Control effect of Paenibacillus polymyxa P1 strain against cabbage clubroot in Guangdong

ZHANG Yingying1，HAO Wenjuan1，LI Hongyu2，MA Yan2，MAO Weili1*

（1. Shanghai Wanlihua Biotech Corporation， Shanghai201203， China;

2. Dali Plant Protection Station， Yunnan Province， Dali671000， China）

Abstract

Clubroot is a worldwide and harmful disease. Chemical pesticides have been used to control the disease， however， excessive use of chemical pesticides will lead to the resistance of the pathogen and instable control effect of the pesticides，and cause the problems of environmental pollution and food safety. Screening and developing biocontrol agents are necessary for clubroot control and sustainable development of green agriculture. In this study， a variety of biocontrol agents were selected to test their inhibition activity on dormant spore germination of Plasmodiophora brassicae Woron. A strain P1 of Paenibacillus polymyxa was selected， with good inhibiting effect on germination of the dormant spores. Through the processes of fermentation and formulation， a suspension concentrate was made containing P1 （P1SC）， and the control effect against the clubroot of Guangdong cabbage （CGC） was investigated by indoor pot experiment and field test. Pot experiment revealed that there was a positive correlation between the concentration of P1SC applied and the control effect. When the content of P1 spores in? P1SC applied was ≥1×106 cfu/mL， there was no significant difference （P≤0.05） on the control effect of CGC between the treatments of P1SC （83.0%） and the chemical pesticide fluazinam （500 mg/L， 100.0%）， but significantly higher （P≤0.05） than that of a commercial formulation with a strain of? Bacillus subtilis （2×107 cfu/mL， 29.8%）. Field experiments in 2018 showed that the control effect of P1SC （4 L/667m2，? 53.3%） on CGC was significantly higher （P≤0.05） than that of B. subtilis （2 kg/667m2， 30.9%）， but similar to that of 500 g/L? fluazinam SC （500 mL/667 m2， 44.6%）. The results of 2019 showed the control effect of P1SC on CGC （62.4%） was significantly higher （P≤0.05） than that of fluazinam （34.6%） and B.subtilis （31.4%）.

Key words

Cruciferae;Plasmodiophora brassicae;dormant spore;Paenibacillus polymyxa;control effect

蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron主要侵染十字花科作物并引起根腫病。早在1737年根腫病已出現(xiàn)在地中海西岸及歐洲南部，目前已成為一種世界性的嚴重影響十字花科作物產量的土傳病害[1 3]。根腫病在中國大部分地區(qū)均有發(fā)生，約有320～400萬hm2的耕地常年受到根腫病的侵染。P.brassicae主要侵染作物根部，形成大小不一、光滑或龜裂粗糙的腫瘤，影響根系生長及對水分、養(yǎng)分的吸收，導致地上部分黃化、萎蔫、生長遲緩，甚至死亡，可造成20%～60%的減產和經濟損失[4 5]。在無十字花科寄主的情況下，P.brassicae的休眠孢子可在土壤中存活長達20年之久[1]。一旦土壤帶菌，在很長一段時間內該地塊不能再種植十字花科作物。由于根腫病的傳播速度快，途徑廣，在防控上十分困難。

目前國內外對根腫病的防治主要采用化學藥劑，例如氟啶胺、氰霜唑、多菌靈、百菌清等。但長期使用化學藥劑，會造成P.brassicae的抗藥性增強、防效不穩(wěn)定，并會產生大量的農藥殘留，不利于綠色生態(tài)農業(yè)的發(fā)展。通過施用石灰調節(jié)土壤pH可降低根腫病的發(fā)病率[6]， 但大量施用石灰會改變土壤的物理結構和理化性質，因此也不宜長期施用。生物防治對環(huán)境和人畜無害，且不易產生抗藥性，國內外科研人員利用生物農藥對根腫病的防治進行了大量的研究，并取得了一定的成效。王保通等[7]選用一種解淀粉芽胞桿菌生物制劑（Ba168）對甘藍根腫病的防治進行了溫室試驗，結果顯示，其防治效果在79.84%～81.24%。何有為[8]從土壤中分離出兩株芽胞桿菌F85和T133，對P.brassicae的休眠孢子侵染油菜根毛有抑制作用，F(xiàn)85和T133的盆栽試驗防效均在60%以上。Cheah等[9]在花椰菜溫室和田間試驗中發(fā)現(xiàn)，3個木霉菌株Trichoderma spp. （TC32，TC45和 TC63） 和1個鏈霉菌Streptomyces sp. （S99） 均對根腫病有抑制作用。

目前全球已登記的，含不同有效成分的生物農藥有上千個產品。僅以木霉為產品活性成分的殺菌劑就有300多個[10]。在許多發(fā)達國家，如：美國、加拿大、日本、歐盟、澳大利亞、以色列等，生物農藥使用量已從20世紀90年代初的 <5%，到目前的接近或 >20%的全年農藥使用總量。在發(fā)展中國家，例如：巴西、印度、中國、越南等，生物農藥的使用量也有了顯著的提升[10 11]。我國在生物農藥領域的研究起步雖早，但總體發(fā)展較慢且不均衡。直到本世紀初，在國家的大力倡導和支持下，生物農藥的研究與產業(yè)化有了平衡而快速的發(fā)展[12 13]。2001年我國注冊登記的生物農藥品種只有80個，產品694個（其中大多為農用抗生素類產品），到2018年，我國注冊登記的生物農藥，包括微生物、植物源和生物化學類，產品數(shù)達1 366個[14]。據不完全統(tǒng)計，我國生物農藥的使用量已從2010年前的<5%，上升到目前接近或>10%的全年農藥總使用量。

本研究通過拮抗試驗，篩選出一株對P.brassicae休眠孢子萌發(fā)有抑制作用的Paenibacillus polymyxa菌株P1。將其制成多黏類芽胞桿菌懸浮劑（P1SC）后，在室內生測及大田試驗中評價其對根腫病的防治效果。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌株：20株木霉屬真菌、10株芽胞桿菌屬細菌（表1），由上海萬力華生物科技有限公司分離保存。

培養(yǎng)基：真菌用PDB培養(yǎng)基，細菌用NB培養(yǎng)基。

供試菜心Brassica campestris L.ssp. chinensis var. utilis Tsen品種：‘四九菜心’，青縣純豐蔬菜良種繁育場。

供試藥劑：2×108 cfu/mL P1SC，上海萬力華生物有限公司;500 g/L氟啶胺懸浮劑（SC），先正達集團;100億個/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（WP），云南星耀生物制品有限公司。

1.2蕓薹根腫菌休眠孢子懸浮液的制備

稱取10 g菜心根腫組織洗凈，置于24℃室內腐爛5 d，加入100 mL蒸餾水，用組織研磨機攪成勻漿，8層紗布過濾，濾液2 000 r/min離心5 min，重復3次。將沉淀溶于100 mL蒸餾水中，制成濃度為1×108個/mL的蕓薹根腫菌休眠孢子懸浮液，冷藏于4℃冰箱備用。

1.3拮抗微生物培養(yǎng)液的制備

將生長在斜面培養(yǎng)基上的拮抗菌株，分別接入含有100 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于28℃，200 r/min的搖床上培養(yǎng)（真菌5 d，細菌2 d），鏡檢后，用無菌水稀釋制成濃度為1×108 cfu/mL拮抗菌培養(yǎng)液。

1.4根分泌物的收集

因為根腫病菌的休眠孢子不能在植物體外進行培養(yǎng)，所以收集廣東菜心根分泌物充當寄主，以便對病原菌休眠孢子進行離體測試。菜心種子經 5.25%次氯酸鈉表面消毒后，在28℃下催芽2～3 d;將出芽的種子播種到含有500 mL Hoagland營養(yǎng)液的容器中，在（28±2）℃的培養(yǎng)箱中，L∥D=12 h∥12 h培養(yǎng)7 d后，紗布過濾收集根分泌物，經過微孔濾膜（孔徑0.22 μm）濾除細菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的篩選

分別吸取0.5 mL P.brassicae休眠孢子懸浮液和拮抗菌培養(yǎng)液，移至含有3 mL滅過菌的根分泌物的離心管中，以無菌水代替拮抗菌培養(yǎng)液為空白對照，24℃黑暗培養(yǎng)5 d，鏡檢觀察孢子萌發(fā)率，重復3次。

采用地衣紅法[15]判定休眠孢子的萌發(fā)。用1%地衣紅染色劑（45 mL醋酸與55 mL蒸餾水混合，加熱，緩慢加入1 g地衣紅粉末，攪拌溶解后緩慢煮沸2 h，過濾后儲存在棕色瓶中備用）染色3 min后觀察，著色的為未萌發(fā)的休眠孢子，未著色的為萌發(fā)的孢子。

休眠孢子萌發(fā)率=處理前孢子萌發(fā)率-處理后孢子萌發(fā)率;

休眠孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100%。

1.6P1SC防治菜心根腫病室內生測

選取直徑10 cm的營養(yǎng)缽，裝入營養(yǎng)土（草炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石=7 ∶1 ∶2），移栽生長情況一致的兩葉期菜心苗。移栽當天每缽加入2 mL P.brassicae休眠孢子懸浮液（1×107 cfu/mL）。將P1SC配制成5個濃度：1×105， 5×105， 1×106，5×106， 1×107 cfu/mL。 其他藥劑處理為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑稀釋500倍;500 g/L氟啶胺懸浮劑稀釋1 000倍;清水空白對照。采用灌根法，分別在移栽當天、7 d以及14 d后，將各處理藥劑澆灌于作物根部，每缽50 mL。每個處理5缽， 設3次重復。種植40 d后，統(tǒng)計根腫病發(fā)病情況。

菜心根腫病病害分級標準[16]：0級：無任何腫瘤;1級：主根腫大，其直徑小于2倍莖基，或須根有小腫瘤;3級：主根腫大，其直徑為莖基的2～3倍;5級：主根腫大，其直徑為莖基的3～4倍;7級：主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上，或植株死亡。

1.7P1SC防治根腫病大田試驗

2018年和2019年的大田試驗在上海浦遠農場進行，種植方式為撒種直播并適時間苗。在菜心出苗前，用春豐8HA電動噴霧器對土壤表面進行不同處理的噴霧施藥;菜心出苗（兩葉菜心）后，對不同處 理進行葉面噴霧，每隔7 d一次，共3次。試驗設4個處理：a. P1SC用藥量為： 4 L/667m2;b. 氟啶胺SC用藥量為：500 mL/667m2;c. 枯草芽孢桿菌WP用藥量為：2 kg/667m2;d. 清水對照。每個處理20 m2，3次重復，隨機排列，用水量為50 L/667m2。 成熟期采收后統(tǒng)計發(fā)病情況。

菜心根腫病病害分級標準[17]：0級，無病害癥狀;Ⅰ級，僅須根末梢上有少量腫瘤;3級，側根上有腫瘤;5級，側根腫瘤大且主根末梢有小的腫瘤;7級，主根全部腫大，但植株生長正常;9級，根上腫大部分開始龜裂腐爛、植株萎蔫或死亡。

由于盆栽試驗是在可控的特定條件下進行，菜心根部的生長環(huán)境與同時期的田間試驗的環(huán)境有所不同，因此盆栽試驗和田間試驗分別采用不同的分級標準[18]。試驗結果可靠且對結果的比較沒有影響。

1.8數(shù)據處理

試驗數(shù)據使用Excel整理，采用SPSS 23對數(shù)據進行單因素ANOVA分析。

2結果與分析

2.1拮抗菌抑制P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的測試結果

試驗結果表明（表2）：拮抗真菌TR04、TR13和細菌P1、P2、P7對P.brassicae休眠孢子萌發(fā)的抑制率均在50%以上，其中P1的抑制率高達71.3%，該處理的P.brassica休眠孢子萌發(fā)顯著低于（P≤0.05）其他處理孢子的萌發(fā)率。

2.2P1SC防治菜心根腫病室內生測結果

室內生測結果表明（表3，圖1），P1SC對菜心根腫病的防治效果與用藥濃度呈正相關。 當施用P1SC? 中的P1的濃度≥1×106 cfu/mL時，對菜心根腫病的防治效果為83.0%，與化學農藥500 mg/L 氟啶胺SC的防治效果（100.0%）沒有顯著性差異，但顯著高于（P≤0.05）一種商品枯草芽孢桿菌（2×107 個/mL）的防治效果（29.8%）。

2.3大田試驗結果

2018年的大田試驗結果表明（表4，圖2），P1SC處理（4 L/667m2）對菜心根腫病的防治效果（53.3%）顯著高于（P≤0.05）枯草芽孢桿菌處理（2 kg/667m2，30.9%），與氟啶胺（500 mL/667m2）的防治效果（44.6%）沒有顯著差異;而在2019年，P1SC處理對菜心根腫病的防治效果（62.4%）顯著高于（P≤0.05）氟啶胺（34.6%）和枯草芽孢桿菌處理（31.4%）。

3討論

多黏類芽胞桿菌作為一種生防菌，已廣泛應用于植物病害生物防治。Kavitha等[19]發(fā)現(xiàn)多黏類芽胞桿菌 VLB16 抑制稻瘟病菌Pyricularia oryzae 和水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani的生長。劉晶晶等[20]篩選出5株多黏類芽胞桿菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6），通過釋放揮發(fā)性物質來抑制茄子黃萎病菌Verticillium spp. 的生長。另外多黏類芽胞桿菌還對人參黑斑病菌Alternaria panax、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum和蘋果樹腐爛病菌Valsa ceratosperma 等有較好的拮抗效果[21 25]。但是，使用多黏類芽胞桿菌防治十字花科根腫病還鮮有報道。本研究的室內生測試驗以及2年的大田試驗結果表明，P1可以抑制P.brassicae休眠孢子的萌發(fā)，P1SC能較好地防控菜心根腫病，其防控效果與化學農藥氟啶胺接近（2018年），或超過氟啶胺的防控效果（2019年）。

生防菌的開發(fā)利用，為解決十字花科根腫病問題提供了新的思路。 多數(shù)生防菌在室內盆栽試驗的防效高于大田試驗。究其原因可能是目前的生物菌劑有效成分為活體微生物，田間應用時易受溫度、濕度、土壤pH等環(huán)境條件的影響，從而降低了生防菌對根腫病菌的拮抗作用[26]。如何高效、穩(wěn)定地防治根腫病是目前生防菌研究的主攻方向。本研究兩年大田試驗結果表明，P1SC的大田防效相對穩(wěn)定。但是能否長期穩(wěn)定地防治根腫病還需要大量的研究來證明。

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收稿日期：2020 12 03修訂日期：2021 01 27

基金項目：

大理州毛偉力專家工作站（大科聯(lián)發(fā)[2019]6號）

* 通信作者

Email：weilimao@hotmail.com