湖南省馬鈴薯病毒病發生情況調查

崔紅紅 張幸媛 田宇豪 甘斌 尹燕 胡新喜 熊興耀 秦玉芝

摘要

為了解湖南省馬鈴薯種薯質量和主要病毒病發生情況，2019年-2020年馬鈴薯秋作和冬作期間，對長沙、益陽、湘潭、澧臨等馬鈴薯生產區的155個馬鈴薯樣品，運用反轉錄 聚合酶鏈式反應（RTPCR）和雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測（DASELISA） 技術，篩查6種主要馬鈴薯病毒，包括馬鈴薯X病毒 Potato virus X （PVX）、馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、馬鈴薯M病毒Potato virus M （PVM）、馬鈴薯S病毒Potato virus S （PVS）、馬鈴薯A病毒Potato virus A （PVA）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。檢測結果表明：6種馬鈴薯病毒病在湖南均有不同程度的發生，單一和兩種病毒復合感染植株占比最高，其次是3種病毒復合感染，存在極少數植株復合感染4～5種病毒病情況。在秋作馬鈴薯中，PVY檢出率達到29.41%;PVS和PVA檢出率均為27.94%;PVM、PVX、PLRV的檢出率分別為20.59%、19.12%、17.65%。在冬作馬鈴薯中，PVX 檢出率最高，達到31.03%;其次是PLRV，檢出率為25.29%;PVS、PVM、PVA、PVY的檢出率依次為19.54%、16.09%、10.34%、5.75%。綜上所述，近年來湖南地區馬鈴薯病毒病發生有抬頭之勢，其中PVX和PVY最為嚴重，復合感染增加，受天氣和種源影響，秋作馬鈴薯比冬作馬鈴薯情況嚴重。

??關鍵詞

馬鈴薯;病毒病;調查鑒定;RTPCR;DASELISA

中圖分類號：

S435.32

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020541

Investigation on occurrence of potato virus disease in Hunan province

CUI Honghong1，ZHANG Xingyuan1，TIAN Yuhao1，GAN Bin1，YIN Yan1，HU Xinxi1，XIONG Xingyao2，QIN Yuzhi1*

（1. College of Horticulture，Hunan Agricultural University， ERC for Horticultural Crop Germplasm

Creation and New Variety Breeding，Ministry of Education， Changsha410128， China; 2.Agricultural

Genomics Institute at Shenzhen， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen518120， China）

Abstract

To clear the quality of seed potato tubers and the occurrence of major virus diseases in Hunan province， 155 potato samples from Changsha， Yiyang， Xiangtan and Lilin potato production areas from 2019 to 2020 were screened for six major potato viruses， including Potato virus X （PVX）， Potato virus Y （PVY）， Potato virus M （PVM）， Potato virus S （PVS）， Potato virus A （PVA）， Potato leaf roll virus （PLRV）by? reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR） and double antibody sandwich enzymelinked immunosorbent assay （DASELISA）. The results showed that six potato virus occurred in different degrees in Hunan province. The proportion of single and two kinds of virus infection was the highest， followed by three kinds of virus infection， while there were very few plants infected with 4 5 kinds of virus diseases. In autumn potatoes， the detection rate of PVY reached 29.41%， those rates of PVS and PVA were 27.94%， while those of PVM， PVX and PLRV were 20.59%， 19.12% and 17.65%， respectively. In winter potatoes， the detection rate of PVX was the highest （31.03%）， followed by PLRV （25.29%）， while those of PVS， PVM， PVA and PVY were 19.54%， 16.09%， 10.34% and 5.75%， respectively. In conclusion， in recent years， the occurrence of potato virus diseases in Hunan province has been on the rise， especially PVX and PVY are the most serious， and the mixed infection is increasing. Affected by weather and provenance， the situation of virus infection in autumn potato is more serious than that in winter potato.

Key words

potato;viral disease;investigation;RTPCR;DASELISA

馬鈴薯Solanum tuberosum是一種分布廣泛、適應性強、產量高且具有較高的營養價值和經濟價值的作物。中國是世界上最大的馬鈴薯生產國之一，隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴大，馬鈴薯受病毒病危害也越來越嚴重。病毒病導致的馬鈴薯植株退化，嚴重影響馬鈴薯的產量和質量，可使馬鈴薯減產20%～50%不等[1 3]。

已報道的馬鈴薯病毒病多達40種以上[4 6]，危害比較嚴重的主要有馬鈴薯X病毒 Potato virus X （PVX）、馬鈴薯Y病毒Potato virus Y （PVY）、馬鈴薯M病毒Potato virus M （PVM）、馬鈴薯S病毒Potato virus S （PVS）、馬鈴薯A病毒Potato virus A （PVA）、馬鈴薯卷葉病毒Potato leaf roll virus（PLRV）。其中，PVY是侵染馬鈴薯最嚴重的病毒，在中國各地區的檢出率均較高。感染PVY的植株通常表現出重花葉或不同程度的壞死斑，危害嚴重時可導致馬鈴薯減產80%[7];PLRV引起馬鈴薯卷葉，對馬鈴薯的侵染僅次于PVY， 尤其是在內蒙古自治區[8 12];其他4種病毒（PVX、PVS、PVM、PVA）單獨侵染馬鈴薯時，表現癥狀不明顯或不表現癥狀，復合侵染時會因病毒的數量、種類、侵染的程度等不同而表現出不同程度的花葉、卷葉或壞死癥狀[13]。目前湖南地區馬鈴薯脫毒種薯應用比例偏低，冬作馬鈴薯僅30%左右，薯農在馬鈴薯秋作時則習慣自留種薯。本文通過對湖南馬鈴薯主產區進行病毒發生情況調查，以了解近年馬鈴薯病毒病發生情況和病毒種類，為湖南地區馬鈴薯病毒病害防治提供參考依據。

1材料與方法

1.1樣品采集

分別于2019年11月馬鈴薯秋作和2020年4月馬鈴薯冬作成熟期，從長沙、益陽、湘潭、澧臨等馬鈴薯生產地區進行病毒病田間調查。采集有花葉、斑駁、卷葉、壞死等病毒癥狀的樣品，癥狀不明顯的地塊采取五點取樣法隨機取樣，樣品莖葉 80℃保存備用。秋作采集樣品68個，冬作中采集樣品87個，共155個樣品。樣品包括‘湘馬鈴薯1號’‘費烏瑞它’‘興佳2號’‘華薯1號’‘華薯2號’‘金湘’‘紫玉’等共42個品種（系）。

1.2檢測方法

1.2.1DASELISA法

對所采集的155個樣品進行DASELISA法檢測6種病毒：向預先包被馬鈴薯病毒捕獲抗體的微孔中，依次加入標本、陰性和陽性對照、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌，用底物TMB顯色， TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的馬鈴薯病毒含量呈正相關。用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），判定陰陽性。DASELISA檢測試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司，具體步驟參照使用說明書。

1.2.2RTPCR法

抽取部分樣品提取植物總RNA，采用北京天根生化技術有限公司的總RNA提取試劑盒，以不含6種病毒的馬鈴薯為陰性對照，分別含6種病毒的馬鈴薯為陽性對照。將提取的RNA反轉錄成cDNA，反轉錄試劑盒購自擎科生物技術有限公司，具體步驟參照GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2說明書操作。以反轉錄合成的cDNA為模板利用金牌Mix（購自擎科生物技術有限公司）進行RTPCR擴增，反應條件為：預變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30個循環;延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參考文獻[14]中的引物并結合Primer premier 5軟件設計引物，由擎科生物技術有限公司合成。引物見表1。

2結果與分析

2.1馬鈴薯感染病毒病表型分析

本次調查過程中采集到的具有典型癥狀的樣品如圖1所示，表現為輕花葉，葉片褪綠，葉片顏色深淺不一，發生形變（b）;葉片出現壞死斑點，顏色較暗（c）;葉片褪綠，出現斑點，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（d）;葉面粗糙，沒有光澤，葉片出現黃綠相間的斑點（e）;葉片出現壞死斑點，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（f）;葉片中出現不規則的灼燒斑點，葉面粗糙，皺縮，葉片卷曲（g）;葉片顏色深淺不一，葉片中有不規則的灼燒斑點和青銅色枯斑，卷葉，植株下部葉片干枯（h）;葉片下垂，褪綠，出現青銅色枯斑，葉邊緣以主脈為中心向上卷曲（i）。

經檢測，a無所檢測的6種病毒;b含PVX;c含PVY;d含PLRV;e含PVM;f含PLRV和PVY;g含PVA和PVM;h含PVS、PVX和PVY;i含PVS、PVA。

2.2DASELISA法檢測分析

采用DASELISA法對155個樣品（秋作中采集樣品68個，冬作中采集樣品87個），分別進行6種病毒檢測。由表2可見，秋作馬鈴薯樣品中，不同病毒復合感染情況高發。其中單一病毒感染樣品占總樣品數量的33.82%;其次是2種馬鈴薯病毒復合感染的樣品占總樣品數量的30.88%;感染3種和4種馬鈴薯病毒的樣品較少，分別占總樣品數量的7.35%和4.41%;本次調查發現有1.47%的樣本為5種馬鈴薯病毒復合感染。

冬作馬鈴薯樣品中，41.38%為單一病毒感染樣品，3種馬鈴薯病毒復合感染的樣品最少，占總樣品數量的5.75%;2種馬鈴薯病毒復合感染的樣品較多，占總樣品數量的21.84%。

由表3可見，在秋作馬鈴薯中，所檢測的6種主要馬鈴薯病毒均有涉及。感染PVY病毒的馬鈴薯樣品最多，占總樣品數量的29.41%; 感染PLRV病毒的馬鈴薯樣品最少，占總樣品數量的17.65%;感染PVA和PVS病毒的馬鈴薯樣品較多，均占總樣品數量的27.94%;感染PVX和PVM病毒的馬鈴薯樣品較少，分別占總樣品數量的19.12%和20.59%。

在冬作馬鈴薯中，所檢測的6種主要馬鈴薯病毒均有涉及。感染PVX病毒的馬鈴薯樣品最多，占總樣品數量的31.03%;感染PVY病毒的馬鈴薯樣品最少，占總樣品數量的5.75%;感染PLRV病毒的馬鈴薯樣品較多，占總樣品數量的25.29%;感染PVM和PVS病毒的馬鈴薯樣品較少，分別占總樣品數量的16.09%和19.54%;感染PVA病毒的馬鈴薯樣品占總樣品數量的10.34%。

在所采集的155個樣品中抽取8個樣品進行RTPCR驗證，結果見圖2。

將8個樣品DASELISA法和RTPCR法兩種方法檢測的結果整理見表4。由表4可知：除PVX之外，其他病毒兩種方法檢測的結果一致。

3討論

馬鈴薯病毒病是我國馬鈴薯產業持續、健康、高效發展的主要障礙之一[15 19]。田間植株表型分析是病毒病發生調查最為便捷的方法，感染病毒的植株會隨感染病毒種類、數量和程度等的不同而表現不同的癥狀（花葉、卷葉、皺縮、黃化、壞死），中等和重度單一病毒感染植株表現出典型的癥狀，田間調查易于辨識。調查發現，輕度感染和復合感染的植株，由于病毒種類和感染程度的變化很難根據田間植株癥狀進行準確判斷。如植株表現重度花葉癥狀，通常是PVY病毒感染引起的，但PVA與其他病毒混合感染時也會表現出花葉的癥狀。ELISA和RTPCR技術的應用大大提高了馬鈴薯病毒病檢測的準確性，其中，RTPCR技術由于其檢測成本較低和靈敏度好應用日益廣泛。

2013年吳興泉等[20]和范國權等[21]分別對我國黑龍江、內蒙古、甘肅、云南等地馬鈴薯病毒病發生情況進行調查，結果均表明PVY和PVS為我國主要流行馬鈴薯病毒。2010年胡新喜等[22]對湖南省馬鈴薯主產區冬作馬鈴薯病毒種類及流行分析時發現，PVS檢出率最高，其次是PVX和PVY。本次調查發現，湖南秋作馬鈴薯中，PVY檢出率最高， 其次是PVS和PVA，復合感染高發;在湖南冬作馬鈴薯中，檢出率最高的是PVX，其次是PLRV，該調查結果與10年前相比，PVS的檢出率降低，PVX的檢出率升高。湖南地區秋作馬鈴薯與冬作馬鈴薯相比較，前者病毒病發生種類多，程度更嚴重，原因有二，一是種薯質量的差異，秋作種薯大多是薯農自留種甚至購買商品薯做種，種薯帶毒普遍，蚜蟲傳播病毒的毒源更多，冬作脫毒種薯使用率相對較高，種薯攜帶病毒較少，蚜蟲傳播病毒的毒源較少;二是氣候的差異，2019年秋作遭遇連續40 d以上的高溫干旱天氣，干旱會加快病毒傳播媒介對病毒的傳播，高溫抑制植物生長同時有利于蚜蟲的活動，減弱馬鈴薯自身的抗病性，冬作生長季氣候冷涼，病毒媒介昆蟲活動減弱。

馬鈴薯病毒病的防治要從脫毒種薯的推廣入手，生產中以預防為主，通過減少蚜蟲等傳毒媒介對病毒的傳播來減少病毒對馬鈴薯的危害。就湖南省目前情況，必須重視種薯的質量，提高脫毒種薯的普及率，湖南馬鈴薯秋作播種時節由于北方種薯還未進入收獲期，脫毒種薯引入受限，如果本地選擇適宜區域，運用網棚進行控制規模的良種繁育生產，實現秋作馬鈴薯種薯自供應，可以有效改善湖南秋作脫毒種薯種源不足的現狀。

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收稿日期：2020 10 15修訂日期：2020 11 25

基金項目：

國家重點研發計劃（2017YFD0101905）;湖南省旱糧產業技術體系育種與良種繁殖崗位科學家項目

* 通信作者

Email：qyuz@163.com