二氧化碳在華北大黑鰓金龜幼蟲定位寄主植物根系中的作用

劉香雨 趙旭 王志敏 秦健輝 屈亞飛 李克斌 曹雅忠 尹姣

摘要

為探究二氧化碳（CO2）在華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita幼蟲定位寄主植物根系時所發揮的作用，對其開展了觸角電位生理反應及行為生測試驗。研究結果表明，CO2濃度為0.75%、1.5%、3%、6%時均能顯著激發幼蟲的觸角電位和趨性反應，且隨著濃度增加幼蟲對CO2的趨向爬行所用時間顯著縮短;根系分泌物同樣能引起華北大黑鰓金龜幼蟲的觸角電位和趨性行為反應，且與1.5% CO2間無顯著差異;將1.5% CO2分別與棕櫚酸甘油酯、2丁烯酸、肉豆蔻酸、十四烷、4甲基2氧戊酸、十二烷、環己六醇、鄰二甲苯和對羥基苯甲酸等9種根系分泌物混合后對試蟲引誘效果增強，其趨向爬行時間顯著縮短。以上結果顯示，CO2在華北大黑鰓金龜幼蟲定位寄主植物根系過程中發揮了重要的指引和增效作用，試驗結果可為華北大黑鰓金龜幼蟲的綠色防治提供新思路。

關鍵詞

華北大黑鰓金龜幼蟲;二氧化碳;植物根系分泌物;觸角電位;行為反應

中圖分類號：

S433.5

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020575

The role of carbon dioxide in the orientation of Holotrichia oblita larvae to the host plant root

LIU Xiangyu，ZHAO Xu，WANG Zhimin，QIN Jianhui，QU Yafei，

LI Kebin，CAO Yazhong，YIN Jiao*

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing100193， China）

Abstract

In order to explore the role of carbon dioxide （CO2） in locating the roots of host plants by the larvae of Holotrichia oblita， the electroantennogram （EAG） and behavioral responses were assayed. The results showed that the stimulation of 0.75%， 1.5%， 3%， 6% CO2 elicited a strong reaction of the larvae， and their crawling speed became faster with increasing concentration of CO2. The root exudates could also induce an EAG and chemotaxis response of H.oblita larvae， and the results were similar to that of the group of 1.5% CO2. Furthermore， mixing 1.5% CO2 with nine kinds of root exudates， i.e.， tripalmitin， 2butenoic acid， myristic acid， tetradecane， 4methyl2oxovaleric acid， dodecane， inositol， oxylene and phydroxybenzoic acid， respectively， could enhance the attraction effect and significantly shorten the crawling time. These results suggested that CO2 played an important role in guiding and enhancing the locating capability of the larvae of H.oblita for the host plant roots， which provides a new idea for green control of H.oblita larvae.

Key words

Holotrichia oblita larvae;carbon dioxide;plant root exudates;EAG;behavioral responses

蠐螬為鞘翅目金龜子幼蟲的統稱，是我國地下害蟲中種類最多、發生為害最嚴重的類群[1]。其取食苗木根系，使其生長發育不良甚至死亡;或取食種子新萌發出的胚根、胚莖，使其不能萌發出土成苗，發生嚴重時可毀壞整塊苗圃[2]，而且苗木被咬食后，傷口處易感染病菌。據統計，植物地下部分受害有86%是蠐螬為害造成的[3]。另外，由于種植結構調整、免耕、淺耕、秸稈還田、有機肥推廣等措施的實施，蠐螬在田間的為害日益嚴重[4]。華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita對農作物、林木苗圃等為害的嚴重性以及廣泛性在金龜子類群中居于首位，也是土棲金龜子中的一個優勢種[5]。該蟲一般1年發生1代，其3齡幼蟲食量大，活動能力強，多在花生、大豆等油料和其他作物田的土壤中發生為害[6]。從東北到西北到西南再到華南，幾乎全國范圍都有華北大黑鰓金龜的分布[7]。由于蠐螬生活在土壤中，藥劑難以直接接觸到蟲體，多年來主要采用高毒、高殘留的化學藥劑進行種子或土壤處理，對土壤和環境造成了巨大的污染，因此目前生產上急需綠色技術對蠐螬進行有效防控[8]。

害蟲引誘技術由于具有對環境安全、選擇性高、兼容性好等特點，已經成為當前植保領域研究熱點[9- 10]，并在多種重要農業害蟲的田間種群監測和防治中得到了應用。目前引誘劑分為視覺引誘劑和嗅覺引誘劑[11]。視覺引誘主要是利用昆蟲對某些顏色的趨性，比如熒光紅色和黃色[12];嗅覺引誘則是利用一些植物揮發物、性信息素等化學物質對昆蟲進行引誘[13 -14]，比如，丙酸苯乙酯+丁香酚+香葉醇（3 ∶7 ∶3）的混合物在監測和誘殺日本金龜子Popillia japonica成蟲中被廣泛使用[13]。李曉峰等利用植物揮發物、性信息素、聚集信息素混配獲得多個引誘華北大黑鰓金龜成蟲的高效配方[15]，為華北大黑鰓金龜的誘集防控提供了技術支持。但是，華北大黑鰓金龜主要通過幼蟲取食植物根系造成危害，研究表明其對玉米、花生以及大豆根系都具有顯著的趨向性[16]，其中根系分泌物發揮了重要作用。植物根系分泌物是指在植物生長過程中，由根部釋放到介質中的有機物質[17]。根系分泌物在植物與環境的互作中起傳遞信息的作用。不同作物根系分泌物的種類以及同種作物在不同生育期的根系分泌物的數量和種類都有差異[18]。已有研究表明，釋放到根際的次生植物代謝物（如低分子量的醇類、酯類和酸類）對地下昆蟲具有“引誘”特性，可以幫助土壤昆蟲對其寄主植物進行定位和識別[19-20]。

二氧化碳（CO2）作為一種非特異引誘劑在土壤昆蟲對寄主植物的定位中發揮著重要作用[21]。最典型的例子是玉米根螢葉甲 Diabrotica virgifera virgifera 對寄主植物的定位，Bernklau等[22]的研究表明， CO2對玉米根螢葉甲的最佳吸引濃度為2.51～4.20 mmol/mol，與玉米根附近土壤中CO2濃度（4.36±0.31） mmol/mol基本一致，300 mmol/mol 或900 mmol/mol的CO2濃度對玉米根螢葉甲表現出毒性。大量試驗結果表明，玉米根螢葉甲僅根據CO2的濃度即可完成對玉米根的定位，并不需要其他物質的參與[23]。另外，針對淺黃根瘤象Sitona lepidus、甘藍地種蠅 Delia radicum 等多種地下害蟲的研究表明，害蟲在檢測到相應濃度的CO2后會引發其對寄主植物根系更為密集的搜索行為[19- 20， 24]。已有研究也表明，CO2是蠐螬尋找食物、定位寄主植物根系的重要線索[25]，但是在對CO2和寄主植物根系的雙向選擇過程中，暗黑鰓金龜 Holotrichia parallela 和銅綠麗金龜 Anomala corpulenta 幼蟲更趨向于植物根系[26]。目前對于CO2在華北大黑鰓金龜幼蟲定位寄主植物過程中的作用尚未明確。

因此，本文旨在通過研究華北大黑鰓金龜幼蟲對CO2和根系分泌物刺激的電生理反應和行為選擇，探索CO2在華北大黑鰓金龜幼蟲定位植物根系過程中發揮的作用，為開發新的華北大黑鰓金龜幼蟲等地下害蟲引誘劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

華北大黑鰓金龜取自中國農業科學院植物保護研究所地下害蟲組實驗室孵化的幼蟲，置于養蟲箱 （長36 cm×寬25 cm×高22 cm）內，將厚度為10 cm的滅菌土壤均勻地鋪滿箱底，濕度保持在（18±1）%， 室溫控制在（25±1）℃，以馬鈴薯塊及小麥苗為飼料進行飼養。

1.2供試材料

MY15 型觸角電位儀（北京市科安勞保新技術公司）;臂長25 cm的直管;“Y”形嗅覺儀主臂長20 cm，兩個側臂長18 cm，內徑為3 cm（北京興運科諾科貿中心）;QC3大氣采樣儀（北京市科安勞保新技術公司）;0.75%、1.5%、3%、6%（氮氣填充）的CO2混配氣體購于北京上通宏化工有限公司。

根系分泌化合物的選取參照馬艷華等[16]，共37種;分別購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司、北京中創宏達科技有限公司、上海源葉生物科技有限公司、北京伊諾凱科技有限公司、北京百靈威科技有限公司、賽譜銳思（北京）科技有限公司、北京依珊匯通科技有限公司、北京凱國科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司，均為純度≥95%的分析純試劑。配制成濃度為0.1%的溶液，溶劑為石蠟油。

1.3華北大黑鰓金龜幼蟲觸角電位反應及行為試驗

1.3.1試蟲選擇

選擇健康、活潑、大小相同的3齡幼蟲進行試驗，試驗前進行8～10 h的饑餓處理。

1.3.2 華北大黑鰓金龜幼蟲對CO2和根系分泌物的觸角電位反應

用鑷子將幼蟲觸角完整地取下后用導電膠將觸角輕輕地粘在兩個電極上，保證只有觸角兩端與導電膠接觸。分別觀測華北大黑鰓金龜幼蟲觸角對CO2和植物根系分泌物的電生理反應。以石蠟油為對照，取20 μL（1 μg/mL）的待測化合物溶液（由石蠟油配制）涂于濾紙條上，并將濾紙條放入1 mL的藍色槍頭內，將槍頭固定在電位儀上;每種化合物測試3根觸角，同一化合物在1根觸角上重復記錄3次[27]。進行CO2濃度梯度試驗時，分別將0.75%、1.5%、3%、6%的CO2氣體裝入一次性滅菌注射器中備用，每次給予刺激前，按照從低濃度到高濃度的順序，依次將2 mL CO2氣體打入槍頭即可，每個CO2濃度重復測試10根觸角。

1.3.3 華北大黑鰓金龜幼蟲對CO2和植物根系分泌物的趨性行為反應

參照Honda[28]的方法，利用“Y”形嗅覺儀觀測華北大黑鰓金龜幼蟲對化合物和CO2的選擇趨性。CO2與化合物的選擇試驗按照圖1 順序連接儀器，吸取20 μL（1 μg/mL）的標樣化合物滴于濾紙上，放置在“Y”形管一側臂端，另一側臂端通1.5%的 CO2，“Y”形管兩側臂端分別通入經洗氣瓶去除雜質和活性炭干燥的空氣，氣流保持在60 mL/min;每處理測試80頭幼蟲，各處理重復3次。將試蟲從嗅覺儀的主臂口2 cm處引入，檢查試蟲位置，試蟲若超過兩側臂結合中點到達某一側臂 5 cm處時，即認為試蟲選擇了測試化合物或CO2;停留在主臂或未達到側臂5 cm處的試蟲定為未作出選擇。

利用直管試驗裝置觀測不同化合物或不同濃度CO2誘集對華北大黑鰓金龜幼蟲爬行時間的影響。直管試驗裝置按照圖2連接。 除不同濃度CO2的試驗外，其余試驗的CO2濃度為1.5%（即選擇最接近植物根系的CO2濃度）[29]。氣流保持在60 mL/min ，將饑餓處理后的幼蟲放在距管口2 cm處，另一管口放置化合物或通CO2氣體，試蟲與化合物或CO2放置的距離為20 cm（界限），記錄幼蟲趨向爬行20 cm所需要的時間，為避免管中化合物殘留以及幼蟲爬行軌跡對于試驗的影響，每觀測10頭幼蟲要更換1次直管，更換化合物的同時也要進行直管的更換，每處理測試80頭幼蟲，重復3次。

1.3.4 華北大黑鰓金龜幼蟲對CO2與植物根系分泌物混合體的趨性行為反應

利用“Y”形管觀測根系分泌物添加CO2后對誘集華北大黑鰓金龜幼蟲的影響（圖1）。“Y”形管兩臂內放入加有20 μL（1 μg/mL）相同化合物溶液的濾紙條，但“Y”形管一側臂通入1.5% CO2，另一側臂通入過濾后空氣，其他試驗方法同1.3.3。

利用直管試驗裝置觀測根系分泌物添加CO2后（圖2），兩者的混合體在誘集過程中對試蟲趨向爬行時間的影響，具體方法同1.3.3。

1.4數據處理

試驗數據采用Excel 2016以及SPSS 16.0軟件進行處理。采用t測驗進行處理數據間的差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1華北大黑鰓金龜幼蟲對不同濃度CO2的趨性反應

2.1.1 華北大黑鰓金龜幼蟲對不同濃度CO2的觸角電位反應

結果表明，華北大黑鰓金龜幼蟲觸角對4種不同濃度的CO2均有明顯的電生理反應（圖3a），隨著CO2濃度的增加，觸角電位反應逐漸增強，其中3%CO2與6%CO2均能引起華北大黑鰓金龜幼蟲較強的觸角電位 反應，并顯著高于0.75%CO2引起的觸角電位反應（P<0.05），但是與1.5%CO2無顯著差異（P>0.05）。

2.1.2 華北大黑鰓金龜幼蟲對不同濃度CO2的趨向爬行時間

幼蟲對不同濃度CO2趨向爬行20 cm所需要的時間不同，從圖3b中可以看出，CO2濃度越高，幼蟲趨向爬行20 cm所需要的時間越短，其中6%CO2處理下爬行時間最短，僅需要75.4 s，極顯著低于其在0.75%、1.5%和3% CO2濃度刺激下爬行20 cm所用時間（P<0.01）。該結果與幼蟲對不同濃度CO2觸角電位反應結果基本一致。

2.2華北大黑鰓金龜幼蟲對植物根系分泌物的趨性反應

2.2.1 華北大黑鰓金龜幼蟲對不同植物根系分泌物的觸角電位反應

華北大黑鰓金龜幼蟲對37種根系分泌物的電生理反應試驗結果表明（圖4），華北大黑鰓金龜幼蟲對于不同根系分泌物的觸角電位反應存在明顯差異。其中，對于4甲基2氧戊酸、 鄰二甲苯、2丁烯酸、對羥基苯甲酸、十二烷、十四烷、肉豆蔻酸、棕櫚酸甘油酯、環己六醇等9種化合物的反應較明顯（電位反應值均達到0.1左右），這些化合物中4甲基2氧戊酸引起的觸角電位反應值最高（達到0.29左右）。

2.2.2不同植物根系分泌物對華北大黑鰓金龜爬行時間的影響

將上述能引起較強觸角電位反應的9種化合物置于直管試驗裝置中對華北大黑鰓金龜幼蟲進行誘集，試驗結果表明，對羥基苯甲酸對華北大黑鰓金龜幼蟲引誘效果最好（圖5），試蟲向其爬行20 cm僅需要（81±2）s，其次為十二烷，為（83±3）s。棕櫚酸甘油酯誘集時幼蟲爬行最慢，爬行20 cm需要133 s，顯著長于其他8種化合物誘集時幼蟲的爬行時間（P<0.05），說明其引誘效果較差。

2.3華北大黑鰓金龜幼蟲對CO2與植物根系分泌物混合物的趨性反應

2.3.1 華北大黑鰓金龜對CO2與根系分泌物的趨性選擇

華北大黑鰓金龜幼蟲對根系分泌物與1.5%CO2的趨性選擇試驗結果（圖6）表明，幼蟲除對環己六醇趨向性顯著強于1.5%CO2，對其他8種化合物和CO2間的趨性選擇沒有顯著差異（P>0.05），表明1.5%的CO2與絕大多數的植物根系分泌物之間對于試蟲的誘集性無顯著差異。

2.3.2 華北大黑鰓金龜對CO2與根系分泌物混合物的趨性選擇

華北大黑鰓金龜幼蟲對根系分泌物與添加CO2后混合物的雙向選擇試驗結果（圖7）表明，其明顯更喜歡加入CO2的根系分泌物，且對6種添加CO2后的根系分泌物的趨向性顯著（P<0.05）高于單純的根系分泌物，其中，4甲基2氧戊酸、環己六醇、

鄰二甲苯與CO2混合后對試蟲的誘集 效果極顯著高于相應化合物（P<0.01）;說明CO2對根系分泌物引誘試蟲具有顯著的增效作用。

2.3.3 CO2與根系分泌物的混合物對華北大黑鰓金龜幼蟲引誘爬行時間的影響

圖8結果顯示，將CO2添加到 9種植物根系分泌物中后均能夠縮短幼蟲趨向混合物爬行20 cm所需要的時間。其中，十二烷和對羥基苯甲酸添加CO2后幼蟲爬行時間分別縮短20 s和24 s，與單一根系分泌物差異顯著（P<0.05），而十四烷、4甲基2氧戊酸、環己六醇和鄰二甲苯添加CO2后幼蟲爬行時間分別縮短39、29、30 s和36 s，與不添加CO2差異極顯著（P<0.01）。4甲基2氧戊酸在加入CO2氣體后幼蟲的趨向爬行時間最短，爬行20 cm僅需58 s。

3結論與討論

本研究通過觸角電生理反應和行為生測試驗，初步探索了CO2對大黑鰓金龜幼蟲的引誘作用，并比較了不同濃度下幼蟲的反應差異，試驗結果表明，低濃度（0.75%）的CO2對于華北大黑鰓金龜幼蟲具有引誘作用，且隨著CO2濃度的增加，對試蟲的引誘效果也越強。此結論與張鑫鑫等[26]對暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜的研究結果基本一致，表明植食性蠐螬對低濃度的CO2有明顯的趨向性。目前針對玉米根螢葉甲、Ctenicera destructor等多種土壤昆蟲定位寄主根系的研究也表明，昆蟲主要利用CO2來定位寄主植物的根[19]。也有研究認為，CO2僅在昆蟲寄主根系的定位過程中發揮輔助作用，如Zhang等[30]的研究認為CO2僅導致為害三葉草的淺黃根瘤象運動和搜索行為的變化，而并非是直接定位三葉草位置的信號;植物根系分泌物在某些土壤昆蟲對寄主植物定位過程中發揮主導作用[20]。通過本研究也可以發現，植物根系分泌物如4甲基2氧戊酸、十二烷、環己六醇、十四烷、鄰二甲苯、對羥基苯甲酸、棕櫚酸甘油酯、2丁烯酸、肉豆蔻酸等化合物無論在觸角電位反應還是趨性行為反應中，均對蠐螬表現出較強的刺激活性。因此，我們推測這些化合物可能在華北大黑鰓金龜幼蟲識別寄主植物根系的過程中也發揮作用。此外，部分根系分泌物還具有驅避和抑制作用，它們在植物根受到破壞后被釋放，可以阻止或減少食根昆蟲對寄主植物根的取食[19]。還有研究認為，增加CO2濃度后，咀嚼式口器的昆蟲為獲得足夠的氮素營養會增加取食[31]。

Doane等的研究表明，植物根系附近土壤中CO2的濃度大約為1.5%[29]。在華北大黑鰓金龜幼蟲對1.5% CO2與9種植物根系分泌物的雙向選擇試驗中發現，除環己六醇外，對1.5% CO2與其他8種化合物間的趨性選擇并無顯著差異。對多種土壤害蟲的研究表明，CO2作為植物根釋放量最大的氣體[32]，對土壤害蟲具有遠距離的引誘作用[33]，而寄主植物根系分泌物則對華北大黑鰓金龜幼蟲有近距離的引誘作用[16]。本文通過幼蟲的行為選擇和爬行時間的測定試驗可知，CO2可增強根系分泌物對華北大黑鰓金龜幼蟲的引誘效果，同時縮短其趨向爬行時間。因此，我們推測CO2作為非特異的化學信號，開啟或者增強了華北大黑鰓金龜幼蟲在土壤中對寄主植物根系的搜索行為，主要由于植物根系附近CO2濃度較沒有根系的土壤中濃度要高，其指引幼蟲向植物根系定向運動，在接近根系后植物根系分泌物開始發揮引誘作用，引導蠐螬等地下害蟲定位并取食植物根部。這與淺黃根瘤象、甘藍地種蠅、五月鰓金龜Melolontha melolontha 等土壤害蟲對CO2和植物根系的定位搜索行為類似[19-20，24]，即“CO2 是地下害蟲覓食行為的觸發器”。

本試驗主要探究了CO2對于華北大黑鰓金龜幼蟲定位寄主植物根系過程中的作用，結果表明，CO2對華北大黑鰓金龜幼蟲有引誘或引導作用，且可以增強其對植物根系分泌物的趨向行為，此研究結果為探討華北大黑鰓金龜幼蟲對寄主根系的定位機制奠定了基礎，也為華北大黑鰓金龜幼蟲的綠色防控提供了新的思路。但是，本研究僅僅針對單一根系分泌物及其與CO2混合后對幼蟲的吸引作用進行了研究，對于多種根系分泌物的混合物以及其與CO2混合后，對大黑鰓金龜幼蟲的引誘作用及其作用程度等尚需開展深入研究。另外，本試驗采用的CO2濃度約等于植物根系附近土壤中的CO2濃度。但事實上，由于CO2是無處不在的，作物地下塊根、塊莖、花生莢等也是土壤害蟲主要為害的部位，其呼吸強度會高于其他根系，產生的CO2可能更多;還有土壤微生物釋放的CO2等，都有可能對于土壤昆蟲定位植物根系的行為產生影響，這些因素也有待后續開展進一步研究。

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