黃連根腐病發(fā)生與根際土壤、根莖內(nèi)生、葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化關(guān)系

唐濤 袁斌 王帆帆 郭杰 郭曉亮 段媛媛 游景茂

摘要

為了探討細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與黃連根腐病發(fā)生的關(guān)系，本文分析了兩個不同地點健康和染病黃連的根莖、葉內(nèi)生細(xì)菌和根際土壤細(xì)菌的組成和差異。結(jié)果顯示，黃連根莖、葉片和根際土壤樣品中根際土壤細(xì)菌群落多樣性最豐富，根莖內(nèi)生菌次之。在所有樣品中，主要的優(yōu)勢菌門為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes和綠彎菌門Chloroflexi。相較于健康黃連組樣品，染病黃連根際土壤、根莖和葉片樣品中多個菌屬細(xì)菌相對豐度發(fā)生顯著改變，如Vibrionimonas，乳桿菌屬Lactobacillus和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas等，表明可能與黃連根腐病的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。此外，RDA分析表明，伯克氏菌屬Burkholderia、全噬菌屬Holophaga和雷爾氏菌屬Ralstonia與黃連根際土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮、pH有顯著相關(guān)性。本研究分析了兩個不同地點的健康和染病黃連根際、葉片內(nèi)生細(xì)菌和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，為綜合分析黃連根腐病的成因和機(jī)制提供了參考。

關(guān)鍵詞

黃連;根腐病;細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);高通量測序;多樣性

中圖分類號：

S435.675

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020648

Relationships between the occurrence of rootrot and the change in the community structure of rhizosphere soil bacteria， rhizome and leaf endophytic bacteria of Coptis chinensis

TANG Tao1，YUAN Bin2，WANG Fanfan1，GUO Jie1，GUO Xiaoliang1，

DUAN Yuanyuan1，YOU Jingmao1*

（1. Institute of Chinese Herbal Medicines， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Enshi445000， China;

2. Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan430064， China）

Abstract

To explore the relationships between the bacterial community structure and the occurrence of Coptis chinensis root rot， the composition and diversity of endophytic bacteria in rhizomes， leaves and rhizosphere soils bacteria of healthy and infected Coptis chinensis in two different locations were analyzed. The results showed that the rhizosphere soil bacterial communities had the greatest diversity， followed by endophytic bacteria in rhizomes. Overall， the dominant phyla were Proteobacteria， Actinobacteria， Bacteroidetes and Chloroflexi. Compared with bacteria from the healthy C.chinensis samples， the relative abundance of bacteria of multiple genera detected in rhizosphere soil， rhizome and leaf samples from infected C.chinensis changed significantly， for example Vibrionimonas， Lactobacillus， Sphingomonas， etc.， suggested that these bacteria might be related to the occurrence of C.chinensis root rot. In addition， the RDA analysis showed that Burkholderia， Holophaga， Ralstonia， etc. were significantly correlated with organic matter， available nitrogen and pH value of rhizosphere soil. This study analyzed the composition and diversity of endophytic bacteria in rhizomes， leaves， and bacteria in rhizosphere soil of C.chinensis from two different locations， and provided a theoretical basis for the comprehensive analysis of the causes and mechanisms of C.chinensis root rot.

Key words

Coptis chinensis;rootrot;bacterial community structure;highthroughput sequencing;diversity

黃連Coptis chinensis為毛茛科Ranunculaceae黃連屬Coptis多年生草本植物，以根莖入藥，具有廣泛抗菌、抗病毒和抗氧化作用[1]。此外，黃連常用作糖尿病降糖和抗腫瘤的藥物[2]。最新研究表明，黃連解毒湯中的活性物質(zhì)能通過多靶點、多通路治療新型冠狀病毒肺炎[3]。恩施土家族苗族自治州是黃連的主產(chǎn)區(qū)之一，總種植面積在5 000 hm2左右，總產(chǎn)量2 600 t[4]。然而，隨著種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和連續(xù)多年栽培導(dǎo)致利川等地黃連不明原因根腐病發(fā)生嚴(yán)重，造成大面積減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重影響了黃連的產(chǎn)量、質(zhì)量和農(nóng)戶的種植熱情。有報道稱鐮刀菌 Fusarium spp.是黃連根腐病病原真菌之一[5]，本文前期研究分離到耬斗菜莖點霉 Phoma aquilegiicola為病原真菌之一。黃連根腐病病原菌種類多，具體病因復(fù)雜，防控難度較大。

近年來，眾多研究表明根際土壤微生物區(qū)系變化是影響中藥材種植連作障礙的重要因素[6]，微生物在土壤 根際 植物之間形成了一個植物與環(huán)境相聯(lián)系的動態(tài)組合，而根際微生物組成和多樣性的改變會影響土壤微生態(tài)功能，破壞土壤 根際 植物之間的微生物動態(tài)平衡，間接影響作物生長[7]。相關(guān)研究表明，植物在受到病原菌侵染后，植物根際土壤、莖稈以及葉際微生物群落結(jié)構(gòu)都會發(fā)生變化。劉海洋等[8]對黃萎病棉田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，重病棉田土壤真菌OTU數(shù)量、豐度均高于輕病或無病田，而真菌多樣性降低。羅路云等[9]報道，南瓜葉際細(xì)菌群落α多樣性隨著葉片白粉病病情等級的增加呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。 本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對兩個不同地點的健康、染病黃連的根莖、葉片內(nèi)生細(xì)菌和根際土壤細(xì)菌的組成及多樣性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步分析黃連根腐病成因和發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)，這對黃連產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1樣品采集

所有樣品于2019年10月采集于恩施州利川市箭竹溪鎮(zhèn)黃連種植基地（30°22′N，108°35′E，海拔1 300 m）。樣品采集自兩個不同地點，兩地距離在3 km以上。共分為12組：1）大道角村健康黃連根際土壤組，編號DJT;2）大道角村根腐病黃連根際土壤組，編號DBT;3）大道角村健康黃連根莖組，編號DJG;4）大道角村根腐病黃連根莖組，編號DBG;5）大道角村健康黃連葉片組，編號DJY;6）大道角村根腐病黃連葉片組，編號DBY;7）板廠坪村健康黃連根際土壤組，編號BJT;8）板廠坪村根腐病黃連根際土壤組，編號BBT;9）板廠坪村健康黃連根莖組，編號BJG; 10）板廠坪村根腐病黃連根莖組，編號BBG;11）板廠坪村健康黃連葉片組，編號BJY;12）板 廠坪村根腐病黃連葉片組，編號BBY。分別在同一壟的5個不同位置取樣混合均勻為一個樣品，取地下5～10 cm左右的根際土壤，根莖樣品和葉片樣品在取樣之后立即用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，每組樣品分別在不同位置采集3個樣品為試驗重復(fù)。樣品裝入無菌50 mL離心管中，低溫運輸至實驗室，在4℃條件下儲藏備用。

1.2土壤養(yǎng)分檢測

速效氮測定采用凱氏定氮儀法[10]，速效磷測定采用Bray法[11]，速效鉀測定采用醋酸銨 原子吸收光譜儀法[12]，pH測定采用點位法[13]，全氮采用凱氏法[14]，全磷采用堿熔法[15]，全鉀采用火焰原子吸收法[16]。

1.3樣品總DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MOBIO，美國）提取根際土壤樣品微生物總DNA。 根莖和葉片剪碎液氮處理磨碎后，采用PowerSoil ? DNA Isolation Kit提取總DNA。同時采用Nanodrop對DNA進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。采用通用引物338 F（5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA3′）和806 R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）對16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，并嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，使循環(huán)數(shù)盡可能低的同時，也保證同一批樣本的擴(kuò)增條件一致。PCR產(chǎn)物采用Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads試劑盒進(jìn)行磁珠純化回收。

1.4文庫制備與上機(jī)測序

采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)檢測合格后，使用 Illumina Miseq 平臺測序，委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.5測序數(shù)據(jù)處理和OTU聚類分析

采用 Illumina MiSeq 平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端（pairedend）測序，運用 QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：∥qiime.org/）識別疑問序列， 采用USEARCH（v5.2.236，http：∥www.drive5.com/usearch/）檢查并剔除嵌合體序列，獲得每個樣品的有效序列。采用 UCLUST 序列比對工具對前述獲得的序列按97%的序列一致性進(jìn)行歸并和 OTU（operational taxonomic unit）劃分，并選取每個 OTU 中豐度最高的序列作為該 OTU 的代表序列。將豐度值低于全體樣本測序總量 0.001%（十萬分之一）的 OTU 去除，并將去除了稀有OTU 的豐度矩陣用于后續(xù)的一系列分析。

1.6菌群組成及差異分析

使用 QIIME 軟件和 R 軟件，獲取每個樣本在門和屬水平的物種組成和豐度分布情況，并繪制成柱狀圖。根據(jù)所有樣本在屬水平的物種組成及豐度信息，選取豐度排名前50 的屬，根據(jù)其在每個樣本中的豐度信息，從物種和樣本2個層面進(jìn)行聚類，采用 R 軟件制作熱圖。通過 R 軟件，對屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（PCA），并且以二維圖像描述樣本間的自然分布特征。使用 Mothur 軟件，調(diào)用 Metastats的統(tǒng)計學(xué)算法，對門和屬水平的各個分類單元在組之間的序列量（即絕對豐度）差異進(jìn)行兩兩比較檢驗。

1.7不同樣品細(xì)菌組成的NMDS分析

非量度多維尺度分析（NMDS）是通過對樣本距離矩陣作降維分解，簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，從而在特定距離尺度下描述樣本的分布特征。與PCA分析不同，NMDS分析不依賴于特征根和特征向量的計算，而是通過對樣本距離進(jìn)行等級排序，使樣本在低維空間中的排序盡可能符合彼此之間的相似距離的遠(yuǎn)近關(guān)系（而非確切的距離數(shù)值）。因此，NMDS分析不受樣本相似距離數(shù)值的影響，僅考慮彼此之間的大小關(guān)系，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的數(shù)據(jù)，排序結(jié)果可能更穩(wěn)定。NMDS是距離值的秩次（數(shù)據(jù)排名）信息的評估，圖形上樣本信息僅反映樣本間數(shù)據(jù)秩次信息的遠(yuǎn)近，而不反映真實的數(shù)值差異，橫縱坐標(biāo)軸并無權(quán)重意義，橫軸不一定比縱軸更加重要。NMDS整體降維效果由 （Stress）進(jìn)行判斷。NMDS結(jié)果的應(yīng)力值越小越好，一般認(rèn)為當(dāng)該值小于0.2時，NMDS分析的結(jié)果較可靠。

1.8細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系分析

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性采用R軟件包進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis， RDA）。RDA分析是將樣本和環(huán)境因子反映在同一個二維排序圖上，箭頭連線之間的夾角表示相關(guān)性，銳角為正相關(guān)，鈍角為負(fù)相關(guān)。夾角越小，相關(guān)性越高。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2019和Prism 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗（ttest， P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1健康黃連和根腐病黃連根際土壤養(yǎng)分變化

如表1所示，2個不同地點健康黃連根際土壤pH顯著高于根腐病黃連根際土壤（P <0.05），此外，健康黃連根際土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、全磷、全氮均顯著高于根腐病黃連根際土壤（P<0.05）。但是速效鉀和全鉀含量在2個不同地點表現(xiàn)不一致，在大道角村樣品中根腐病黃連根際土壤速效鉀含量顯著高于健康黃連根際土壤（P<0.05），全鉀含量沒有顯著差異。板廠坪村樣品中根腐病黃連根際土壤速效鉀含量和全鉀含量均顯著低于健康黃連根際土壤（P<0.05）。這表明土壤pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、全磷、全氮含量可能與黃連根腐病發(fā)生有一定聯(lián)系。

2.2健康黃連和根腐病黃連根際土壤、根莖、葉片樣品的α多樣性分析

對健康黃連和根腐病黃連根際土壤、根莖、葉片樣品采用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序，去噪后用于后續(xù)分析的有效序列共6 082 093條，各樣品序列信息詳見表2。

對所有樣品細(xì)菌α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析表明，根腐病黃連根際土壤、根莖、葉片樣品的豐富度指數(shù)（observedspecies， Chao1）普遍高于對應(yīng)的健康黃連樣品，僅根際土壤樣品無顯著差異，這表明根腐病黃連根莖、葉片樣品的豐富度高于對應(yīng)的健康黃連樣品。從種群多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）的差異可以看出，根腐病黃連根際土壤、根莖、葉片樣品與對應(yīng)的健康黃連樣品細(xì)菌種群多樣性指數(shù)差異并不明顯，有病樣高于健康樣品，也有健康樣品高于根腐病樣，多數(shù)沒有顯著差異（表3）。總體上看，根際土壤樣品種群豐富度和多樣性大于根莖樣品，根莖樣品種群豐富度和多樣性大于葉片樣品。

2.3測序深度和OTU聚類分析

測序結(jié)果經(jīng)稀釋曲線（rarefaction curve）檢查顯示合理，12組共36個樣品測序結(jié)果中包含了大多數(shù)細(xì)菌類群，測序深度覆蓋了試驗樣品中所有測序?qū)ο螅究梢苑从硺悠分薪^大多數(shù)的細(xì)菌多樣性信息。從花瓣圖可以看出，黃連根際土壤細(xì)菌群落豐富度最高，均在800～1 000個OTUs，其次是根莖樣品，約有300～600個OTUs，黃連葉片樣品細(xì)菌群落豐富度最低，均在100～300個OTUs（圖1）。此外，12組樣品共有的OTU只有4個，這說明各個樣品間細(xì)菌群落組成相差較大。

2.4不同樣品的細(xì)菌物種組成

如圖2所示，根際土壤、根莖和葉片樣品細(xì)菌組成在門水平上的豐富度差異較大， 根際土壤樣品相對豐度前5的菌群依次為變形菌門Proteobacteria（27.94%～48.43%）、酸桿菌門Acidobacteria（11.45%～26.78%）、放線菌門Actinobacteria（8.08%～13.17%）、綠彎菌門Chloroflexi（4.14%～16.52%）、 擬桿菌門Bacteroidetes（4.44%～7.71%）;根莖樣品相對豐度前5的菌群依次為變形菌門（62.66%～74.18%）、放線菌門（10.43%～18.47%）、擬桿菌門（4.20%～9.90%）、酸桿菌門（1.75%～3.05%）、綠彎菌門（0.26%～1.29%）;葉片樣品相對豐度前5的菌群依次為變形菌門（64.15%～88.05%）、放線菌門（0.73%～21.12%）、擬桿菌門（6.49%～21.12%）、綠彎菌門（0.26%～1.29%）、厚壁菌門Firmicutes（0.23%～7.02%）。相同地點相同部位根腐病和健康黃連樣品相比較，細(xì)菌菌群組成差異不明顯，但各菌門相對豐度差異明顯，如大道角村根腐病黃連根際土壤樣品較健康黃連根際土壤樣品變形菌門豐度顯著上升，酸桿菌門和綠彎菌門豐度顯著下降（P<0.05）。

為了更直觀地展示所有根腐病和健康黃連樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，根據(jù)所有樣品在屬水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，繪制了相對豐度前20屬的相對豐度堆積圖。如圖3所示，各樣品屬水平細(xì)菌組成差異較大，其中土壤樣品細(xì)菌多樣性更豐富，前20屬細(xì)菌相對豐度僅占10%左右。其次為黃連根莖樣品，前20屬細(xì)菌相對豐度占40%左右。黃連葉片樣品細(xì)菌多樣性最差，前20屬細(xì)菌相對豐度占70%左右。土壤樣品、根莖樣品和葉片樣品之間細(xì)菌組成差異明顯，而土壤樣品、根莖樣品和葉片樣品內(nèi)部差異較小。黃連根際土壤樣品細(xì)菌組成復(fù)雜多樣，相對豐度較高的屬為全噬菌屬Holophaga、嗜酸棲熱菌屬Acidothermus、Pseudolabrys和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas等。黃連葉片樣品細(xì)菌組成最簡單，相對豐度較高的屬為甲基桿菌屬 Methylobacterium、鞘氨醇單胞菌屬、雷爾氏菌屬Ralstonia和薄層菌屬Hymenobacter等。黃連根莖樣品細(xì)菌組成與葉片樣品比較相似，相對豐度較高的屬為鞘氨醇單胞菌屬、伯克氏菌屬Burkholderia、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium和異根瘤菌屬Allorhizobium。

2.5不同樣品細(xì)菌組成差異性及與根腐病發(fā)生關(guān)聯(lián)性分析

為進(jìn)一步分析各細(xì)菌群落與黃連根腐病發(fā)生的關(guān)系，選取相對豐度前10的細(xì)菌群落分析各處理間細(xì)菌群落的差異與黃連根腐病發(fā)生的關(guān)聯(lián)。如圖4 所示，健康黃連樣品與染病黃連樣品的部分細(xì)菌菌群相對豐度差異明顯。在兩個不同地點根際土壤樣品中，全噬菌屬和Pseudolabrys的相對豐度均為染病黃連根際土壤樣品高于健康黃連根際土壤樣品（圖4a）;在兩個不同地點黃連葉片樣品中，Vibrionimonas和乳桿菌屬Lactobacillus的相對豐度均為染病黃連葉片樣品低于健康黃連葉片樣品，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度均為染病黃連葉片樣品高于健康黃連葉片樣品（圖4b）;在兩個不同地點黃連根莖樣品中，伯克氏菌屬的相對豐度均為染病黃連根莖樣品低于健康黃連根莖樣品，慢生根瘤菌屬和貪噬菌屬Variovorax的相對豐度均為染病黃連根莖樣品高于健康黃連根莖樣品（圖4c）。而其他菌屬在兩地不同樣品中的差異不一致。兩組樣品染病組癥狀相同，因此推測在大道角村和板廠坪村健康黃連根際土壤樣品和染病黃連根際土壤樣品中相對豐度變化趨勢相同的菌群更有可能與黃連根腐病發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。

2.6不同樣品細(xì)菌組成的NMDS分析

如圖5所示， 總體上看所有樣品大致聚集于3個區(qū)域，分別為大道角的根際土壤和根莖樣品、板廠坪的根際土壤和根莖樣品、兩地的黃連葉片樣品。兩地黃連根際土壤和根莖樣品分布較為集中，而與葉片樣品距離較遠(yuǎn)，說明黃連根際土壤樣品細(xì)菌群落與根莖樣品細(xì)菌群落親緣關(guān)系較近，根莖樣品細(xì)菌群落中部分菌群可能直接來源于根際土壤。相同地點相同部位不同染病狀態(tài)的樣品區(qū)分不明顯，而不同采樣地點的樣品區(qū)分明顯，這表明地域因素對黃連細(xì)菌群落組成影響較大，是影響黃連各樣品細(xì)菌群落組成的主要因素。而是否染病對樣品細(xì)菌群落組成的影響相對較小。

2.7細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

利用RDA分析不同地點健康黃連和染病黃連根際土壤細(xì)菌主要差異菌群與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)系，結(jié)果如圖6所示，黃連根際土壤中土壤有效氮和pH與伯克氏菌屬Burkholderia、全噬菌屬Holophaga、雷爾氏菌屬Ralstonia和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas顯著正相關(guān)。黃連根際土壤中有機(jī)質(zhì)含量與嗜酸棲熱菌屬Acidothermus顯著相關(guān)。

3討論

黃連根際土壤樣品中細(xì)菌群落主要為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門，這一結(jié)果與前人關(guān)于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的測序分析結(jié)果相同[17-18]。但與宋旭紅等[19]所測石柱縣黃連根際土壤微生物結(jié)果不盡相同，這可能是因為采樣地點的差異造成的。微生物種群的豐富度和多樣性在土壤質(zhì)量、 功能和土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[20]。在一定程度上，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可以反映出土壤質(zhì)量的變化。有研究表明，土壤微生物種群豐富度和多樣性的降低可能與連作障礙[21]和植株抗病能力[18]有一定關(guān)系。本研究中，健康黃連根際土壤樣品與感染根腐病黃連土壤樣品細(xì)菌群落多樣性并沒有顯著差異，但健康黃連根際土壤樣品與感染根腐病黃連土壤樣品的部分菌群的相對豐度存在明顯差異。在門水平上，酸桿菌門和綠彎菌門在健康黃連根際土壤樣品中相對豐度顯著高于感染根腐病黃連土壤樣品，變形菌門和擬桿菌門在健康黃連根際土壤樣品中相對豐度顯著低于感染根腐病黃連土壤樣品。

從黃連根標(biāo)土壤、根莖和葉片樣品中相對豐度前10的屬來看，全噬菌屬、慢生根瘤菌屬和貪噬菌屬等的相對豐度與黃連根腐病的發(fā)生呈正相關(guān)。Vibrionimonas、乳桿菌屬和伯克氏菌屬等的相對豐度與黃連根腐病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。鞘氨醇單胞菌屬能提高植物抗逆性，常被視作植物益生菌[22]。在染病黃連葉片樣品中鞘氨醇單胞菌屬相對豐度高于健康黃連葉片樣品，這可能是因為染病的逆環(huán)境因素刺激了其在葉片中的積累。這也提示我們，后續(xù)研究黃連根腐病生防菌篩選工作時，不僅要關(guān)注和黃連根腐病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)的相關(guān)菌群，也要重點關(guān)注部分染病樣品中豐度較高的有益菌群。謝學(xué)文等就從番茄根際土壤中篩選出番茄疫霉 Phytophthora capsici Leonian的拮抗菌[23]。此外，α多樣性分析表明相同地點相同部位健康樣品和染病樣品之間菌群結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)為根莖樣品和葉片樣品差異大于根際土壤樣品差異。相關(guān)菌群可能通過分泌物促使植物發(fā)病，也可能通過降解土壤中有機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生某種抑制病原生長的物質(zhì)，從而減緩病害的發(fā)生[24]。此外，測序發(fā)現(xiàn)黃連根莖樣品和葉片樣品中細(xì)菌群落豐富度和多樣性顯著低于黃連根際土壤樣品。這可能是由于黃連內(nèi)部某些物質(zhì)具有一定抑菌作用，因為黃連本身就有解毒抗菌的作用。李陽波等研究發(fā)現(xiàn)黃連根須浸提液對細(xì)菌有一定抑制作用[25]，這應(yīng)該也是相同原理。在分析染病根際土壤養(yǎng)分時發(fā)現(xiàn)，染病黃連根際土壤樣品有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、全磷、全氮均顯著高于健康黃連根際土壤。同時我們在調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)戶在種植過程中大量使用化肥，這可能也是黃連根腐病嚴(yán)重的一個重要原因。在分析根莖樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，慢生根瘤菌屬和異根瘤菌屬相對豐度很高。 慢生根瘤菌屬和異根瘤菌屬能與植物互利共生通過生物固氮為植物提供養(yǎng)分[26]。在大豆等豆科植物中根瘤菌能寄生植物形成根瘤，在黃連種植過程中也發(fā)現(xiàn)在須根上有類似根瘤的存在。這是首次有關(guān)黃連根瘤菌的報道，當(dāng)然慢生根瘤菌屬和異根瘤菌屬是否發(fā)揮固氮作用需要進(jìn)一步研究。

此外，本研究僅分析了染病后黃連根際土壤、根莖和葉片樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，對于染病樣本真菌群落結(jié)構(gòu)的變化需要進(jìn)一步研究。宋旭紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)黃連根腐病植株土壤中子囊菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門相對豐度顯著高于健康黃連植株，而接合菌門、囊球菌門的相對豐度顯著低于健康黃連植株。丹參紅葉病病株根區(qū)土細(xì)菌數(shù)量較健株減少41.3%，真菌和放線菌數(shù)量分別較健株增156.6%和189.5%[27]。也有研究表明真菌與豆科植物根部病害的發(fā)生關(guān)系密切，是潛在的土壤生物指示因子[28]。這些都說明根際土壤和植物體內(nèi)真菌和細(xì)菌都與植物病害的發(fā)生有一定關(guān)系。

總之，本研究通過對兩個不同地點黃連根際土壤、根莖、葉片樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析表明：在細(xì)菌多樣性上，黃連根際土壤樣品>根莖樣品>葉片樣品。在所有樣品中，主要的優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和綠彎菌門。相較于健康黃連組樣品，染病黃連根際土壤、根莖和葉片樣品中多個菌屬細(xì)菌相對豐度發(fā)生顯著改變，如Vibrionimonas、乳桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等可能與黃連根腐病的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。此外，RDA分析表明，伯克氏菌屬、全噬菌屬和雷爾氏菌屬與黃連根際土壤有機(jī)質(zhì)、有效氮、pH有顯著相關(guān)性。這些都為黃連根腐病防治提供了理論依據(jù)，同時也為黃連根腐病生物防治等提供了研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]馬伯艷， 李寒， 李云鳳， 等. 黃連及其有效成分降糖作用的研究進(jìn)展及量效關(guān)系[J]. 中成藥， 2019， 41（12）： 2970- 2973.

[2]馬國琴， 劉東玲. 黃連藥理研究進(jìn)展[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)， 2019（10）： 97- 99.

[3]黃浪浪， 王建安， 徐驲， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃連解毒湯治療新型冠狀病毒肺炎機(jī)制研究[J]. 中藥材， 2020， 43（3）： 779 -785.

[4]唐春梓， 劉海華， 廖朝林， 等. 湖北恩施地道藥材黃連的發(fā)展歷史與開發(fā)前景[J]. 寧夏農(nóng)林科技， 2011， 52（12）： 191- 192.

[5]伍曉麗， 王鈺， 劉飛， 等. 黃連根腐病鐮刀菌屬病原真菌鑒定[J]. 中國中藥雜志， 2020， 45（6）： 1323-1328.

[6]余妙， 蔣景龍， 任緒明， 等. 西洋參根腐病發(fā)生與根際真菌群落變化關(guān)系研究[J]. 中國中藥雜志， 2018， 43（10）： 2038-2047.

[7]張淑婷， 周利華， 趙文卓. 植物內(nèi)生細(xì)菌對植物健康的作用[J]. 植物醫(yī)生， 2020， 33（1）： 6 -11.

[8]劉海洋， 王偉， 張仁福， 等. 黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤中的真菌群落特征分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 52（3）： 455- 465.

[9]羅路云， 張卓， 金德才， 等. 南瓜白粉病不同病情等級下葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[J]. 植物病理學(xué)報， 2017， 47（5）： 688- 695.

[10] 莎娜， 張三粉， 駱洪， 等. 兩種土壤堿解氮測定方法的比較[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技， 2014（6）： 25 -26.

[11] 宋濤， 樸世領(lǐng)， 陳旸， 等. 蘋果梨園土壤pH和有效磷的變化[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報， 2018， 40（3）： 9 -15.

[12] 安家琦， 范鵬志， 張鈺， 等. 用原子吸收分光光度計測定土壤速效鉀含量[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)， 2020， 40（11）： 46 -47.

[13] 王瑞琨. 用電位法測定土壤pH值[J]. 山西化工， 2018， 38（3）： 64 -65.

[14] 劉燕. 《土壤質(zhì)量 全氮的測定 凱氏法》的方法改進(jìn)[J]. 化工管理， 2020（14）： 45-46.

[15] 郭鑫， 陳魏， 張及亮， 等. 土壤磷含量的測定方法[J]. 檢驗檢疫學(xué)刊， 2019， 29（2）： 108-110.

[16] 朱波， 倪俊， 高麗， 等. 土壤全磷全鉀同時測定方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 46（15）： 110-111.

[17] HUANG Junsheng， HU Bin， QI Kainin， et al. Effects of phosphorus addition on soil microbial biomass and community composition in a subalpine spruce plantation [J]. European Journal of Soil Biology， 2016， 72： 35-41.

[18] TAN Yong， CUI Yinshan， LI Haoyu， et al. Rhizospheric soil and root endogenous fungal diversity and composition in response to continuous Panax notoginseng cropping practices [J]. Microbiological Research， 2017， 194： 10-19.

[19] 宋旭紅， 王鈺， 李隆云， 等. 石柱黃連根腐病根際土壤細(xì)菌微生態(tài)研究[J]. 中國中藥雜志， 2017， 42（7）： 1304-1311.

[20] KENNEDY A C， SMITH K L. Soil microbial diversity and the sustainability of agricultural soils [J]. Plant Soil， 1995， 170（1）： 75-86.

[21] WU Xiong， LI Zhigang， LIU Hongjun， et al. The effective of longterm continuous cropping of black pepper on soil bacterial communities as determined by 454 pyrosequencing [J/OL]. PLoS ONE， 2015， 10（8）： e0136946. DOI： 10.1371/journal.pone.0136946.

[22] 繆作清， 李世東， 劉杏忠， 等. 三七根腐病病原研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39（7）： 1371-1378.

[23] 謝學(xué)文， 趙昱榕， 孫雪瑩， 等. 番茄疫霉根腐病生防菌的分離鑒定及其防治效果[J].植物病理學(xué)報， 2020， 50（5）： 610-617.

[24] 朱菲瑩， 張屹， 肖姬玲， 等. 生物有機(jī)肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化及西瓜枯萎病的調(diào)控[J]. 微生物學(xué)報， 2019， 59（12）： 2323-2333.

[25] 李陽波， 何林衛(wèi)， 張薇， 等. 黃連須根浸提液對土壤微生物及酶活性的影響[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（11）： 4205-4210.

[26]? FERNANDO S G， EDSON C S， PAULO H P， et al. Nitrogen recovery from fertilizer and use efficiency response to Bradyrhizobium sp. and Azospirillum brasilense combined with N rates in cowpeawheat crop sequence [J/OL]. Applied Soil Ecology， 2021， 157： 103764. DOI： 10.1016/j.apsoil.2020.103764.

[27] 段佳麗， 舒志明， 薛泉宏， 等. 丹參紅葉病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2013， 24（7）： 1991-1999.

[28] 陸曉菊， 官會林， 張正蕓， 等.三七連作根際土壤微生物區(qū)系的16S rRNA系統(tǒng)遺傳多樣性[J]. 微生物學(xué)報， 2015， 55（2）： 205-213.

收稿日期：2020-12-06修訂日期：2021-01-04

基金項目：

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合防治重點實驗室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室開放基金（2020ZTSJJ6）;湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2020-620-003-001）;恩施州研發(fā)計劃（D20190015）;湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所青年基金（2020ZYCJJ03）

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