羊肚菌菌蓋干腐病病原菌鑒定及培養特性研究

黃慧 張曉勇 鄭歡 蔡青苡 羅佳佳 羅凱 李樹江 楊友聯

摘要

菌蓋干腐病是羊肚菌Morchella spp.出菇后發生最嚴重的病害之一，常給羊肚菌生產造成較大損失。為明確引起貴州六盤水地區羊肚菌菌蓋干腐病致病菌種類，采用單孢分離法從六盤水地區3個羊肚菌栽培點的菌蓋干腐病樣品上分離到9個菌株。基于形態學及ITS和LSU基因序列分析將9個菌株鑒定為長孢卵單隔孢霉Diplospora longispora。培養特性研究表明，該菌最適的培養基為PCA，最適氮源為蛋白胨與硝酸銨，最適碳源為葡萄糖與麥芽糖，菌絲生長及孢子萌發最適溫度為15～25℃，最適pH為6～10;當溫度超過30℃菌絲即停止生長，孢子無法萌發。

??關鍵詞

羊肚菌;菌蓋干腐病;長孢卵單隔孢霉;系統鑒定;培養特性

中圖分類號：

S436.461

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020537

Identification and cultural characterization of Diplospora longispora associated with pileus rot disease on cultivated morel

HUANG Hui1，ZHANG Xiaoyong1，ZHENG Huan1，CAI Qingyi1，LUO Jiajia1，

LUO Kai2，LI Shujiang1，YANG Youlian1*

（1. School of Biological Sciences and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui553004， China;

2. Liupanshui Academy of Agricultural Sciences， Guizhou Province， Liupanshui553004， China）

Abstract

Pileus rot disease widely occurs and often causes serious yield losses of cultivated morel. In order to identify the pathogen of pileus rot disease， nine strains were obtained by singlespore isolation in three cultivation sites of Liupanshui city. Based on morphological characteristics and ITS and LSU sequence analysis， the nine strains were identified as the same species， Diplospora longispora. Cultural characterization showed that PCA was the optimal medium for colony growth， the optimal nitrogen sources were peptone， ammonium nitrate， and the optimal carbon sources were glucose and maltose. The best temperature and initial pH ranges for spore germination and mycelial growth were 15 25℃ and 6 10， respectively. When the temperature exceeded 30℃， the mycelium stopped growing and the spores failed to germinate.

Key words

morel;pileus rot disease;Diplospora longispora;phylogenetic analysis;cultural characteristics

羊肚菌Morchella spp. 是一類珍稀的大型食用真菌，其營養豐富，味道鮮美，深受消費者青睞。人工種植的羊肚菌普遍發生各種真菌性病害，常常造成較為嚴重的經濟損失。目前，在羊肚菌上報道的真菌病害主要有由變紅鐮刀菌Fusarium incarnatum和木賊鐮刀菌F.equiseti交互引起的爛柄病（stipe rot）[1]、長毛擬青霉Paecilomyces penicillatus引起的白霉病（white mold disease）[2]、長孢卵單隔孢霉Diplospora longispora引起的菌蓋干腐病（pileus rot disease）[3]及曲霉Aspergillus sp.引起的羊肚菌白腐病（morel white rot）[4]。

近年來，隨著貴州六盤水市羊肚菌種植面積不斷擴大，菌蓋干腐病已成為種植中最大的風險點之一。菌蓋干腐病屬低溫型病害，在每年的2月—4月，溫度10～20℃、濕度較大的拱棚下暴發較為嚴重。該病先在羊肚菌菌蓋上形成白色絨毛狀小菌落，后隨著病害部位擴大而逐漸萎縮、干枯和穿孔，國內學者還將其稱為霉菌性枯萎病[5]。

前人對羊肚菌菌蓋干腐病已有一定研究，但在病原菌的系統分類鑒定上還存在很多不足，對病原菌的生長特性也還缺乏相關的研究，不利于該病的田間識別及防治。本研究對六盤水羊肚菌主產區廣泛發生的菌蓋干腐病樣品進行病原菌的分離與鑒定，并研究了病原菌的最佳生長條件等，旨在為羊肚菌菌蓋干腐病田間準確識別及防治提供理論支持。

1材料與方法

1.1病害調查與病原菌分離

于2018年和2019年羊肚菌收獲季節分別從貴州六盤水鐘山區大河堡、六枝特區巖腳和水城縣果布戛3個羊肚菌規模化種植基地進行該病的調查和取樣。 在每個栽培點隨機選取3個小拱棚進行菌蓋干腐病發病率統計。將采集的菌蓋干腐病羊肚菌單獨裝入保鮮袋中帶回實驗室，用單孢分離法從各點感病羊肚菌病害部位分離得到9個菌株（表1）。菌株在PDA試管斜面上培養15 d后置于4℃ 保藏備用。

1.2病原菌形態學鑒定

將菌株接種于PDA（potato dextrose agar）平板，置于25℃進行活化培養。用6 mm直徑打孔器從菌落邊緣打取菌餅接入另一個PDA平板中央，設置3次重復，在25℃自然光照下培養10 d后測量菌落直徑，觀察菌落特征。收集菌落表面菌絲和子實體，以蒸餾水為載浮劑制備臨時裝片，置于顯微鏡下觀察菌株形態特征。

1.3病原菌分子鑒定

將供試菌株以三點法接種于PDA平板培養基上，置于25℃恒溫培養15 d后刮取菌絲，用改良的CTAB法提取菌株DNA[6]。擴增的目的序列分別為內轉錄間隔區（ITS）和28S 核糖體大亞基序列（rDNALSU）2個基因片段。選用真菌rDNAITS 通用引物ITS1和ITS4擴增ITS片段，選用引物LROR和LR5 擴增大亞基LSU片段，PCR反應體系及擴增程序參考Maharachchikumbura等[7]的方法。擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京擎科生物技術有限公司進行純化和測序。將所得序列在GenBank中運用BLAST進行同源序列檢索，查找與其相似性較高的菌株，用MEGA X軟件以鄰接法（neighborjoining， NJ）構建系統發育樹，確定菌株的分類地位。

1.4菌株致病性鑒定

取新鮮、健康無損傷的尖頂羊肚菌Morchella conica子實體，用75%乙醇噴霧菌蓋后，用無菌水輕輕沖洗3次，無菌吸水紙吸干水珠后放置于超凈工作臺中吹干表面水分。菌柄切口處用無菌濕棉球包住后平置于塑料盒內，吸取50 μL 106個/mL孢子懸浮液滴于菌蓋凹坑內，每朵接種1點。試驗重復3次。接種后蓋好蓋子放置于20℃黑暗培養5 d觀察發病情況。

1.5菌株生長和孢子萌發的最佳培養溫度及pH

用6 mm打孔器打取菌落邊緣菌餅單點接種于PDA平板中央，并分別置于0、5、10、15、20、25、30℃和35℃等8個溫度環境中，10 d后測量菌落直徑。用1 mol/L的NaOH或HCl分別調節PDA培養基pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12和13等10個梯度，將打取的菌餅（d=6 mm）單點接種于不同pH的PDA平板中央，置于25℃下培養10 d后測量菌落直徑。試驗設置3次重復。用移液槍吸取100 μL 106個/mL孢子懸浮液加入PDA平板，均勻涂布后分別置于上述8個溫度環境中;取100 μL孢子懸浮液均勻涂布于上述不同pH的PDA平板上，放置于25℃自然光照條件下進行培養。2 d后將不同溫度和pH處理下的涂布平板置于Olympus BX51顯微鏡10×10低倍鏡下隨機選取10個視野統計分生孢子萌發情況。每個溫度和pH設置3次重復。

1.6菌株最佳培養基配方、碳源和氮源篩選

（1）最佳培養基篩選。設置PDA培養基、查氏培養基CHM（NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 ·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2）[8]、平板計數瓊脂培養基PCA（胰蛋白胨5 g，酵母膏粉2.5 g，葡萄糖1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.2）、合成低營養瓊脂培養基SNA（KH2PO40.2 g，KCl 0.2 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖0.2 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，自然pH）[9]和沙氏固體培養基SDA（蛋白胨10 g，瓊脂20 g，葡萄糖40 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH）[10]來研究不同培養基對菌株菌絲體生長的影響。用6 mm打孔器在活化菌株菌落邊緣打取菌餅分別接種于上述培養基平板中央，置于25℃自然光照條件下培養10 d后測量各平板內菌落直徑（mm），試驗設置3次重復。

（2）碳源、氮源篩選。以查氏培養基CHM為基礎培養基，分別將其中的蔗糖以同質量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油替換，即得不同碳源的培養基;將查氏培養基中的硝酸鈉以同質量的硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨和蛋白胨替換配制成不同氮源的培養基。置于25℃的自然光條件下培養10 d后測量各處理平板上的菌落直徑（mm），試驗設置3次重復。

1.7數據處理與分析

采用DPS v7.05軟件進行數據方差分析和多重比較。

2結果與分析

2.1病害調查與菌株形態學鑒定

調查發現，幾乎所有的羊肚菌種植地都發現感染菌蓋干腐病的子實體，但各地發病情況不一，發病率普遍在5%～15%，部分發病較重的小拱棚內可達20%以上，給人工種植羊肚菌的產量和質量造成較為嚴重影響（表1）。

菌蓋干腐病主要發生于菌蓋，菌柄上少見。該病發病初期在羊肚菌菌蓋上形成5～10 mm不規則白色絨毛狀霉斑，后逐漸擴大，侵染部位萎縮、干枯甚至形成10～20 mm的大穿孔（圖1a～c）。在PDA平板上，菌株在25℃下培養10 d菌落直徑31～35 mm，邊緣整齊，表面干燥，雪白色絨毛狀，有明顯輪狀花紋，背面淡黃色（圖1d）。與梯棱羊肚菌于平板內對峙培養下，菌株早期可釋放抑制羊肚菌菌絲生長的代謝產物，形成明顯的抑菌圈，后病原菌菌絲侵入羊肚菌菌落內（圖1e）。分生孢子梗透明，細長，棍棒狀，大小為（23.25～75.20） μm ×（1.91～3.72） μm，平均（56.22±15.2） μm×（3.22±0.43） μm? （n=30），頂端形成1～2串分生孢子鏈，分生孢子脫落后留下明顯的凸痕（圖1f～g）。 分生孢子全為鏈生，透明，棍棒狀或長檸檬形，大小為（16.25～22.18） μm×（3.68～5.79） μm，平均 （20.41±4.95） μm ×（4.78±0.63） μm（n=30），常有圓形或橢圓形疣點，1～3個隔（多為1個），隔處稍縊縮（圖1h～k）。基于形態特征分析，初步將9個菌株鑒定為長孢卵單隔孢霉Diplospora longispora Matsushima T.[10]。

2.2菌株分子生物學鑒定

將本研究獲得的9株菌株的ITS和LSU序列與從GenBank中下載的10個同源性較高的序列，以Paecilomyces niphetodes CBS 229.73和P.niphetodes CBS 364.76作為外類群，用MEGA X軟件構建NJ系統發育樹（圖2）。9個菌株都與長毛擬青霉P.penicillatus和長孢卵單隔孢霉以96%的支持率聚為一支。結合形態特征，長毛擬青霉的安瓿瓶狀小梗一般3～5個聚合為掃帚狀，分生孢子為無隔的單細胞，橢圓形或梨形，大小僅為（6～7.5） μm×（4.0～5.0） μm，與長孢卵單隔孢霉差異非常大[10 11]。因此基于形態學及rDNAITSLSU基因序列分析，將9個菌株鑒定為Diplospora longispora Matsushima T.

2.3菌株致病性測定

將菌株接種于健康羊肚菌菌蓋上，20℃下培養5 d后，接種處形成5～10 mm左右的白色霉層，被侵染的菌褶出現壞死、干枯，與田間早期癥狀一致（圖3）。再次挑取白色霉層進行分離，所得菌株菌落及形態特征與原菌株一致。

2.4培養溫度和pH對菌株生長及孢子萌發的影響

不同培養溫度和pH對病原菌生長及孢子萌發的影響均達到顯著水平（圖4）。

5～25℃菌絲均可生長，孢子可萌發，在15～25℃處理下菌絲生長和孢子萌發率差異不顯著，溫度超過30℃菌絲停止生長，孢子不萌發（圖4a）。說明該菌對冷涼環境適應性較強，菌絲生長及孢子萌發最適溫度為15～25℃，不耐30℃以上的高溫。該菌對培養基pH的要求不嚴格，在pH 4～12范圍內孢子可部分萌發，菌絲可正常生長， pH 6～11適宜菌絲生長，尤以pH 7時生長最快;分生孢子 在pH 6～10時萌發率顯著高

于其他處理（圖4b）。說明該菌孢子萌發的最適pH為6～10。

2.5碳源、氮源和不同培養基對病原菌生長的影響

不同氮源、碳源及培養基處理對病原菌生長的影響達到顯著水平（圖5）。該菌在以蛋白胨與硝酸銨為氮源的培養基中生長速率顯著高于其他氮源處理，說明該菌的生長對氮素要求較高（圖5a）。菌株在以葡萄糖和麥芽糖為碳源的培養基中的菌落直徑顯著大于其他處理（圖5b）;不同培養基顯著影響菌株生長，菌株在PCA培養基上的生長速率顯著高于其他培養基，沙氏培養基與PDA次之，在查氏培養基和合成培養基中生長速率最為緩慢，再次印證該菌生長對氮源需求較高（圖5c）。說明該菌最適氮源為蛋白胨與硝酸銨，最適碳源為葡萄糖與麥芽糖，最適生長培養基為PCA。

3討論

菌蓋干腐病也稱霉菌性枯萎病，是羊肚菌人工種植中危害最為嚴重的病害之一。廣泛栽培的梯棱羊肚菌M.importuna、六妹羊肚菌M.sextelata和七妹羊肚菌M.eptimelata等都可感染此病[12]，該病害在早春羊肚菌發菇和收獲期間傳播迅速，常造成較為嚴重的產量、質量損失。本研究中，9個菌株經ITS和LSU序列聯合分析與長毛擬青霉和長孢卵單隔孢霉以極高支持率聚為一支，這與前人用ITS序列分析所得出的結果一致[3]。長毛擬青霉和長孢卵單隔孢霉都是在20世紀70年代根據形態特征確立的，二者除了都有鏈生的分生孢子外，其他形態特征差異極大。長毛擬青霉的分生孢子鏈基部是一個安瓿瓶狀的小梗，且3～5個聚合形成掃帚狀的分生孢子梗，而長孢卵單隔孢霉的分生孢子梗細長，頂部直接著生1～2串鏈狀分生孢子，無小梗結構;其次，二者最明顯的差異在于分生孢子結構，長毛擬青霉的分生孢子為無隔的單細胞，橢圓形或梨形，大小僅為（6.0～7.5） μm×（4.0～5.0） μm，而長孢卵單隔孢霉的分生孢子為棍棒狀或長檸檬形，大小為（16.25～22.18） μm×（3.68～5.79） μm，有1～3個隔將孢子分隔為2～4個細胞[10 11]。基于形態學及ITS和LSU序列分析，將本研究的9個菌株鑒定為長孢卵單隔孢霉。

在癥狀上，羊肚菌菌蓋干腐病與He等報道的白霉病高度相似，如發病條件及早期菌蓋上雪白色的霉層，以及后期病斑干枯、收縮直至穿孔等特征[2]。有學者認為羊肚菌白霉病就是菌蓋干腐病，He等也通過ITS序列分析發現長毛擬青霉與長孢卵單隔孢霉高度同源[2]，但部分研究指出僅憑ITS序列分析而未經嚴格的形態學比較即將病原菌鑒定為長毛擬青霉，其鑒定過程缺乏嚴謹性和科學性[3 5]。研究已證實擬青霉屬Paecilomyces是一個復合屬，形態相近的兩個種其DNA堿基序列可能差異很大[13]。從目前在GenBank上發布的Diplospora屬相關序列來看，這個屬極有可能也是復合屬，已報道的長孢卵單隔孢霉及其兩個亞種與Diplospora屬已登記的其他5個種的ITS堿基序列差異很大，從理論上來講可能并不都屬于Diplospora屬，但由于已報道的種極少，難以建立系統性的分類標準，更多分類細節還需進一步研究予以驗證。

在生產中發現，從未種植過羊肚菌的大棚內也會暴發菌蓋干腐病。長孢卵單隔孢霉的來源可能有兩個。He等認為長孢卵單隔孢霉是羊肚菌的內生菌，他們從健康的梯棱羊肚菌中分離到長孢卵單隔孢霉，且分離頻率高達10%[3]。但不排除他們的分離材料已感染了病原菌，但還未表現癥狀。我們在大量純培養的羊肚菌平板上未發現類似長孢卵單隔孢霉的污染菌落。從GenBank和USDA中已報道的菌株來看，長孢卵單隔孢霉還可從豪豬糞便、人類皮膚、芋Colocasia antiquorum var. esculenta和代兒茶Dichrostachys cinerea等多種材料上分離得到[14 15]，說明長孢卵單隔孢霉在環境中有一定分布，在條件適宜時即可導致羊肚菌發生菌蓋干腐病。

本研究發現，長孢卵單隔孢霉對不同pH的適應性極強，菌絲在pH為6～11的條件下都可較快生長，孢子萌發率也高于50%，而多數羊肚菌栽培種菌絲及子實體生長最適pH為6.5～7.5，pH超過8即顯著抑制菌絲生長和子實體形成[16]，說明傳統的石灰土壤消毒法不但不能有效抑制該菌在土壤中的潛藏，還會造成羊肚菌減產。本研究表明，長孢卵單隔孢霉在30℃以上的溫度下其菌絲停止生長，孢子也失去萌發性能，說明該菌對高溫非常敏感，在生產中可以利用這一特征來防治該菌對羊肚菌的侵染，如利用火焰消毒法對栽培地進行高溫消毒，降低羊肚菌栽培土壤中病害初侵染源的數量。杜習慧等調查發現，在野外火燒跡地里很容易發現野生羊肚菌，且第一年大量出菇， 在隨后的2～3 年里逐漸消失[17]，極有可能與高溫火燒改變病原菌在土壤里的種群分布有直接的關系，下一步還需進一步研究。

參考文獻

[1]GUO Mengpei， CHEN Kang， WANG Gangzheng， et al. First report of stipe rot disease on Morchella importuna caused by Fusarium incarnatum， F.equiseti species complex in China [J]. Plant Disease， 2016， 100（12）：2530.

[2]HE Xiaolan， PENG Weihong， MIAO Renyun， et al. White mold on cultivated morels caused by Paecilomyces penicillatus [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2017， 364（5）： 1-5.

[3]HE Peixin， LI Congcong， CAI Yingli， et al. First report of pileus rot disease on cultivated Morchella importuna caused by Diplospora longispora in China [J]. Journal of General Plant Pathology， 2017， 84（1）： 65 69.

[4]余苗， 尹琪， 何培新. 羊肚菌白腐病病原菌的分離與鑒定[J]. 北方園藝， 2020（7）： 142-145.

[5]劉偉， 蔡英麗， 何培新， 等. 羊肚菌栽培的病蟲害發生規律及防控措施[J]. 食用菌學報， 2019， 26（2）：128 -134.

[6]張穎慧， 魏東盛， 邢來君， 等. 一種改進的絲狀真菌DNA提取方法[J]. 微生物學通報， 2008， 35（3）：466 -469.

[7]MAHARACHCHIKUMBURA S S N， GUO Liangdong， CAI Lei， et al. A multilocus backbone tree for Pestalotiopsis， with a polyphasic characterization of 14 new species [J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）：95- 129.

[8]周曉榕， 高翔， 王建國， 等. 營養和農藥對蠟蚧輪枝菌生長發育的影響[J]. 植物保護， 2006， 32（5）： 23- 25.

[9]張曉勇， 李樹江， 王亮， 等. 山茶灰斑病病原菌鑒定及防治藥劑初步篩選[J]. 植物保護， 2019， 45（4）： 209 215.

[10] MATSUSHIMA T. Icones microfungorum a matsushima lectorum [M]. Japan： Kobe， 1975： 61.

[11] SAMSON R A. Paecilomyces and some allied Hyphomycetes [J]. Studies in Mycology， 1974， 6：1-119.

[12] 劉偉， 蔡英麗， 何培新， 等. 羊肚菌栽培的病蟲害發生規律及防控措施[J]. 食用菌學報， 2019， 26（2）：128 134.

[13] INGLIS P， TIGANO M. Identification and taxonomy of some entomopathogenic Paecilomyces spp. （Ascomycota） isolates using rDNAITS sequences [J]. Genetics and Molecular Biology， 2006， 29（1）：132-136.

[14] U.S. National Library of Medicine. National center for biotechnology information [EB/OL]. [2021 01 30]. https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov.

[15] United States Department of Agriculture. Agricultural research service： fungal databases [EB/OL]. [2021 01 30]. https：∥nt.arsgrin. gov/fungaldatabases.

[16] 賀新生. 羊肚菌生物學基礎、菌種分離制作與高產栽培技術[M]. 北京： 科學出版社， 2017： 82.

[17] 杜習慧， 趙琪， 楊祝良. 羊肚菌的多樣性、演化歷史及栽培研究進展[J]. 菌物學報， 2014，33（2）：183 197.

收稿日期：2020-10-13修訂日期：2020-11-27

基金項目：

貴州省特色重點實驗室建設項目（黔教合KY 字[2017]012）;2019年貴州省大學生創新創業訓練計劃（20195201506）;六盤水市科技計劃（520202016HK07，5202020180307）;2018年度六盤水師范學院項目“微生物學教學團隊”（LPSSYjxtd201802）

* 通信作者

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