細胞遺傳學檢測方法對MLL基因異常兒童急性白血病的診斷意義

孫恒娟， 杜成坎， 李 紅， 柳 敏， 張 泓

（1.上海市兒童醫院 上海交通大學醫學院附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040；2.上海市兒童醫院 上海交通大學醫學院附屬兒童醫院血液科，上海 200040）

急性白血病（acute leukemia，AL）是兒童常見惡性疾病，約占15歲以下兒童惡性腫瘤的25～30%。AL患兒各種基因重排較普遍，混合譜系白血病（mixed linage leukemia，MLL）基因重排是其中之一，MLL基因又稱KMT2A、ALL1或HRX基因，位于11號染色體長臂2區3帶（11q23），可見于15.0%～20.0%的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和2.5%～5.0%的急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患兒，在嬰幼兒AL中占75%[1]。伴MLL基因重排的AL大多惡性程度高，緩解率低，對化療不敏感，患兒預后不佳，是AL的一種獨特亞型。本研究對MLL基因異常的AL患兒進行細胞遺傳學分析，比較常規細胞遺傳學（conventional cytogenetics，CC）檢測方法（染色體G顯帶）和熒光原位雜交（ fluorescence in situ hybridization，FISH）技術診斷MLL基因異常、MLL基因重排、染色體11q23異常AL患兒的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年6月—2021年6月上海市兒童醫院收治的初發AL患兒404例，其中男228例、女176例，年齡2個月～15歲。根據《血液病診斷及療效標準》[2]，確診ALL患兒308例、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患兒96例。

1.2 儀器和試劑

Chang Medium MF/BMC細胞培養試劑（美國Irvine Scientific公司）、Sigma-AlorichGs500染液（美國Sigma-Alorich公司）、VysisFISH探針（美國Abbot公司）、BX51和BX61顯微鏡（日本Olympus公司）、CDS5細胞生成干燥箱（美國Thermotron公司）、Thermobrite雜交儀（美國Leica公司）。

1.3 CC法染色體核型分析

采用24 h和48 h培養法制備染色體樣本，根據人類細胞基因組學國際命名體系（2016）描述染色體核型。嚴格按照試劑盒和儀器說明書要求進行檢測。

1.4 FISH技術分析

采用直接法獲取細胞，采用雙色分離探針變性、雜交過夜后，用6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，DAPI）復染細胞核。使用熒光顯微鏡在DAPI/FITC/Texas Red三色濾光鏡下觀察間期熒光雜交信號，以紅綠黃色（1R1G1F）熒光信號為MLL基因重排陽性。每例至少分析300個間期細胞，不計重疊細胞，計算陽性細胞比例。嚴格按照試劑盒和儀器說明書要求操作。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，計數資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.001為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒一般資料

采用FISH技術檢出MLL基因異常（重排陽性）患兒57例（14.1%），其中男34例、女23例，年齡2個月～14歲；57例患兒中， ALL患兒40例，其中≤12個月患兒5例（ 12.5%）；AML患兒17例，其中≤12個月患兒4例（ 23.5%）；有10例患兒初發時白細胞計數≥ 50×109/L ，其中ALL患兒7例（ 17.5%）、 AML患兒3例（ 17.6%）。CC法檢出MLL基因異常患兒27例（6.7%）。2種方法MLL基因異常檢出率差異有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 CC法染色體核型分析結果

40例ALL患兒中，染色體核型正常16例，因培養細胞生長不良不能分析1例，非染色體11q23異常8例，染色體11q23異常15例。15例染色體11q23異常患兒中，單純數目異常（-11）1例，add(11)(q23)1例，明確MLL基因重排伙伴基因13例[t(4;11)(q21;q23)結構和數目異常7例、t(9;11)(p22;q23)4例、t(1;11)(p32;q23)1例、t(10;11)(p12;q23)1例]。見圖1。

17例AML患兒中，染色體核型正常3例，因培養細胞生長不良不能分析1例，非染色體11q23異常1例，染色體11q23異常12例。12例染色體11q23異常患兒中，add(11)(q23)1例，明確MLL基因重排伙伴基因11例[t(9;11)(p22;q23)3例（其中1例增加了1條8號染色體）、t(11;19)(q23;p13)3例（其中1例增加了1條8號染色體）、t(1;11)(q21;q23)3例、t(11;17)(p23;q25)1例、ins(11;11)1例]。見圖1。

圖1 異常染色體核型

2.3 FISH技術檢測結果

57例MLL基因重排陽性患兒均發現MLL基因探針信號異常。40例ALL患兒中，探針信號分離（1F1R1G）MLL基因重排17例，探針信號缺失（1F）8例，探針信號增加15例（13例3F，2例4F）；17例AML患兒中，探針信號分離（1F1R1G）MLL基因重排15例，探針信號增加（3F）2例。見圖2。

圖2 AL患兒MLL基因FISH技術檢測結果

3 討論

1979年，VAN DEN BERGHE等[3]首先報道了AML中存在11q23染色體異常，此后相關研究在多種血液系統惡腫瘤中發現存在11q23/MLL異常。MLL基因重排是造血系統惡性腫瘤常見的遺傳學改變，其易位形成的MLL融合蛋白可引起轉錄調控異常，誘導HOX、EPHA7、MEIS、PBX等下游目的基因異常表達，影響造血分化，導致白血病的發生[4]。MLL的伙伴基因有80多個，可以導致130余種不同的重排[5]，是此類白血病診斷和預后判斷的重要因素。

本研究404例AL患兒中，采用FISH技術檢出MLL基因異常57例，其中ALL患兒40例、AML患兒17例。40例ALL患兒中，MLL基因信號拷貝數異常23例，包括信號缺失8例、3拷貝13例、4拷貝2例；探針信號分離MLL基因重排17例，信號模式均為1R1G1F。17例AML患兒中，探針MLL基因信號3拷貝2例；探針信號分離MLL基因重排15例，其中典型異常信號（1R1G1F）10例，1G1F伴MLL基因3'端丟失、1G1F伴額外獲得1拷貝MLL基因3'端、2R1G1F伴額外獲得1拷貝MLL基因3'端、1R2F伴額外獲得1拷貝MLL基因、1G3F伴額外獲得1拷貝MLL基因5'端各1例，且這5例患兒探針均有MLL基因重排的現象，這種異常信號的復雜多樣化也可能是AML的不良預后因素之一。

本研究結果顯示，404例AL患兒中，FISH技術檢出MLL基因重排32例（7.9%）、CC法檢出24例（5.9%），與相關文獻MLL基因重排見于5%～10%的AL患兒結果一致[6]。染色體核型分析檢出的染色體11q23畸變包括易位、缺失、重復、插入，本研究明確11q23易位伙伴24例，以t（4；11）、t（9；11）、t（1；11）、t（11；19）染色體易位為主；t（4；11）、t（1；11）（p32；q23）、t（10；11） 均在ALL患兒中被檢出；t（1；11）（q21；q23）、t（11；19）、t（11；17）、ins（11；11）均在AML患兒中被檢出；t（9；11）、add（11）在ALL和AML患兒中均有檢出。非11q23克隆性染色體異常9例、正常核型19例、因培養細胞生長不良不能分析2例。ALL患兒共檢出染色體11q23異常15例，其中14例可以明確易位伙伴；1例數目異常，非11q23異常8例，1例因培養細胞生長不良不能分析，核型正常16例。AML檢出染色體11q23異常12例，均為結構異常，非11q23其他克隆性染色體異常1例，1例因培養細胞生長不良不能分析，染色體核型正常3例。15例ALL異常中，明確MLL基因重排和伙伴基因13例，其中t（4；11）7例、t（9；11）4例、t（10；11）1例、t（1；11）（p32；q23）1例。AML患兒共檢出染色體異常12例，明確MLL基因重排和伙伴基因11例，t（9；11）3例、t（1；11）（q21；q23）3例、t（11；19）3例，t（11；17）1例、ins（11；11）1例，在11q23/MLL基因重排患兒中有2例合并+8，與文獻報道的數目異常以三體8多見一致[7]。

綜上所述，FISH技術對MLL基因異常檢出率高于CC法，且檢測周期短、準確性高、敏感性強，但只能針對懷疑片段進行檢測，有一定的局限性；CC法是最基本的檢測方法，可以直觀地呈現MLL基因重排異常類型，并明確其伙伴基因，但不易發現MLL基因隱匿易位，有漏檢的可能。2種方法可優勢互補，在MLL基因異常AL的診斷中均有較大的價值。