改良碳青霉烯滅活試驗和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗鑒定腸桿菌目細菌產碳青霉烯酶型別的臨床價值

王 芳， 鄧燕燕， 林見敏， 王金金， 龔 倩， 黃聲雷

（1.復旦大學附屬中山醫院青浦分院檢驗科，上海 201700；2.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

碳青霉烯類藥物因其良好的細胞通透性和高度的酶穩定性，一度被認為是抗多重耐藥腸桿菌目細菌的最后“一道防線”[1]。但是隨著該類抗菌藥物在臨床的過度使用，碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE）在全球范圍內廣泛流行。全國細菌耐藥監測網歷年監測數據顯示，2014—2019年，我國臨床分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從4.8%上升至10.5%，對美羅培南的耐藥率從4.5%上升至10.9%；上海市碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的臨床分離率從18.9%快速攀升至28.7%[2]。腸桿菌目細菌對碳青霉烯類藥物最主要的耐藥機制是產生碳青霉烯酶。按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為絲氨酸酶（A類，以blaKPC為主）、金屬β-內酰胺酶（B類，以blaNDM為主）和絲氨酸碳青霉烯酶（D類，以blaOXA-48為主）三大類。不同類型碳青霉烯酶的分布具有地區、人群和細菌種類的差異性，我國臨床分離的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌產生的碳青霉烯酶分別以KPC和NDM型為主，少數菌株產OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[4]。《腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規范專家共識》[5]推薦改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）/乙二胺四乙酸碳青霉烯滅活試驗（ethylene diamine tetraacetic acidcarbapenem inactivation method，eCIM）和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗為臨床微生物實驗選擇性常規開展的檢測方法。本研究擬評估mCIM/eCIM和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗鑒定腸桿菌目細菌碳青霉烯酶型別的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2019年1月—2020年1月復旦大學附屬中山醫院青浦分院分離自住院患者臨床樣本的腸桿菌目細菌130株，其中CRE100株（肺炎克雷伯菌72株、大腸埃希菌18株、陰溝腸桿菌8株、黏質沙雷菌2株）；碳青霉烯類敏感腸桿菌目細菌30株，包括肺炎克雷伯菌15株、大腸埃希菌12株、黏質沙雷菌3株。

1.2 試劑和儀器

VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）。M-H瓊脂平板、哥倫比亞血平板（上海科瑪嘉公司），亞胺培南和美羅培南紙片（美國賽默飛世爾公司），黏菌素和替加環素微量肉湯稀釋板條（溫州康泰公司），乙二胺四乙酸二鈉和碳青霉烯酶抑制增強試劑（上海原科公司）。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定和體外藥物敏感性試驗 采用VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定藥敏儀對臨床分離株進行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗，參照美國臨床實驗室標準化協會M100-S28文件[6]標準判讀藥物敏感性試驗結果，頭孢哌酮-舒巴坦參照頭孢哌酮的標準。黏菌素和替加環素的藥物敏感性結果依據文獻[7]的要求進行判斷。質控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、（ATCC 35218）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。

1.3.2 mCIM/eCIM 按照美國臨床實驗室標準化協會M100-S28文件[6]要求進行mCIM/eCIM和結果判讀。質控菌株為肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-1705）、（ATCC BAA-1706）和（ATCC BAA-2146）。

1.3.3 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 將待測菌調制成0.5麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于M-H瓊脂平板，分別將4張10 μg/片的亞胺培南紙片（分別標記為A、B、C、D）貼于瓊脂上，紙片之間距離＞5 mm。B紙片上加初始濃度為0.1 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液10 μL，C紙片上加初始濃度為30 mg/L的3-氨基苯基硼酸（3-Aminophenylboric acid，APB）10 μL，D紙片上加EDTA和APB各10 μL。過夜孵育后量取抑菌圈直徑，如B紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，即可判斷該受試菌產B類碳青霉烯酶；如C紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，可判斷該受試菌產A類碳青霉烯酶；如僅D紙片比A紙片的抑菌圈≥5 mm，可判斷該受試菌同時產A類和B類碳青霉烯酶；如B、C和D紙片均比A紙片的抑菌圈＜5 mm，則判斷受試菌不產A類和B類碳青霉烯酶。質控菌株為肺炎克雷伯菌（ ATCC BAA-1705）、（ATCC BAA-1706）和（ATCC BAA-2146）。

1.3.4 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測KPC、NDM、OXA-48耐藥基因，通過測序對陽性擴增產物進行確認。 根據參考文獻[8]選取blaKPC、blaNDM和blaOXA-48的引物、PCR反應體系和條件，引物由生工生物工程（上海）技術有限公司合成并測序。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。以PCR結果為標準，比較2種方法鑒定不同碳青霉烯酶的效能。采用Kappa檢驗評價2種方法與PCR方法的一致性，Kappa值＜0.4表示一致性較差；0.4＜Kappa值≤0.8表示一致性較好；Kappa值＞0.8表示一致性極好。

2 結果

2.1 體外藥物敏感性試驗結果

CRE對黏菌素、替加環素、頭孢他啶-阿維巴坦、阿米卡星和磺胺甲噁唑-甲氧芐啶的耐藥率較低，分別為0%、2.3%、13.0%、50.4%、55.7%，對其他常用抗菌藥物的耐藥率均＞75%。

2.2 碳青霉烯類的耐藥基因分布

100株CRE中，檢出71株產KPC-2，23株產NDM-1，4株產NDM-5，1株產KPC-3，1株同時產KPC-2和NDM-1。72株肺炎克雷伯菌中，有70株僅產KPC-2。18株大腸埃希菌中，有13株產NDM-1，其中4株同時產KPC-2和NDM-1。見表1。

表1 100株CRE耐藥基因分布 株

2.3 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結果

以PCR結果為標準，對于72株產A類絲氨酸酶的菌株，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗可準確鑒定71株，敏感性為98.60%（71/72），特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.984。對于27株產B類金屬酶菌株和1株同時產A類絲氨酸酶和B類金屬酶的菌株，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗可全部準確鑒定；與PCR比較，Kappa值分別為1.000和0.560。見表2、表3。

2.4 mCIM和eCIM結果

以PCR結果為標準，對于72株產A類碳青霉烯酶的菌株，mCIM/eCIM可準確鑒定70株，其敏感性為97.22%，特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.969。對于27株產B類金屬酶菌株，mCIM和eCIM可準確鑒定26株，敏感性為96.30%，特異性為100%；與PCR比較，Kappa值為0.976。但mCIM和eCIM無法鑒定同時產A類和B類碳青霉烯酶的菌株。見表2、表3。

表2 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗與mCIM/eCIM結果比較 株

表3 2種方法檢測效能

3 討論

因為不同的抗菌藥物在體外對產不同類型碳青霉烯酶細菌的抗菌活性有差別，如頭孢他啶-阿維巴坦對產KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產金屬β-內酰胺酶菌株無抗菌活性[9]；美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-雷利巴坦對產KPC型碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對金屬β-內酰胺酶和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株無抗菌活性[9-11]。因此，準確而快速地鑒定CRE碳青霉烯酶的型別，對于臨床合理選擇抗菌藥物治療多重耐藥菌的感染，降低患者死亡率，控制醫院內感染和傳播流行具有重要的意義[8]。

由于細菌耐藥性具有遺傳復雜性，目前國際上檢測碳青霉烯酶的方法仍以表型方法檢測為主，而分子生物學方法通常作為篩選工具或作為傳統方法的補充[9]。微生物實驗室用于檢測碳青霉烯酶的常用表型方法有Carba NP試驗、mCIM/eCIM、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗、激光解吸電離飛行時間質譜等。其中Carba NP試驗結果判斷主觀性較強，對操作人員要求較高，且試劑需自配，有效期短[12]；質譜技術需要昂貴的質譜儀，且目前缺乏統一可行的操作方法[13]。eCIM與/mCIM聯合使用可以區分產金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌目細菌，成本低，操作簡單，結果易于解釋，適合大多數基層臨床實驗室開展。mCIM/eCIM聯合檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內酰胺酶的敏感性＞95%、特異性＞92%[9]。本研究結果顯示，mCIM/eCIM檢測產絲氨酸碳青霉烯酶的敏感性為97.22%，特異性為100%；檢測金屬β-內酰胺酶的敏感性為96.30%、特異性為100%，且與PCR結果的一致性較好，但eCIM的局限性是不能區分同時含有絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內酰胺酶的菌株。

有學者利用APB能抑制KPC型碳青霉烯酶的原理，建立了類似美國臨床實驗室標準化協會定義的使用紙片擴散法篩選產超廣譜β-內酰胺酶的方法，用于檢測產KPC型碳青霉烯酶的腸桿菌目細菌[14]。TSAKRIS等[15]在DOI等的研究結果基礎上增加金屬β-內酰胺酶的抑制劑EDTA，用于檢測金屬β-內酰胺酶，這種雙碳青霉烯酶抑制增強試驗，不僅能區分金屬β-內酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶，還能檢測同時產生2種碳青霉烯酶菌株，檢測單產KPC或金屬酶的敏感性均為100%，特異性分別為98.8%和100%。本研究結果顯示，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測單產KPC或金屬酶的敏感性分別為98.60%和100%，特異性均為100%，且和與PCR的一致性較好意，與DOI等[14]和TSAKRIS等[15]的研究結果一致。

2種方法各有局限：mCIM/eCIM檢測方法操作需要經過4 h的孵育時間，操作步驟較碳青霉烯酶抑制劑增強試驗繁瑣，且該檢測方法不能區分同時產絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內酰胺酶的菌株。碳青霉烯酶抑制劑增強試驗需要實驗室添置額外的試劑（如APB），成本較mCIM/eCIM高。

綜上所述，隨著CRE對抗菌藥物耐藥形勢日趨嚴峻，加強臨床微生物檢測能力，快速檢出耐藥菌株，是防控CRE的關鍵[16]。mCIM/eCIM和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內酰胺酶敏感性和特異性均超過95%，且成本較低，不同級別，尤其是基層醫療機構臨床微生物實驗室可以根據自身需求來選擇適合本實驗室的方法進行常規的CRE表型分型檢測。