TSI和TRAb在輔助診斷毒性彌漫性甲狀腺腫中的應用價值

胡 堯， 岑 屹， 張步月， 吳文清， 程 偉， 黃銘穎， 劉愛平， 關 明

（復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040）

毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves'disease，GD）是一種自身免疫性甲狀腺功能亢進疾病，通常累及眼、皮膚、骨骼和心臟[1]。促甲狀腺激素受體自身抗體（thyroid-stimulating hormone receptor antibody，TRAb）是GD診斷和預后判斷的標志物[2]。TRAb可分為3類：中性TRAb、抑制性TRAb和刺激性TRAb。刺激性TRAb即促甲狀腺免疫球蛋白（thyroid-stimulating immunoglobulin，TSI）[3]。根據TRAb的功能特點，TSI與促甲狀腺激素受體α-亞基上富含亮氨酸的重復序列結構域結合后，能激活甲狀腺細胞持續的信號轉導[4]。因此，特異性檢測TSI水平對GD的準確診斷具有重要意義。目前，TRAb的常規檢測方法是基于單克隆抗體的化學發光免疫測定法，靈敏度較高，臨床應用廣泛，但該方法不能區分不同類型的TRAb[5]。有研究發現，雙抗體夾心化學發光法可特異性檢測TSI[6]。為此，本研究擬在評價雙抗體夾心化學發光法檢測性能的基礎上探討TSI在GD診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年10月—2021年1月復旦大學附屬華山醫院GD患者126例（GD組），其中男31例、女95例，年齡（37.2±13.2）歲，包括初診患者41例、復診患者85例。另選取同期復旦大學附屬華山醫院其他甲狀腺疾病患者393例（對照組），其中男140例、女253例，年齡（42.1±16.0）歲，包括橋本甲狀腺炎79例、甲狀腺結節103例、甲狀腺功能減退癥96例、無毒性甲狀腺腫59例、甲狀腺囊腫56例。本研究經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 方法溯源性 采用IMMULITE 2000全自動化學發光免疫分析儀（德國西門子公司）及配套試劑（雙抗體夾心化學發光法）檢測TSI；該方法溯源至世界衛生組織（World Health Organization，WHO）第2代促甲狀腺受體抗體國際標準物質[由英國國家生物標準品和質控品研究所（the National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）持有，代碼為08/240]。廠商提供的TSI參考區間為＜0.55 IU/L。采用cobas 8000 e 801 全自動電化學發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發光法）檢測TRAb；該方法溯源至NIBSC第1代國際標準物質90/672。廠商提供的參考區間為＜1.75 IU/L。TSI和TRAb的參考區間均經臨床實驗室所在地區人群驗證通過。

1.2.2 精密度驗證 根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A3文件[7]要求，分別采用雙抗體夾心化學發光法和電化學發光法檢測2個水平的患者混合血清，每個水平重復測定5次，連續測定5 d，評估2種方法的重復性[變異系數（coefficient of variation，CV）]和總精密度（以CV表示），并與廠商聲明的性能指標進行比較。

1.2.3 線性范圍驗證 根據CLSI EP06-A文件[8]，分別選取處于廠商聲明的檢測范圍內的高、低水平臨床樣本各1份，將高水平樣本（H）與低水平樣本（L）按比例（L、3H+2L、2H+2L、2H+3L、H）進行稀釋，得到5份系列稀釋樣本，每份樣本重復測定3次，對數據進行多項回歸分析，得到一階、二階和三階多項式模型，對回歸方程每個非線性系數做t檢驗，判斷非線性系數與“0”的差異是否有統計學意義。要求任何確定為非線性的樣本非線性量均低于廠商建議的線性目標（±15%或±0.5 IU/L）。

1.2.4 2種方法的相關性評價 根據CLSI EP9-A3文件[9]，采用Pearson相關分析評估TSI與TRAb的相關性。根據CLSI EP12-A2文件[10]，采用Bland-Altman一致性分析評估雙抗體夾心化學發光法檢測TSI與電化學發光法檢測TRAb的一致性。比較TSI和TRAb的定性結果，對結果不一致的患者，由臨床醫生結合病史、其他實驗室檢查結果和甲狀腺超聲結果進行綜合判斷。采用Kappa檢驗評估GD組和對照組TSI與TRAb檢測結果的一致性。

1.3 統計學方法

使用SPSS 13.0軟件、MedCalc 18.2.1軟件和Excel 2007軟件進行統計分析。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價TSI和TRAb診斷GD的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精密度驗證結果

采用雙抗體夾心化學發光法檢測2個水平混合血清樣本中的TSI，分別為0.95和19.5 IU/L，s分別為0.036、0.683 IU/L，重復性分別為3.8%、3.5%，總精密度分別為4.1%、3.6%，均低于廠商聲明的重復性（4.8%、4.5%）和總精密度（5.8%、5.8%）。

采用電化學發光法檢測2個水平混合血清樣本中的TRAb，分別為1.5和21.0 IU/L，s分別為0.105、0.357 IU/L，重復性分別為7.0%、1.7%，總精密度分別為7.8%、2.0%，均低于廠商聲明的重復性（7.8%、2.0%）和總精密度（11.0%、2.6%）。

2.2 線性范圍驗證

廠商聲明的TSI和TRAb的線性范圍分別為0.1～40.0和0.8～40.0 IU/L。線性評估結果顯示，TSI的線性范圍為0.33～8.50 IU/L，低值（0.27 IU/L）與理論值的偏差高于廠商聲明（±15%），缺乏線性，最佳擬合回歸曲線呈拋物線形，對非線性范圍進行三階多項式非線性系數t檢驗，最佳擬合回歸曲線呈線性，見圖1（a）。TRAb的線性范圍為1.0～38.9 IU/L，且呈三項式最佳擬合線性回歸，見圖1（b）。TSI和TRAb線性范圍的驗證結果見表1。

圖1 線性范圍驗證

表1 TSI與TRAb線性范圍驗證

2.3 TSI與TRAb的相關性

Pearson相關分析結果顯示，TSI與TRAb呈正相關[Y=0.944 4X-0.668 3（r=0.930，P＜0.05）]。見圖2。

圖2 TSI與TRAb的相關性

2.4 TSI與TRAb的一致性分析

519例甲狀腺疾病患者中，TSI陽性228例（43.9%），TRAb陽性216例（41.6%）。Kappa檢驗結果顯示，TSI與TRAb的一致性較好（Kappa=0.83）。見表2。

表2 TSI與TRAb定性結果比較 例（%）

TSI與TRAb的總符合率為91.5%，但有44例患者檢測結果不一致。查閱臨床病歷資料，發現在28例TSI陽性、TRAb陰性的患者中，有19例是服用甲巰咪唑治療的GD患者；在16例TSI陰性、TRAb陽性的患者中，有2例為GD患者；有8例臨床診斷為良性甲狀腺結節或甲狀腺囊腫，游離甲狀腺素水平正常；有6例臨床診斷為橋本甲狀腺炎。TSI檢測結果與臨床診斷的總體符合率為95.7%（497/519）。TRAb檢測結果與臨床診斷結果的總體符合率為93.4%（485/519）。

GD組TSI和TRAb水平分別為5.25（1.75～17.10）和6.86（3.25～20.30）IU/L，對照組分別為0.80（0.80～1.88）、0.10（0.10～1.20）IU/L。Bland-Altman一致性分析結果顯示，對于GD組，雙抗體夾心化學發光法檢測TSI與電化學發光法檢測TRAb的平均偏差為1.5 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比為4%；對于對照組，2種方法的平均偏差為0.8 IU/mL，落在95%一致性界限外的百分比為4%。見圖3。

圖3 雙抗體夾心化學發光法檢測TSI與電化學發光法檢測TRAb的Bland-Altman一致性分析

2.5 TSI和TRAb鑒別診斷GD的效能

剔除治療后GD患者數據，采用ROC曲線分析TSI和TRAb鑒別診斷GD的效能。結果顯示，TSI診斷GD的曲線下面積（area under curve，AUC）（95%CI）為0.89（0.86～0.91），最佳臨界值為0.7 IU/L，敏感性為93.7%，特異性為85.1%，陽性預測值為94.0%，陰性預測值為86.0%；TRAb診斷GD的AUC（95%CI）為0.86（0.83～0.89），最佳臨界值為2.5 IU/L，敏感性為92.5%，特異性為86.7%，陽性預測值為92.0%，陰性預測值為85.0%。見圖4。

圖4 TSI和TRAb診斷GD的ROC曲線

3 討論

GD是甲狀腺功能亢進最常見的病因，GD的診斷通常基于甲狀腺功能亢進的臨床特征，包括心悸和怕熱出汗，以及GD的明顯特征，如眼眶病變和甲狀腺肢端肥大。根據GD的診斷標準，TRAb是一個有效的檢測指標，且應與甲狀腺素、三碘甲狀腺原氨酸和促甲狀腺激素聯合檢測[12]。以往放免法檢測的TRAb僅能反映GD患者體內存在針對促甲狀腺激素受體的自身抗體，不能反映這種抗體的功能，隨著TRAb檢測的敏感性和特異性的不斷改善，TRAb不僅可以用于GD患者治療效果的評估，還可用于GD的篩查[13]。

本研究結果顯示，在精密度方面，雙抗體夾心化學發光法檢測TSI較電化學發光法檢測TRAb表現出更好的性能。在線性驗證中，2種方法呈相似的低值高偏差的非線性，隨著分析物濃度的增加，出現拋物線線性反應，三項式曲線是其最佳擬合模型，與文獻報道[14]一致。原因可能是TRAb屬于自身抗體，具有異質性，在體外會產生低值非線性的稀釋現象。雙抗體夾心化學發光法檢測TSI與電化學發光法檢測TRAb之間呈高度正相關（r=0.930）。這是因為電化學發光法溯源至第1代國際標準物質（NIBSC代碼：90/672），可檢測所有類型的TRAb；而雙抗體夾心化學發光法溯源至第2代國際標準物質（NIBSC代碼：08/240），可特異性檢測TSI。根據廠商聲明的參考區間判斷，2種方法的總符合率為91.5%。

有研究結果顯示，對于未經治療的GD患者，TSI檢測結果與TRAb檢測結果之間一致性較好，但TSI對GD的診斷準確性更高[15-16]。TRAb檢測的主要問題是慢性甲狀腺炎伴甲狀腺功能減退患者可能會出現假陽性結果，其原因可能與這些患者體內存在中性TRAb或抑制性TRAb有關。TOZZOLI等[6]的研究結果顯示，橋本甲狀腺炎患者TRAb會出現假陽性結果，假陽性率為3.6%。本研究結果顯示，在2種方法檢測結果不一致的44例患者中，6例橋本甲狀腺炎患者的TSI結果均為陰性，Bland-Altman一致性分析結果與文獻報道[6，17]一致。因此，TSI在鑒別GD與橋本甲狀腺炎時更具特異性。一項多中心研究結果顯示，雙抗體夾心化學發光法檢測TSI的結果與TSI生物法測定結果的一致性更高，TSI可作為我國GD患者的診斷指標之一，建議與TRAb檢測聯合應用，以提高診斷的準確性；并建議建立不同地區人群相應的TRAb或TSI醫學決定水平參考區間，以達到最佳的GD臨床診斷性能[18]。由于人群、地區等的差異，不同研究中雙抗體夾心化學發光法檢測TSI與電化學發光法檢測TRAb的敏感性和特異性可能存在一定的差異。張利霞等[19]對1 367例甲狀腺疾病患者的研究結果顯示，臨床甲狀腺功能減退組、亞臨床甲狀腺功能減退組TSI陽性率高于正常對照組，說明除GD患者會出現TSI陽性外，其他甲狀腺疾病患者也會出現TSI陽性。鐘麗等[20]的研究結果顯示，TSI輔助診斷GD的敏感性為89.0%，特異性為94.7%。劉天琪等[21]采用與本研究相同的方法分別檢測了48例甲狀腺相關性眼病患者的TSI和TRAb，2個項目定性結果的符合率為89.5%。

綜上所述，雙抗體夾心化學發光法檢測TSI具有可靠的分析性能，且與電化學發光法檢測TRAb具有良好的相關性。TSI定量檢測有助于提高臨床對GD的診斷效率。