早期非小細胞肺癌患者血清氨基酸檢測的臨床意義

徐潤灝， 鄒 琛， 曹 蕓， 陳 風， 劉怡菁， 張舒林， 張 潔

（1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海 200001；2.上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200062；3.上海交通大學醫學院免疫學與微生物學系，上海 200025）

2020年，我國肺癌新發病例約為81.5萬，新增死亡病例約為71.5萬，分別較5年前增長了3.6%和11.9%[1]，其中85.0%為非小細胞肺癌患者（non-small cell lung cancer，NSCLC），有64.6%的患者確診時已處于晚期（臨床Ⅲ～Ⅳ期）[2]。肺癌患者的5年生存率會隨著肺癌的進展而降低，Ⅰ期患者的5年生存率可達92.4%，Ⅱ期為73.7%[3]，而Ⅲ期和Ⅳ期患者的生存率急劇下降，一些地區Ⅳ期肺癌患者的5年生存率僅為5.3%[4]。因此，早期診斷NSCLC對提高肺癌患者的整體生存率具有重要意義。

氨基酸代謝是肺癌患者血清差異表達代謝物富集最顯著的通路之一[5]，部分氨基酸有成為NSCLC診斷標志物的潛能。有研究結果顯示，NSCLC患者和健康人多種血清氨基酸水平有差異[6-11]。但這些研究未參照臨床分期對NSCLC患者進行區分，也未對早期和中晚期NSCLC患者的血清氨基酸水平進行比較。莫靚等[12]的研究結果顯示，不同臨床分期的NSCLC患者血清中包括氨基酸在內的多個小分子代謝物存在明顯差異。為此，本研究采用液相色譜串聯質譜（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）技術檢測NSCLC患者5類共14種氨基酸[非極性蛋白氨基酸：包括丙氨酸（alanine，Ala）、甘氨酸（glycine，Gly）、亮氨酸（leucine，Leu）、脯氨酸（proline，Pro）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、纈氨酸（valine，Val）、蛋氨酸（methionine，Met）；極性中性蛋白氨基酸，即酪氨酸（tyrosine，Tyr）；酸性蛋白氨基酸，即谷氨酸（glutamic acid，Glu）；堿性蛋白氨基酸：包括精氨酸（arginine，Arg）、組氨酸（histidine，His）、賴氨酸（lysine，Lys）；非蛋白氨基酸：包括瓜氨酸（citrulline，Cit）、鳥氨酸（ornithine、Orn）]水平，探討氨基酸在早期NSCLC輔助診斷中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年7月—2021年1月上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院確診的早期NSCLC患者64例（早期NSCLC組，其中男34例、女30例，年齡27～82歲；臨床分期Ⅰ期55例、Ⅱ期9例）、中晚期NSCLC患者55例（中晚期NSCLC組，其中男29例、女26例，年齡29～82歲；臨床分期Ⅲ期23例、Ⅳ期32例）。入組標準：經影像學和組織病理學檢查確診為原發性NSCLC，未經放療、化療和手術治療。另選取同期上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院確診為社區獲得性肺炎等肺部良性疾病患者65例（肺良性疾病組），其中男35例、女30例，年齡25～86歲。入組標準：經臨床診斷排除肺部惡性腫瘤可能，且無其他臟器重大疾病。以2020年10月—2021年1月上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院健康體檢者80名為正常對照組，其中男43名、女37名，年齡24～81歲。入組標準：經影像學檢查肺部未見明顯病變，無其他重大疾病，血糖、血脂、肝功能、腎功能等常規指標均無異常。所有研究對象均未服用免疫抑制劑和氨基酸類藥物，各組間年齡和性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院倫理委員會審查通過（批準號：2017205），所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 采用促凝管采集所有對象空腹靜脈血4 mL，30 min內2 685×g離心10 min，分離血清。在24 h內進行檢測的血清樣本冷藏（2～8 ℃）保存；無法及時檢測的樣本，吸取血清裝入離心管，冷凍（-80 ℃及以下）保存。

1.2.2 儀器和試劑 采用API3200MD三重四級桿質譜儀（美國ABSciex公司）、LC-20A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和氨基酸代謝譜分析試劑盒（上海可力梅塔生物醫藥科技有限公司）檢測Ala、Gly、Leu、Pro、Phe、Val、Met、Tyr、Glu、Arg、His、Lys、Cit、Orn，試劑盒中含氨基酸內標液、流動相添加劑A（主要成分為甲酸）、流動相添加劑B（主要成分為甲酸銨）、氨基酸轉化液（主要成分為正丁醇）、樣本稀釋液等。按試劑盒說明書配制內標提取液、流動相A（含0.3%流動相添加劑A和0.1%流動相添加劑B）、流動相B（95%甲醇，美國MERCK公司）。

1.2.3 樣本預處理 吸取20 μL待測血清樣本至離心管中，加入80 μL樣本稀釋液，16 000×g離心5 min。取10 μL稀釋后的樣本，加入內標提取液100 μL，渦旋混勻5 min，16 000×g離心5 min。取上清液50 μL，加入96孔板，50 ℃氮氣吹干。加入氨基酸轉化液500 μL，置于微孔板恒溫振蕩器中，60 ℃振蕩衍生反應30 min，60 ℃氮氣吹干。加入復溶液100 μL，繼續振蕩混勻10 min，直接進樣檢測。

1.2.4 氨基酸檢測條件 （1）色譜條件：分析柱為ACE Excel3 C18（3.0 mm×100 mm，英國ACE公司），柱溫40 ℃，梯度洗脫，流速為550 μL/min。（2）質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，離子源參數為霧化氣壓力50 psi、輔助加熱器壓力50 psi、氣簾氣壓力30 psi、碰撞氣壓力6 psi；離子源電壓5 000 V；離子源溫度500 ℃；使用多反應監測模式進行掃描分析。

1.2.5 腫瘤標志物檢測 采用cobas e801全自動電化學發光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發光法）檢測血清糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）和鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）水平。參考區間參照試劑說明書：CA 19-9為0～27 U/mL，CEA為0～4.7 ng/mL，CYFRA 21-1為0～3.3 ng/mL，SCC-Ag為0.5～2.7 ng/mL。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件及GraphPad 6.0軟件進行統計分析。采用K-S檢驗評估數據的正態性。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用二元Logistic回歸分析（逐步法）擬合出各項指標的最佳診斷組合，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標單項檢測和聯合診斷早期NSCLC的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組間血清14種氨基酸水平比較

與正常對照組相比，早期NSCLC組血清His、Lys水平降低（P＜0.05），血清Ala、Pro、Val、Glu、Cit、Orn水平升高（P＜0.05）。與肺良性疾病組比較，早期NSCLC組血清Ala、Leu、Pro、Val、Glu、His、Lys、Cit、Orn水平升高（P＜0.05）。與早期NSCLC組比較，中晚期NSCLC組血清Ala、Leu、Val、Glu、Lys水平降低（P＜0.05）。見表1。本研究結果與相關文獻結果的比較見表2。

表1 各組間血清14種氨基酸水平的比較

表2 本研究結果與相關文獻結果比較

2.2 各組間血清CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1、SCC-Ag水平比較

與正常對照組比較，早期NSCLC組血清CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1水平升高（P＜0.01）。與肺良性疾病組比較，早期NSCLC組血清CA 19-9、CYFRA 21-1水平升高（P＜0.01）。各組間血清SCC-Ag水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組間4種血清腫瘤標志物表達水平的比較

2.3 各項指標單項檢測和聯合檢測診斷早期NSCLC的效能

早期NSCLC組與正常對照組之間、早期NSCLC組與肺良性疾病組之間血清Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn水平均發生相同變化，因此將正常對照組和肺良性疾病組合并為非腫瘤組。ROC曲線分析結果顯示，在早期NSCLC組與非腫瘤組之間有差異的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）和3種腫瘤標志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）中，單項診斷早期NSCLC效能最高的項目為Cit，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.709，敏感性為81.25%，特異性為53.10%。采用二元Logistic回歸分析（逐步法）從9項指標中擬合出的最佳組合為Glu+Val+Cit+CYFRA 21-1，聯合檢測模型為：Y=1/[1+e-Logit（P）]，式中Logit（P）=0.006×Glu+0.007×Val+0.061×Cit+0.519×CYF RA 21-1-7.79。聯合檢測模型診斷早期NSCLC的AUC為0.808，敏感性為64.56%，特異性為88.28%。見表4、圖1。

表4 各項指標單項檢測和聯合檢測診斷早期NSCLC的效能

圖1 各項指標單項檢測和聯合檢測診斷早期NSCLC的ROC曲線

3 討論

本研究結果顯示，相對于正常對照者，早期NSCLC（臨床Ⅰ期和Ⅱ期）患者血清中非極性蛋白氨基酸Ala、Pro、Val和酸性氨基酸Glu水平較高（P＜0.05），堿性氨基酸His、Lys水平較低（P＜0.05）。目前，已有學者對NSCLC患者血液蛋白氨基酸譜進行了分析[6-10]，但結果相互矛盾（表2）。由于這些研究中各期NSCLC患者的比例不盡相同，且未對各期NSCLC進行分組比較，因此造成結果矛盾的原因可能是在NSCLC的不同階段，患者血液中的氨基酸水平發生不同變化所致；也可能與血液樣本的其他成分有關。KALUARACHCHI等[13]認為，受血小板的影響，血漿樣本中的部分氨基酸會大量丟失或發生組分改變。

本研究結果還顯示，早期NSCLC患者血清中非蛋白氨基酸Cit、Orn水平較高。Cit和Orn是尿素循環的關鍵氨基酸，在多種不同部位的腫瘤患者血液中明顯升高[14-15]，其原因尚不明確。POILLET-PEREZ等[16]認為細胞的自噬作用可以通過尿素循環維持腫瘤的生長，這可能會導致Cit和Orn水平代償性增高。同時高水平的Cit能更快地激活中性粒細胞，介導中性粒細胞胞外殺菌網絡的形成[17]，從而誘導部分腫瘤細胞的增殖和轉移[18]。

值得注意的是，本研究發現，中晚期NSCLC組多數氨基酸水平低于早期NSCLC組（P＜0.05）。這可能是在惡性腫瘤細胞的增殖過程中，蛋白質及氨基酸被大量消耗導致的[19]。肺部腫瘤不僅會影響人體的呼吸系統和循環系統，還會引起人體能量代謝的改變，使機體氨基酸表達異常；在肺部腫瘤患者體內，氨基酸為腫瘤細胞的增殖提供能量，構建其生長所需的蛋白質，并參與腫瘤細胞在體內的免疫逃逸[19]。

本研究ROC曲線分析結果顯示，在早期NSCLC組與正常對照組、肺良性疾病組發生相同改變的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）中，診斷效能最高的是Cit（0.709），其A U C甚至高于3種經典的腫瘤標志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）。這可能是因為早期NSCLC患者血清Cit水平較高，而肺部良性疾病患者Cit水平無明顯變化；腫瘤標志物水平不僅在NSCLC中較高，在肺部良性疾病患者中同樣也較高。相對于健康對照者，肺炎等肺部良性疾病患者血中CEA水平可升高2～3倍[20]，CYFRA 21-1可升高50%[21]，有50%以上的肺部良性疾病患者CA 19-9等也會有不同程度的升高[22]。另外，本研究采用二元Logistic回歸分析對早期NSCLC組與非腫瘤組之間有差異的6種氨基酸（Ala、Glu、Pro、Val、Cit、Orn）和3種腫瘤標志物（CA 19-9、CEA、CYFRA 21-1）進行擬合，篩選出診斷早期NSCLC效能最高的指標組合（Glu+Val+Cit+CYFRA 21-1），其AUC為0.808，敏感性為64.56%，特異性為88.28%。目前，由于外周血腫瘤標志物的敏感性或特異性并不高，且忽視了除經典腫瘤標志物外的其他指標，如補體4[23]、各類載脂蛋白[24]等蛋白組學指標和miR-124a、miR-449a等轉錄組學指標[25]在NSCLC患者中的變化，因此早期NSCLC的準確診斷尚存在一定的困難。隨著各類機器學習算法的發展，最佳指標組合的概念日趨成熟[26]，通過算法將各類差異指標進行擬合，可得到由最佳指標組合建立的診斷模型，納入的指標類型越全面、維度越廣，模型的診斷效能越高。

綜上所述，血清氨基酸譜的變化與NSCLC的發生、發展有一定關系。由Glu、Val、Cit和CYFRA 21-1組成的最佳指標組合對早期NSCLC有較好的輔助診斷效能。但由于本研究樣本量較小，因此結論尚需大樣本、多中心研究加以驗證。