牦牛源富硒鼠李糖乳桿菌的優化培養

孫建春，吳征王，鄒雨婷，石 斌，吳慶俠，董海龍，田發益

（1.西藏自治區農畜產品質量安全檢驗檢測中心，拉薩 850013；2.渠縣動物疾病預防控制中心，四川 達州 635200；3.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，拉薩 850004；4.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000）

硒（Selenium，Se）是生命必需的一種微量元素，是硒代半胱氨酸和含硒酶如過氧化物酶的必需組分，在抗癌、抗氧化等方面發揮重要作用［1］。硒是許多酶活性中心的必需組分，具有抗氧化、保護心血管和心肌健康、抗腫瘤活性、調節免疫等作用［2，3］。1973年世界衛生組織（WHO）確認，硒是人體必需的微量元素，缺硒會導致心腦血管病、高血壓綜合征、肝病、糖尿病、胃腸道病、哮喘、癌癥等40余種并發癥［4］。世界衛生組織公布的資料表明，全球有40多個國家屬于低硒或缺硒地區。中國是國際公認的“缺硒大國”之一，有72%的縣（市）低硒或缺硒，其中30%為嚴重缺硒地區，7億多人口存在不同程度的硒攝入不足［5］。補硒的來源主要有無機硒和有機硒，而無機硒的毒性比有機硒的毒性大，同時有機硒的安全性更高，不易發生硒中毒，也易被機體吸收，所以特別受青睞［6］。本研究通過對鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）富硒條件的探索，尋找出最適宜鼠李糖乳桿菌富硒的條件，為生產牦牛源富硒乳酸菌的產品提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（西藏農牧學院臨床獸醫實驗室保存），乳酸桿菌選擇性肉湯（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號：20180615），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV6600型紫外可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；移液槍及槍頭（凝科辦公用品專營店）；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；LRH-150型生化培養箱（江蘇盛藍儀器制造有限公司）；HDL-4型臺式離心機（常州市鴻科儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 富硒鼠李糖乳桿菌的培養 將鼠李糖乳桿菌從-80℃的冰箱中取出，復蘇，傳至第3代。采用正交設計軟件（正交設計助手Ⅱv3.1）設計試驗方案（表1）。將亞硒酸鈉配制為高濃度溶液以便后續加入到乳酸桿菌選擇性肉湯中，加入亞硒酸鈉最終濃度為6、8、10、12μg/mL［7］。使用復蘇后的乳酸桿菌在超凈工作臺中按照1%（w/v）接種量接種至乳酸桿菌選擇性肉湯中，按照不同的培養溫度（36、37、38、39℃）、不同的加入亞硒酸鈉時間（4、6、8、10 h），再加入不同濃度的亞硒酸鈉溶液，恒溫培養24 h，每組重復3次取平均值。

表1 鼠李糖乳桿菌富硒正交試驗設計

1.3.2 標準曲線的繪制 準確吸取6μg/mL的亞硒酸鈉標準溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別加入到100 mL的燒杯中，加去離子水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2 Na溶液1 mL，搖勻，并用1∶1的鹽酸調節pH至2～3，各加入0.5%DAB溶液4 mL，搖勻，置于暗處30～50 min，再用5%NaOH調節pH至6～7，置于分液漏斗中，加入6 mL甲苯振搖2 min，靜置分層，棄去水層，收集甲苯層于比色皿中，于420 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線［8］。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌中富硒量的測定 將鼠李糖乳桿菌培養液5 000 r/min離心10 min，棄上清液，使用去離子水清洗3次，將附著于菌體表面的硒洗去，最終放置在65℃的烘箱中烘至恒重，烘干后的重量減去加入菌體之前的重量即為菌體的重量［9］。將烘干稱重后的乳酸桿菌轉移至帶刻度的試管中，加入硝酸-高氯酸溶液（體積比為5∶1）0.6 mL，放置過夜。然后將試管置于100℃水浴鍋中加熱4 h。當試管內黃褐色氣體排盡后，取出冷卻，加入30%過氧化氫溶液2 mL，繼續置于沸水浴中消化，至消化液呈無色或淡黃色即達終點。取出試管冷卻后，用去離子水定容至10 mL，同時做空白對照［10］。以空白對照調零，測定方法同標準曲線的繪制。

1）富硒率的計算。

2）富硒量的計算。

1.3.4 數據處理 采用Excel 2007軟件進行數據統計處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定

使用配制的亞硒酸鈉標準溶液，在420 nm波長處測量其吸光度，以亞硒酸鈉中硒含量為橫坐標、以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。如圖1所示，硒含量在0.457～2.283μg/mL時，吸光度與硒含量成良好的線性關系，回歸方程為y=0.124 6x-0.011 9（R2=0.998 6）。

圖1 標準曲線

2.2 鼠李糖乳桿菌富硒量分析

從表2可知，硒轉化率最高的組為1-3組，其硒轉化率為85.04%，鼠李糖乳桿菌菌體富硒量高達5 648.004μg/g，但2-3組的硒轉化率為74.72%，菌體富硒量高達5 901.243μg/g。當培養溫度為36℃時，硒轉化率都比較低，最大硒轉化率只有36.80%。當溫度為37℃時，硒轉化率明顯比36℃培養時高很多，最低為47.81%、最高為62.95%，并且隨著亞硒酸鈉濃度的升高，其硒轉化率呈下降趨勢，說明亞硒酸鈉對鼠李糖乳桿菌的生長有抑制作用。當培養溫度為38℃時，其硒轉化率普遍較高，最高為85.04%，最低為50.34%，并且也是隨著亞硒酸鈉濃度的升高，硒轉化率呈下降趨勢。當培養溫度為38℃時，10μg/mL亞硒酸鈉菌液比12μg/mL亞硒酸鈉菌液更有利于轉化亞硒酸鈉，其原因是加入亞硒酸鈉的時間不同，12μg/mL的亞硒酸鈉加入時間為第6 h，但10μg/mL的亞硒酸鈉加入時間為第4 h。這種現象從側面反映出高濃度亞硒酸鈉對鼠李糖乳桿菌轉化硒有抑制作用，加入亞硒酸鈉的時間最好為鼠李糖乳桿菌生長的對數期。當培養溫度為39℃時，其硒轉化率也較低，最高為40.22%、最低為36.73%，但鼠李糖乳桿菌的量并沒有減少；培養溫度為39℃時，鼠李糖乳桿菌生長不會受到抑制，但會抑制其轉化亞硒酸鈉。當亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時，培養出來的菌體全部變為紅色，原因是亞硒酸鈉濃度太高，亞硒酸鈉表面有析出的硒單質。單質硒的形成機制可能是谷胱甘肽GSH介導的還原模式，GSH與SeO32-生成GS-Se-SG，GS-Se-SG在GSH還原酶的作用下生成GS-Se-，GS-Se-不穩定，最終分解成Se和GSH［11，12］。

表2 鼠李糖乳桿菌富硒量

3 小結與討論

鼠李糖乳桿菌富硒作用最佳條件：38℃恒溫培養、加入亞硒酸鈉的時間為第10 h、最佳亞硒酸鈉濃度為8μg/mL。徐穎等［7］研究發現，最佳亞硒酸鈉濃度為10μg/mL，加硒時間為第6 h，培養溫度為38℃，與本研究結果有差異，原因可能由于試驗的濃度梯度設置的太大導致的。徐穎等［7］研究硒轉化率高達85.5%，但其硒含量為197.47μg/g，本研究的硒轉化率為74.72%時，富硒量高達5 901.243μg/g。徐穎等［7］的研究硒轉化率非常高，但其硒含量卻非常低，原因可能是將菌體烘干時未烘干至恒重，也有可能是因為加入亞硒酸鈉之前乳酸桿菌生長過快，其加硒時間在細菌生長的對數期之后。曾議霆等［9］研究發現，最佳亞硒酸鈉濃度為6μg/mL、加硒時間為第6 h，硒轉化率達27.00%，富硒量為425.79μg/g。其硒轉化率與富硒量都比較低，原因可能是其培養乳酸桿菌時的溫度為36℃。本研究發現36℃與39℃培養的鼠李糖乳桿菌對亞硒酸鈉的轉化都比較低。朱何東等［13］研究發現，布氏乳桿菌的富硒條件：37℃恒溫培養，亞硒酸鈉添加量為46μg/mL，培養36 h，富硒能力為56.52%，其乳酸桿菌的種類與本研究的乳酸桿菌種類不同，布氏乳桿菌相對鼠李糖乳桿菌更能適應高濃度的亞硒酸鈉，但富硒能力相對較低。宋照軍［14］研究發現嗜酸乳桿菌（LA）富硒能力較強，其富硒的條件：選用番茄汁液體培養基，亞硒酸鈉添加量為18μg/mL，37℃培養24 h，富硒能力為62.22%。嗜酸乳桿菌（LA）對硒的適應力也較強，富硒能力相對較高，為62.22%。亞硒酸鈉濃度過高會抑制鼠李糖乳桿菌的生長，并且會在鼠李糖乳桿菌表面析出硒單質，對于鼠李糖乳桿菌中的有機硒以何種形式存在有待進一步研究。