共轉化6-SFT和bar表達框小麥的獲得及檢測

賀曉嵐，王建偉，陳新宏，李文旭，秦紹釗，湯 宏，吳顯芝

（1.凱里學院，a大健康學院，b.理學院，貴州 凱里 556011；2.西北農林科技大學農學院/陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室，陜西 楊凌 712100；3,河南省農業科學院小麥研究所，鄭州 450002）

干旱、寒冷及高鹽等非生物脅迫嚴重制約著農業的發展，小麥（TriticumaestivumL.）是世界最重要的糧食作物之一，而每年因干旱、寒冷及高鹽等逆境所造成的減產約占世界小麥減產總量的70%，小麥生產受到了嚴重限制［1］。因此，挖掘并克隆抗旱、抗寒及抗鹽脅迫關鍵基因并轉入小麥，改善和提高小麥對非生物脅迫的抗性是農業生產的主要目標之一。

果聚糖是具有可溶性和黏性的聚合多糖，是溫帶和寒冷地區植物組織中重要的能量貯藏物質，15%的被子植物其碳水化合物的主要儲存形式為果聚糖，如菊科、百合科和禾本科植物［2］。果聚糖不僅是植物重要的能量貯藏物質，而且是參與植物生命代謝的重要物質。植物可通過調節體內果聚糖代謝來維持胞內滲透壓及細胞膜的穩定性，從而應對多種環境脅迫［3］。植物體內果聚糖積累含量的提高有助于其抗旱、抗寒、抗鹽、耐貧瘠及抗土壤重金屬毒害能力的提高［4-8］。據報道，麥類植物中的果聚糖由3種酶參與合成，其中，蔗糖：果聚糖6-果糖基轉移酶（Sucrose：fructan 6-fructosyltransferase，6-SFT）是其關鍵酶［9］。自Sprenger等［10］首次從大麥中克隆到6-SFT基因以來，目前已在多種植物如小麥［11］、早熟禾［12］、梯牧草［13］、雀麥［14］、華山新麥草［4］、簇毛麥［5］和濱麥［15］等中成功分離到該基因，并進行了功能驗證研究。大量研究表明，草本植物的6-SFT基因轉入煙草及擬南芥等植物時，轉基因植株中果聚糖含量增加，抗逆境脅迫能力增強［4，5，15，16］。華山新麥草和簇毛麥均為多年生草本植物，華山新麥草具有早熟、耐旱、抗寒、抗鹽、抗病等優異性狀［17］，簇毛麥具有抗旱、抗寒、抗鹽、抗多種病害及分蘗力強、小穗數多等優良性狀［18］，因此華山新麥草和簇毛麥均為小麥遺傳改良的優異野生基因資源。標記基因在植物遺傳轉化過程中的作用是篩選和鑒定轉化細胞，但是如果其長期存在于轉基因植物中，可能存在潛在的環境和食品安全等問題，尤其對于糧食植物來說，影響其商業化審批［19］。因此，采用共轉化法獲得無載體骨架序列無抗生素標記基因的轉基因小麥至關重要。

6-SFT基因功能在擬南芥、水稻等模式植物中被廣泛研究，但是對于華山新麥草和簇毛麥6-SFT基因轉化普通小麥的研究卻很少，而關于華山新麥草和簇毛麥6-SFT基因與篩選標記基因以最小表達盒形式共轉化小麥的研究更是鮮有報道。本研究利用bar基因作為篩選標記基因，通過基因槍法將Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因轉入小麥幼胚中，以期獲得含Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因的轉基因小麥，旨在探索利用Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因改良小麥抗旱、抗寒、抗鹽等性狀的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通小麥‘科農199’（Kenong199，2n=6x=42，AABBDD）為基因槍轉化的受體材料。試驗所用質粒為 pCAMBIA1301-35SN 和 pEasy-Blunt-bar。pCAMBIA1301-35SN含Ph-6-SFT或Dv-6-SFT基因，pEasy-Blunt-bar含bar篩選基因，pCAMBIA1301-35SN由來自花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子驅動，pEasy-Blunt-bar由玉米Ubi啟動子驅動（圖1），均由西北農林科技大學農學院陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室提供。

圖1 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus和bar基因最小表達盒

1.2 試驗方法

1.2.1 質粒提取及表達盒制備 挑取單菌落，在液體培養基中接種培養至OD600nm為0.6～0.8。用天根生化科技（北京）有限公司的質粒小提試劑盒提取高質量質粒，用EcoRI、SphI和PmeI內切酶分別切割pCAMBIA1301-35SN+Ph-6-SFT或CAMBIA1301-35SN+Dv-6-SFT和pEasy-Blunt-bar環形質粒，經瓊脂糖凝膠電泳分離Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus和bar基因表達盒，分別將回收產物濃縮至1μg/μL，保存于-20°C冰箱備用。

1.2.2 受體材料的培養 取開花授粉后12～16 d未成熟子粒，用70%的乙醇表面消毒1 min，10%NaClO消毒15 min，無菌水沖洗3～4次，然后在超凈臺上借助解剖鏡用解剖鑷子剝取幼胚，切去胚軸，盾片平面向上接種于含甘露醇9%的MS（Murashige and skoog）培養基（MS+2 mg/L 2，4-D+9%甘露醇）上作滲透培養，置22～23℃暗培養4 h后用于轟擊。

1.2.3 基因槍轟擊及組織培養 基因槍轉化及篩選過程參照賀曉嵐等［19］方法。取50μL直徑0.6μm金粉顆粒懸浮液（20 mg/mL），加入4μL總濃度1μg/μL的混合質粒DNA（表1），在2.5 mol/L氯化鈣50μL，0.1 mol/L亞精胺20μL的參與下，將混合質粒DNA沉淀并包被在金粉粒（Bio-Rad，美國）上，取包被有

表1 混合質粒DNA的配比

DNA的金粉懸浮液，用150μL無水乙醇清洗2次，最后懸浮于85μL無水乙醇中，置冰上待用。將包被有DNA的金粉懸浮液涂于載體膜上，每片5μL，待干燥后用于轟擊。每次涂液前將懸浮液漩渦處理使之混合均勻。用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad公司）轟擊，用草丁膦（Phosphinothricin，PPT）作篩選劑，轟擊參數及篩選培養方法同賀曉嵐等［19］。

1.2.4 GUS組織化學染色 對轟擊3 d后的轉化幼胚（隨機取3個皿，每皿10個幼胚進行GUS瞬時表達檢測），T0代全部植株的少許葉片及T1代全部種子（半粒不帶胚的種子）進行GUS組織化學染色，將需要鑒定的組織材料放入X-gluc反應液中，真空抽氣6 min，37℃溫育5 h以上。葉片染色后，在光照條件下，用70%的乙醇脫色24 h，然后觀察并拍照記錄結果。

1.2.5 候選轉化株DNA提取及PCR檢測 提取除草劑抗性小麥植株的DNA［20］并進行gus基因的PCR檢測，gus基因的引物序列GUSF：AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC（5′→3′），GUSR：ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA（5′→3′），gus基因片段預期擴增長度為1 051 bp，PCR反應參數：循環38次，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，凝膠電泳檢測特異條帶。

2 結果與分析

2.1 小麥轉化植株的bar篩選

Ph-6-SFT+gus或Dv-h-6-SFT+gus表達盒分別與bar表達盒按物質的量比1∶2混合，用金粉包被后，在相同轟擊參數條件下，轉化科農199幼胚，誘導愈傷，愈傷組織體積膨大，分化出綠色小芽（圖2a、圖2b、圖2c、圖2d），將再生組織轉到第一輪再生篩選RDZ+2.5 mg/L PPT培養基篩選21 d，有少量根系長出（圖2e）；第二輪再生篩選在RDZ+3.5 mg/L PPT培養基篩選21 d，有大量根系和葉片長出（圖2f）；然后，將抗性植株轉到R培養基上壯根10～15 d（圖2g），轉入花盆培育至成熟（圖2h、圖2i、圖2j）。

圖2 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus轉化普通小麥‘科農199’的全過程

2.2 小麥轉化植株的GUS組織化學染色鑒定

打槍3 d后進行瞬時表達檢測部分結果見圖3a，T0代各株轉基因植株葉片GUS組織化學染色結果見圖3b，各株轉基因植株T1代種子GUS組織化學染色結果見圖3c。共獲得2株陽性轉化植株，并且只有1株（轉Dv-6-SFT+gus基因）結實。

圖3 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus瞬時及穩定表達

2.3 小麥轉化植株的PCR鑒定

提取抗性篩選所獲植株葉片的基因組DNA，通過PCR法鑒定轉基因植株，gus基因的部分電泳檢測結果見圖4。共獲得2株轉基因植株，其中僅1株轉Dv-6-SFT基因的植株可正常開花、結實。

圖4 部分轉Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gusT0代小麥PCR檢測

2.4 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus基因的轉化率

分別對419和532個被轟擊幼胚進行愈傷誘導，并用PPT進行再生篩選，分別獲得146和187株再生植株，其中PCR陽性植株分別為4株和6株，GUS組織化學染色陽性植株均為1株，最終轉化率分別為0.24%和0.19%（表2）。

表2 Ph-6-SFT+gus或Dv-6-SFT+gus基因的轉化率

3 討論

果聚糖代謝不僅與植物碳素分配、源庫關系調節和非生物脅迫抗性密切相關，而且其產品作為一種益生素對人體健康十分重要。因此，利用轉基因技術提高重要作物果聚糖含量的研究成為當前的熱點。小麥抗逆基因工程研究雖然取得了一定進展，但是由于其基因組龐大，遺傳背景復雜，導致其轉化效率低，受體十分狹窄，并且與其他作物如水稻、玉米、大豆等相比，獲得單拷貝、純合、穩定表達的轉基因植株難度較大。本試驗所轉Ph-6-SFT+gus和Dv-6-SFT+gus基因已經成功轉化煙草并進行了抗旱、抗寒及抗鹽鑒定。本研究證明用這2個基因分別轉化小麥均獲得了成功。其中轉Dv-6-SFT+gus基因的小麥植株可正常開花、結實，轉Dv-6-SFT+gus基因的小麥植株有望提高其非生物脅迫抗性。通過賀曉嵐等［19］建立的小麥遺傳轉化體系，本研究成功地將2個功能基因轉入小麥，經PCR及GUS組織化學染色檢測，最終得到了陽性轉基因植株，但與目前有關報道相比，本研究具有較低的陽性轉化頻率，其原因是錯過了最佳取樣時期，并且剝胚數較少。

本研究對無篩選標記無載體骨架轉化技術的深入研究及應用，為實現除優良性狀目的基因外，其他基因或序列零轉入，為普通小麥轉基因生物安全提供了參考依據。今后的工作重點是對后代植株進行抗性鑒定，獲得純合轉化植株。

4 結論

本研究以bar為篩選標記基因，通過基因槍介導法將Ph-6-SFT或Dv-6-SFT共同導入普通小麥‘科農199’幼胚愈傷組織中，分子鑒定結果表明Ph-6-SFT和Dv-6-SFT基因已分別整合到小麥基因組中，獲得了無抗生素標記基因的轉基因小麥，為小麥抗逆育種奠定了基礎。