草地貪夜蛾熱休克蛋白Hsp70的生物信息學分析

劉 芳，張志剛，方 偉，王開梅，2，王月瑩

（1.湖北省農業科學院/湖北省生物農藥工程研究中心/國家生物農藥工程技術研究中心/農業農村部微生物農藥創制重點實驗室/湖北省農業科技創新中心生物農藥分中心，武漢 430064；2.洪山實驗室，武漢 430070）

熱休克應答（Heat shock response）是生物體受熱激誘導所進行的一種轉錄和翻譯的調控，暫時性抑制一些參與細胞正常功能的蛋白合成，同時啟動一組保守的蛋白——熱休克蛋白（Heat-shock proteins，Hsp）的合成。熱休克蛋白最早于1962年在昆蟲中被發現［1］，是機體為響應環境脅迫而產生的一類重要的分子伴侶蛋白，直接參與細胞內蛋白質從初始鏈的聚合到多亞基復合體層疊、組裝等多個生物過程［2，3］。在昆蟲中，熱休克蛋白廣泛表達，在增強昆蟲對非生物和生物脅迫的耐受以及調節正常發育過程中均發揮重要作用［4，5］。根據分子質量和功能，昆蟲熱休克蛋白可分為4大家族：小熱休克蛋白（Small heat-shock proteins）、Hsp60、Hsp70和Hsp90［5］。多種昆蟲的熱休克蛋白可被非生物脅迫誘導表達和調控，包括極端溫度［6-8］、紫外線輻射［9，10］、農藥［11，12］、重金屬［13，14］、干燥［15-17］、饑餓［18，19］和缺氧［20-22］，以及寄生蟲［23，24］、病原體［25，26］和高種群密度［27］等生物傷害。研究昆蟲熱休克蛋白和溫度等環境條件的關系，有利于了解昆蟲生長發育對環境因素的依賴規律。

草地貪夜蛾屬于鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera），又名秋黏蟲，廣泛分布于美洲大陸熱帶和亞熱帶地區，是玉米和其他主要經濟作物重要的遷飛性害蟲之一［28-30］。具有寄主廣泛、適生范圍廣泛、遷飛速度快、繁殖能力強、防控難度大等特點，在國際上有“無敵破壞王”之稱，是聯合國糧農組織全球預警的遷飛性農林業重大害蟲［31］。它們主要為害水稻、玉米、甘蔗高粱、大豆等186種重要農作物［32，33］。2016年起，草地貪夜蛾散播至非洲、亞洲各國，并于2019年1月起出現在中國，發生面積超過3 333.33 km2［34］，已在多國造成巨大的農業損失。其危害的潛在風險較大，今后在中國有可能常態化發生［33］，將對華南、黃淮海及北方玉米主產區的玉米生產和中國糧食生產安全構成嚴重威脅［35］。

春夏季節氣溫升高，導致草地貪夜蛾向北遷移，而秋季時，隨著光照時間逐漸縮短且溫度逐漸降低，草地貪夜蛾又會回遷［36］。在大范圍的遷飛定居過程中，草地貪夜蛾需要面對各種環境的脅迫。不良環境脅迫因子會對昆蟲的生存、發育與繁殖產生威脅。高溫會導致昆蟲蛹羽化率低和壽命短等現象［37，38］；低溫則影響昆蟲的存活率［39］。為了應對不良環境，昆蟲能夠通過改變蟲體結構和物質能量代謝以適應環境脅迫。大量研究表明，昆蟲響應環境脅迫的機制與特殊生理生化物質密切相關，包括熱休克蛋白、海藻糖、抗氧化酶等小分子保護劑［40，41］，但目前國內有關草地貪夜蛾響應環境脅迫的分子機制研究較少。

近年來，轉錄組和基因組數據的可用性極大地促進了越來越多來自不同昆蟲物種的熱應激蛋白基因的鑒定，并促進了它們的功能研究［8，12，42-44］。然而，對于具有強破壞性的害蟲——草地貪夜蛾的hsp基因信息仍然十分有限。據報道，草地貪夜蛾不同大小的熱休克蛋白均可以被高溫條件誘導而大幅上調表達［45］，說明熱休克蛋白可能參與草地貪夜蛾對抗大范圍遷飛定居過程中面對的各種環境脅迫。Hsp70蛋白是目前為止研究最多、最深入的熱休克蛋白家族成員之一，具有應激誘導表達特性，其表達量和昆蟲生長發育及應對環境脅迫的能力密切相關。以草地貪夜蛾的Hsp70為研究對象，利用生物信息學的方法分析其理化性質、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點以及同源性等，為研究草地貪夜蛾熱休克蛋白的功能和尋找草地貪夜蛾的防治靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因序列材料

從美國國家生物技術信息中心（NCBI）DNA序列數據庫中查找獲得草地貪夜蛾熱休克蛋白Hsp70的核苷酸完整編碼序列（Completed CDs）和氨基酸序列，登錄號分別為MN735776.1和QNN88712.1。選取另外12種鱗翅目昆蟲以及1種鞘翅目、2種半翅目、1種雙翅目昆蟲和斑馬魚（Daniorerio）的Hsp70核苷酸序列和氨基酸序列作為對照參考，核苷酸序列和氨基酸序列登錄號：柞蠶（Antheraea pernyi，GU945198.1，ADI50267.1）、天 蠶（Antheraea yamamai，AB179657.1，BAD18974.1）、蠟螟（Galleria mellonella，MG992397.1，AXY94835.1）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera，HM593518.1，ADP37711.1）、苜蓿夜蛾（Heliothisviriplaca，GQ199477.1，ACS72236.1）、甘 藍 夜 蛾（Mamestrabrassicae，AB251895.1，BAF03555.1）、煙 草 天 蛾（Manducasexta，AY220911.1，AAO65964.1）、黏蟲（Mythimnaseparata，EU306518.1，ABY55233.1）、菜粉蝶（Pierisrapae，HQ647013.1，ADV03160.1）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua，FJ862049.1，ACQ78180.1）、斜 紋 夜 蛾（Spodopteralitura，HQ012004.2，ADV03160.1）、粉紋夜蛾（Trichoplusiani，DQ845103.1，ABH09732.1）、赤擬 谷 盜（Triboliumcastaneum，MK000439.1，QCI56580.1）、大豆蚜（Aphis glycines，JQ340173.2，AFO70211.1）、桃 蚜（Myzuspersicae，MF509827.1，AWN00453.1）、黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster，AY084193.1，AAL89931.1）和 斑 馬 魚（Daniorerio，BC036370.2，AAH36370.1）。

1.2 數據分析方法

本研究所用生物信息學分析工具如表1所示。多序列比對采用Mega-X［46］軟件的Muscle［47］算法，比對結果通過trimAl軟件［48］的automated方法對齊，隨后，通過Mega-X［46］軟件采用最大似然法（Maximm likelihood）建立系統發育樹，bootstrap值［49］重復計算1 000次。

表1 生物信息學分析方法

2 結果與分析

2.1 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的理化性質和親疏水性分析

ProtParam分析結果顯示，草地貪夜蛾Hsp70蛋白由651個氨基酸殘基組成，分子式為C3099H4982N882O985S24，分子質量為71 126.41 u，理論等電點（PI）為5.47，為弱酸性蛋白，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為93，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為82，不穩定指數（Instability indexⅡ）為39.68，歸類為穩定蛋白。Hsp70蛋白中氨基酸含量最高的為丙氨酸（Ala），占比9.4%（61/651），其次為甘氨酸（Gly），占比為8.8%（57/651）（圖1）。

圖1 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸組成

利用ProtScale工具分析Hsp70蛋白的親疏水性，結果顯示蛋白最小值為-3.767，最大值為2.300，為親水蛋白（圖2）。

圖2 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的親水/疏水分析

2.2 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結構和三級結構分析

利用NetSurfP 3.0預測草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結構。該蛋白中37.48%的氨基酸形成α螺旋（Alpha helix）（244個氨基酸殘基），26.11%形成延伸鏈（Extended strand）（170個氨基酸殘基），21.66%形成無規則卷曲（Random coil）（141個氨基酸殘基）（圖3）。

圖3 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的二級結構預測

利用SWISS-MODEL預測了草地貪夜蛾Hsp70蛋白的三級結構。該蛋白三維建模最高全局模型質量估計值（GMQE）為0.79，表明結構預測較為可靠（＞0.7）。參考蛋白為綠藻（Chlamydomonasrein-hardtii）的熱休克蛋白Heat shock protein 70A（SMTL ID：7sqc.391），兩者氨基酸序列一致性為70.05%。如圖4所示，該蛋白主要結構為α螺旋，其次為延伸鏈和無規則卷曲，與二級結構預測結果一致。

圖4 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的三級結構預測

2.3 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的信號肽跨膜區及跨膜結構預測分析

利用SignalP-6.0和TMHMM工具，分析了草地貪夜蛾Hsp70蛋白的信號肽跨膜區及跨膜結構，結果表明，3個蛋白均不具有信號肽以及跨膜結構（圖5）。

圖5 草地貪夜蛾Hsp70蛋白質的信號肽跨膜區和跨膜結構域分析

2.4 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的系統發育分析

從NCBI數據庫中選取另外12種鱗翅目昆蟲，以及1種鞘翅目、2種半翅目和1種雙翅目昆蟲Hsp70的核苷酸序列和氨基酸序列作為對照參考，與草地貪夜蛾Hsp70蛋白的氨基酸序列進行同源性分析，結果如圖6所示，草地貪夜蛾的Hsp70與鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾和斜紋夜蛾親緣關系較近，但與鱗翅目昆蟲蠟螟、粉紋夜蛾和黏蟲親緣關系較遠。

圖6 草地貪夜蛾Hsp70蛋白的系統發育進化樹

3 小結與討論

熱休克蛋白是一組在生物進化過程中高度保守的蛋白質分子家族，在許多昆蟲物種中已經發現了大量的熱休克蛋白基因。熱休克蛋白是在環境脅迫下生存的重要調節劑，也是正常發育和滯育的關鍵調節劑。在不良環境下昆蟲體內的熱激蛋白通過穩定細胞結構或消解錯誤蛋白來維持正常生命活動，提高生物細胞對應激源的耐受力，阻止細胞凋亡［55，56］。Hsp70家族蛋白參與由環境脅迫而引起刺激信號轉導、氧化應答、抗凍、熱休克和金屬結合等過程。從分子水平上檢測熱休克蛋白基因表達變化是一種檢測農藥等污染物的良好手段。同時隨著全球氣候變暖問題的日益嚴重，農業害蟲溫度適應能力增強，造成活動范圍的擴大，熱休克蛋白的研究不但為深入開展害蟲抗逆適應性機制研究奠定理論基礎，而且可以為害蟲的綜合治理提供幫助。

草地貪夜蛾的入侵和迅速擴散已在中國造成巨大的經濟損失，嚴重威脅中國農業及糧食生產安全，然而其如何抵抗環境脅迫的相關機理研究仍有欠缺。本研究選用的Hsp70蛋白基因來自草地貪夜蛾，該物種的hsp70基因共編碼20種651個氨基酸，其中，丙氨酸含量最高，色氨酸含量最低。該蛋白不穩定指數為39.68，屬于穩定的親水蛋白，且該蛋白不存在信號肽和跨膜結構域。在同源性分析中選取12種鱗翅目昆蟲，以及1種鞘翅目、2種半翅目和1種雙翅目昆蟲的Hsp70蛋白序列與草地貪夜蛾比對，經Mega-X比對，建立系統發育樹，發現草地貪夜蛾Hsp70蛋白與鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾和斜紋夜蛾親緣關系較近，而與鱗翅目昆蟲蠟螟、粉紋夜蛾和黏蟲的物種親緣關系較遠。以上結果為進一步研究草地貪夜蛾熱休克蛋白的功能和尋找草地貪夜蛾的防治靶點提供了一定的理論基礎。