外排泵系統與幽門螺桿菌抗生素耐藥性的研究進展

童 靜，李昌平

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬醫院消化內科，四川 瀘州 646000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)是一種革蘭陰性慢性感染性致病菌，2017年有研究報道全球HP感染率已超過50%，被認為是全球常見的感染細菌之一[1]。HP可引起胃十二指腸疾病及血液系統疾病等[2]，而通過根除HP感染，不僅可以減少消化性潰瘍等疾病治愈后的的復發，還能在一定程度上降低胃癌發生率[3]。《Maastricht V/Florence幽門螺桿菌感染處理共識報告》提出，一旦感染HP應進行根治性治療[4]。在我國，耐藥菌株發生率隨著抗生素的不規范使用呈現逐步上升趨勢。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星等常用抗生素對HP的耐藥率分別為 40%～70%、20%～50%以及 20%～50%，且存在一定的區域差異性，同時HP多重耐藥率正處于逐年上升中[5]。因此，解決HP感染的根本在于如何解決相關抗生素的耐藥性。本文就HP抗生素耐藥性及其外排泵系統的研究進展作一綜述，旨在為臨床治療耐藥HP感染提供一定思路。

1 抗生素耐藥性

抗生素耐藥性可以通過開發新的抗生素或減少細菌耐藥性來解決，然而抗生素耐藥性持續增加，最終可能會超過新的抗生素被開發的數量。HP通常是一種細胞外的非侵襲性致病菌，它可以通過復雜的過程改變胃上皮細胞之間緊密的細胞連接，藏在細胞內，以保護它不受抗生素根除治療的影響[6]；HP還具有較高的遺傳變異性，易產生抗生素耐藥基因，對各種抗生素具有很強的耐藥性，常導致根除失敗。因此，患者不得不接受許多后續治療，增加了治療成本和時間。當第1次治療失敗后，患者體內容易產生抗生素耐藥性，為后續相關治療增加了一定難度[7]。細菌耐藥性是宿主和細菌之間一個復雜的過程，可能與藥物靶點突變，外排泵表達增強，膜通透性改變等機制有關[8]。事實上，細菌在進化過程中，一些關鍵功能蛋白會發生突變，如核酸合成、氧化還原系統和蛋白質翻譯等，從而導致抗生素耐藥[9]。外排泵活性和細胞膜通透性的改變將影響抗生素在細胞中的積累，進而影響抗菌藥物的活性[10]。此外，細菌可以通過產生使抗生素失活的酶或釋放毒力因子來影響抗生素的活性[11]。以上機制在細菌耐藥過程中并不是孤立存在的，外排泵活性的增加可能會增加細菌耐藥基因的突變率[12]。

2 外排泵系統的介紹

2.1 細菌外排泵系統的組成 細菌外排泵是細菌耐藥性的主要機制之一[13]。細菌外排泵系統包括一系列轉運體，也稱為多藥轉運體，其作用機制是將抗菌藥物排出細胞外，大大降低了該抗菌藥物的濃度，繼而產生耐藥性。目前研究發現，與HP相關的外排泵系統可分為五大家族：RND家族、MFS家族、ABC家族、SMR家族與MATE家族[14]。其中外排作用最強的是RND家族，目前認為該家族只存在于革蘭陰性菌中[15]。2000年首先發現了hefABC、hefDEF和hefGHI 3種RND外排泵系統，研究得最多的為hefABC-RND外排泵系統[16]。

2.2 HP相關外排泵系統的特點 HP相關外排泵系統的特點是由轉位酶、TolC同源基因和跨膜連接其他2種組分的附屬組件組成。其中最具特色的是HP0605-HP0607轉運體，也被稱為hefABC或Acra/B/TolC系統。已有研究表明，HP菌株中存在大量hefA外排泵基因，且其與HP的多重耐藥關系密切[17]。治療HP的一些常用抗生素如阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和四環素的耐藥性與外排泵皆有密切關系[18]。對大腸桿菌外排泵的研究表明，革蘭陰性菌的RND外排泵大多屬于TolCAcrAB和OprM-MexAB系統[19]，RND家族在HP的多藥耐藥中發揮著重要作用。Kutschke等[20]分別測定了野生菌株和基因突變菌株種12種抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，發現基因突變菌株中有超過一半抗生素的MIC出現了下降，推測細菌耐藥性與外排泵之間存在著一定關系。該研究還表明，敲除HEFC基因可增加青霉素、頭孢噻肟、紅霉素、克拉霉素和四環素等對HP的有效性[21]。外排泵與HP生物膜的形成也有一定關系。有研究表明，相比于浮游菌株，有生物膜形成的菌株外排泵基因明顯高表達，推測生物膜可能與外排泵系統共同發揮作用增加抗生素耐藥性。臨床多藥耐藥的HP菌株中，外排泵基因的表達水平高于該菌的敏感菌株，表明轉運蛋白的產生與耐藥表型有直接關系[22]。也有研究表明，SpoT基因作為一種HP生長的潛在轉錄調節因子，其在球形HP中具有較高水平的表達，敲除外排泵Glup增加了HP對抗生素的敏感性[23]。此外，外排泵基因HP0605、HP0971、HP1327在有生物膜形成的菌株中的表達顯著高于浮游菌株，表明外排泵和生物膜可以通過協同作用增加抗生素耐藥性[21]。

3 外排泵與HP抗生素耐藥性的關系

3.1 外排泵與克拉霉素 克拉霉素是一種大環內酯類抗生素，其耐藥性通常由23SrRNA點突變引起，HP對克拉霉素的耐藥率已達20%～50%[5]。克拉霉素耐藥性與外排泵系統緊密相關，KefB參與了HP對克拉霉素的耐藥[24]。Zhong等[25]的研究進一步表明，在MIC劑量克拉霉素的刺激下，外排泵基因在HP1870中表達顯著，而在標準菌株中表達不顯著，說明HP耐藥菌株中外排泵基因發揮著重要作用。此外，在突變型菌株中RND家族的基因突變率明顯高于野生型菌株的基因突變率[26]。安瑩[27]通過敲除hefABC、hefDEF、hefGIH等外排泵基因研究其與克拉霉素耐藥的關系，發現基因敲除后的MIC顯著低于野生菌株，表明hef外排泵系統在克拉霉素耐藥中發揮重要作用。

3.2 外排泵與甲硝唑 甲硝唑的細菌耐藥性主要是由基因突變引起。但也有研究發現，hefA基因的過表達可減少甲硝唑在HP中的含量，推測hefA可能與甲硝唑耐藥有關[28]。TolC同源基因對外排泵活性的上調至關重要，該同源基因過表達與甲硝唑的濃度有關，且呈正相關，通過增加藥物的排出，從而導致甲硝唑耐藥，這可能是甲硝唑耐藥的關鍵[29]。

3.3 外排泵與左氧氟沙星 左氧氟沙星三聯或四聯療法為臨床治療HP感染提供了明顯的優勢，但氟喹諾酮類藥物的濫用，使得HP對左氧氟沙星耐藥的發生率增加。大多數左氧氟沙星耐藥HP的克隆已被確定與gyrA的Ala88、Ala97和Met191位，以及gyrB的Phe438、Glu463、Asp481和Arg484位的突變有關[30]。此外，革蘭陰性細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性是通過主動排出抗生素獲得的，在大腸桿菌分離菌株中，外排泵基因表達的抑制降低了氟喹諾酮類藥物的MIC。Ye等[31]通過Sanger測序推測HP0970(hefE)和HP1329(hefI)中的12種突變可能會降低對左氧氟沙星的耐藥性。

3.4 外排泵與四環素 四環素是一種殺菌性的抗生素，四環素的耐藥性主要是由于其在16 S核糖體RNA初級結合位點上的堿基發生替換所致。事實上，導致四環素耐藥的另外一個重要因素也可能與外排泵的介導有關。有研究發現，由于hefAB外排泵的介導參與，四環素的殺菌效果會發生一定程度的降低。還有研究發現，四環素的耐藥性可能還與依賴質子動力的外排機制有一定關系[28]。此外，某些外排泵基因如HP1165和 hefA的過表達，也會加強HP對四環素的耐藥性[32]。

4 HP外排泵抑制劑

目前發現的外排泵抑制劑主要是通過抑制細菌對藥物的排出，從而恢復耐藥性細菌對抗生素的敏感性，其作用機制主要歸為以下3點：(1)干擾外排泵的組成；(2)阻斷外排泵能量供給；(3)干擾底物通過外排泵[33]。羰基氰氯苯是一種通過質子驅動的解偶聯劑，主要是通過抑制外排泵系統的動力，使其恢復細菌對抗生素的應答從而發揮作用。二胺類化合物(PAbN)是一種RND型外排泵抑制劑，可能是通過第3類機制，來達到恢復細菌對多種抗生素的敏感從而發揮作用。Hirata等[34]報道PAbN能降低克拉霉素耐藥菌株中的MIC，且隨著PAbN劑量的增加，克拉霉素的MIC表現出依賴性降低，表明外排泵與克拉霉素的耐藥性存在一定聯系。質子泵抑制劑(PPIs)作為一種質子動力解偶聯劑，被廣泛用來抗HP感染，也是通過阻斷外排泵能量供給來恢復細菌對抗生素的應答。鄭鵬遠等[33]研究指出，泮托拉唑濃度為10 μg/ml時可顯著降低耐藥菌株對四環素、克林霉素等的MIC，同時可以增加敏感菌株對部分抗生素如琥乙紅霉素和頭孢曲松的敏感性，表明PPIs在HP根治中可能通過抑制外排泵的排出能力，從而提高殺菌力。此外有研究表明，在常用的PPIs中，雷貝拉唑對耐藥菌株體外實驗的影響最大，其次是泮托拉唑，說明雷貝拉唑能更好地抑制外排泵和逆抗藥性[35]。但國內外將PPIs作為外排泵抑制劑的研究還比較少，有待進一步探討。

5 小結與展望

HP耐藥率持續上升，且出現多藥耐藥菌株，外排泵與HP多重耐藥性有著密不可分的關系。外排泵抑制劑可以通過抑制細菌對藥物的排出，達到降低某些抗生素MIC的作用。對HP外排泵進行研究，一方面可以在基因水平上抑制蛋白質的過表達，另一方面可以開發出有效的外排泵抑制劑，這對解決HP抗生素耐藥性提供了新思路。目前國內外對外排泵系統及外排泵抑制劑與HP抗生素耐藥性的研究還值得進一步探索，以幫助臨床實施更規范、更精準的治療，控制耐藥菌株的形成和播散，進而提高HP的根除率。