利用光譜法檢測血痕變化時序性研究

曹 娜

（河南警察學院，河南 鄭州 450046）

血液主要由血漿和血細胞組成，除了大量水分，還有無機鹽、纖維蛋白原、酶、激素等化學基團[1]。血液離體后水分不斷揮發，酰胺、脂類、核酸血紅蛋白及其衍生物（高鐵血紅蛋白、高鐵血紅素原）等化學基團會隨客觀環境發生變化。血液中的大多數化學基團不斷分解，不同物質的分解速率不同，同一物質的不同基團、同一基團的不同振動類型變化趨勢亦不相同，這些都會對光譜的吸收效果造成影響。

當前，有多種技術方法用于推斷血痕形成時間，如核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA，分為mRNA或microRNA）降解分析法[2]、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（Attenuated Total internal Reflectance Fourier Transform Infraredspectroscopy，ATR-FTIR）技術[3]、紫外可見積分球反射光譜法[4]、紫外可見漫反射光譜法[5]、數字圖像分析技術[6]等。本研究利用光譜法對血液樣品進行檢測并對光譜圖進行分析處理，以期找到血痕的時序性變化規律。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及材料

1.1.1 實驗儀器及工作條件

（1）島津牌紫外分光光度計，光波波長為250～800 nm。

（2）島津牌傅里葉紅外光譜儀（AIM-9000）。光譜波數：4 000～400 cm-1。測定模式：透過率。變跡函數：Happp-Genzel。分辨率：4.0 R。掃描次數：32。光束：內部。動鏡速度：2.8 mm/s。

1.1.2 實驗耗材

石英比色皿，醫用酒精，滅菌采血針，消毒棉簽若干。

1.1.3 實驗檢材

健康成年男性的新鮮血液：記錄志愿者的相關信息（年齡/性別/健康情況），利用消毒棉簽沾取酒精對志愿者手指進行消毒，然后使用滅菌采血針對志愿者進行現場采血，采集新鮮血液1 mL。

1.2 方法

打開傅里葉紅外光譜儀，調整好實驗設備參數；依次進行空白背景掃描和金剛石背景掃描并保存圖譜；安裝ATR附件；用一次性滴管吸取一滴樣本1號血液，滴在ATR金剛石表面；點擊樣本掃描，待掃描完成后導出實驗數據至新建文件夾中；等待10 min后再次點擊樣本掃描，導出數據；以10 min為間隔進行24小時段間隔掃描。將每次掃描光譜圖按照測量時間命名進行編號，保存至文件夾。

打開紫外-可見分光光度計等相關儀器，并打開相關軟件，設置好相關參數，進行空白背景掃描，充分預熱機器。預熱機器30 min后，將抽取的新鮮血液滴在石英比色皿中，放入紫外-可見分光光度計進行檢驗，保存數據并記錄相關事件，等待10 min后再次掃描檢材。多次重復實驗，記錄并保存相關數據。

2 結果與討論

2.1 實驗結果

根據前期預實驗的結果，設定好相關實驗數據，按照實驗方法進行操作，獲得穩定的數值。

2.1.1 紅外光譜檢測血痕實驗結果

利用傅里葉紅外光譜儀檢測新鮮血痕時，利用OPUS軟件對出峰點和峰值數據進行提取，血痕的光譜隨時間變化。紅外光譜檢測發現，血痕的變化主要集中在血液滴落后150 min內，血痕光譜圖出峰點隨時間變化。不同時間光譜圖在不同位置的峰形和峰位有一定差異，變化主要集中在波數為1 540、1 650、2 360、3 300 cm-1的附近，如圖1所示。

由圖1可以看出，血痕的吸收峰較強，隨時間變化較為明顯。為了直觀地展現變化規律，對出峰點和峰值數據進行提取并形成表格（見表1）。

表1 紅外光譜圖像峰值

圖1 150 min內血液紅外光譜變化

在波數400～1 000 cm-1，隨著時間推移，峰型沒有劇烈變化。在血液滴落1.5 h內，該波段曲線比較平穩，波峰未出現強烈變化；隨后1.0 h內，吸光度明顯下降。在1 000～1 750 cm-1，波峰變化劇烈。在血液滴落2.0 h內，吸光度持續升高。隨后0.5 h，吸光度不斷降低。在2 300～2 390 cm-1，血液滴落前1.5 h內，吸光度不斷升高；隨后1.0 h內，吸光度持續降低。在3 000～3 650 cm-1，血液滴落前1.5 h內，吸光度不斷提高；隨后1.0 h內，吸光度緩慢降低。

2.1.2 紫外光譜實驗結果

利用紫外光譜儀檢測新鮮血痕發現，血液的變化主要集中在2.0 h內，血痕光譜圖出峰點隨時間變化。血液形成的圖像隨時間的變化表現在出峰點數量上，在0～1.0 h內，樣本的光譜圖像有5個出峰點，為578、543、416、342、275 nm。1.0 h后，血液的光譜圖像出峰點數量明顯減少，從5個變為4個（342 nm出峰位置消失）。

血液樣本的出峰點位置相對固定，一般為578、543、416、275 nm。利用UVWin5紫外軟件對數據進行處理，整理4個出峰點的時序性變化（見圖2）。雖然出峰點會有一定偏差，但偏差較小，通常出峰點位置偏離1～2 nm，暫且不能排除其他外部環境干擾或儀器本身導致的出峰點位置偏移。

圖2 120 min內血液紫外光譜圖主要峰位時序性變化

在波長為275 nm的位置，出峰點的吸光度在0.5 h呈現下降趨勢，在0.5～1.5 h呈現上升趨勢，在1.5～2.0 h呈現穩定狀態。在波長為416 nm附近，出峰點的吸光度在0.5 h內呈現明顯的上升趨勢，在0.5～1.0 h呈現不明顯的下降趨勢，在1.0～3.0 h呈現穩定狀態。在波長為543 nm附近，出峰點的吸光度在0.5 h呈現明顯的下降趨勢，在0.5～2.0 h呈現不明顯的上升趨勢，在2.0～3.0 h呈現相對穩定的狀態，雖然出現一定波動，但是變化并不明顯。在波長為578 nm附近，出峰點的吸光度在最初0.5 h內呈現明顯的下降趨勢，在0.5～1.5 h呈現不明顯的上升趨勢，在1.5 h后呈現相對穩定的狀態，雖然出現一定波動，但是變化并不明顯。出現波動的原因可能是外部環境因素干擾或者實驗儀器本身不穩定。

2.2 討論

對照紅外光譜各基團特征峰可以看出，O—H的伸縮震動區位于3 000～3 750 cm-1。Tidball J G[6]指出，在1 657 cm-1附近有極強的液態水O—H及氫鍵的吸收峰。由此可以看出，變化較為劇烈的1 600～1 700 cm-1和3 000～3 650 cm-1區間血液滴落2.0 h內變化明顯，可能是血液中水分大量蒸發導致的結果。N—H的伸縮震動區也位于3 000～3 750 cm-1，C—H的伸縮震動區位于3 000～3 300 cm-1，C—O的伸縮震動區位于1 000～1 475 cm-1，這與血液中水分變化的紅外光譜區域重合，水分的劇烈變化影響了血液中其他蛋白質類、酰胺類物質的吸收峰變化。

對照紫外光譜譜圖[7]，紅細胞和血紅蛋白在275、415、540 nm處有特征峰，且隨時間推移，在血液滴落初期的0.5 h內吸光度有所變化，后持續反向變化，在1.5 h后呈穩定狀態。紅細胞單獨在575 nm位點有特征峰，但變化與上述位點相似，均是0.5 h內和0.5 h后明顯變化，原因可能是血液中水分變化劇烈，紅細胞逐漸破裂而出現不同變化。

通過重復實驗發現，利用紅外光譜儀和紫外-可見分光光度計分析不同人體血痕得到的光譜圖像略有不同，峰值也有一定差異，但是不同個體血痕的光譜圖像大體曲線和走勢基本保持一致。

通過實驗可知，在血痕形成的2.0 h內，血痕的光譜圖像變化較為明顯。2.0 h后，血痕的光譜圖像十分穩定，無法通過光譜圖像的變化規律確定血痕的形成時間。

3 結論

選取不同儀器對滴落血液的時序性變化進行分析，得到以下結論：人體血液在紅外光譜儀和紫外-可見分光光度計的照射下，得到的光譜圖具有相對穩定的出峰點。通過紅外光譜儀檢測發現，出峰點位置在860、1 650、2 350、3 300 cm-1附近。通過紫外-可見分光光度計檢測發現，出峰點位置為275、416、543、578 nm。雖然出峰點位置會有一定偏移，但偏移距離在允許偏移范圍內。利用紅外光譜儀和紫外-可見分光光度計檢測血痕，得到的光譜圖像變化主要集中在前2.0 h內，2.0 h后光譜圖像相對穩定。2.0 h后血痕光譜圖峰值產生變化的原因可能是外部環境的改變或儀器本身不穩定。

綜上，采用無損分析法檢測新鮮血液中不同化學基團的時序性變化趨勢，方法簡便，特征峰變化明顯，后續希望能建立較精確的數學模型推斷血痕形成時間，以便更好地研究血痕形成機制。