凝膠電泳與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)和探索

廖志銀，霍朝霞，翁登坡，趙魯杭，于曉虹

（浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 杭州 310058）

凝膠電泳與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是生命科學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常見的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。鑒于凝膠電泳與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的重要性和實(shí)用性，2012年起，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心已在“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”“分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)”等課程中增加了這一實(shí)驗(yàn)。以往的實(shí)驗(yàn)中使用的凝膠配方因?yàn)槟z各成分配比和交聯(lián)劑的比例沒有達(dá)到最優(yōu)，導(dǎo)致學(xué)生在制膠過程中頻頻出現(xiàn)問題，部分學(xué)生的膠聚合時(shí)間較長(zhǎng)，需45～60 min；部分學(xué)生制的膠不能聚合，需要反復(fù)重新配制，浪費(fèi)了大量時(shí)間，導(dǎo)致每組學(xué)生的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度不一致；因?yàn)閷?shí)驗(yàn)課時(shí)間有限，部分學(xué)生只能做前半部分實(shí)驗(yàn)，后半部分實(shí)驗(yàn)無法繼續(xù)進(jìn)行。此外，每批學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不穩(wěn)定，重復(fù)性差。為了使學(xué)生能順利體驗(yàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更好的重復(fù)性，本研究對(duì)交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)劑與丙烯酰胺的比例、催化劑的濃度、膠聚合時(shí)間以及制備時(shí)的溫度等影響制膠的因素進(jìn)行了改進(jìn)，使學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于穩(wěn)定，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。同時(shí)，本研究通過不斷調(diào)整和改進(jìn)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)中所用試劑的濃度和比例，使學(xué)生獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加容易，也使學(xué)生較好地理解和掌握了該實(shí)驗(yàn)技術(shù)，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)了學(xué)生的科學(xué)思維和探究能力[1]。

1 實(shí)驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法，基本原理：丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-Methylene Bis Acrylamide，MBA）在催化劑的作用下，經(jīng)過聚合交聯(lián)形成含有親水性酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈，相鄰的兩個(gè)鏈通過亞甲基橋交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠[2]。聚合的孔徑大小主要由凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定[3]，例如7.5%的凝膠孔徑平均為5 nm，30.0%的凝膠孔徑為2 nm左右。但交聯(lián)劑對(duì)電泳泳動(dòng)率也有影響，交聯(lián)劑質(zhì)量占總質(zhì)量的比例越大，電泳泳動(dòng)率越小[4-6]。

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)等學(xué)科研究領(lǐng)域中常用的實(shí)驗(yàn)方法[7-9]，基本原理：用特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過分析著色位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息[10]。經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Difluoride，PVDF）膜上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的未標(biāo)記的一抗發(fā)生免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影，檢測(cè)電泳分離的某種特定蛋白成分的存在和含量。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 總蛋白的提取

從20.0～30.0 g小鼠中取肝組織0.5 g，在濾紙上剪碎，放入玻璃勻漿管中，按1∶15的比例加入勻漿緩沖液，取2.00 mL離心管，各加入1.20 mL勻漿液，于4 ℃下13 000轉(zhuǎn)離心20 min后，取上清液于﹣20 ℃條件下保存，用于SDS-PAGE分離檢測(cè)。

2.2 凝膠的制備

2.2.1 分離膠的制備

改進(jìn)前后SDS-PAGE分離膠各成分用量如表1所示。

表1 改進(jìn)前后SDS-PAGE分離膠配制用量（10.00 mL）

2.2.2 濃縮膠的制備

改進(jìn)前后SDS-PAGE濃縮膠各成分用量如表2所示。

表2 改進(jìn)前后SDS-PAGE濃縮膠配制用量（5.00 mL）

2.3 待測(cè)液配制

將上一實(shí)驗(yàn)中取得的蛋白質(zhì)樣品液與5X蛋白質(zhì)樣品溶解液按4∶1混合均勻，制作成待測(cè)液，另外取出混合后的待測(cè)液一份，再用5X蛋白質(zhì)樣品溶解液稀釋一倍，制成濃度減半的待測(cè)液一份。

2.4 電泳與轉(zhuǎn)膜

在沸水浴中加熱標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品、Marker、待測(cè)樣品液3～5 min；待制膠完成后，用加樣槍頭或微量注射器，在樣品槽內(nèi)各加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品10 μL和待測(cè)樣品液10～15 μL、Marker 5～10 μL，穩(wěn)壓90 V電泳至含溴酚藍(lán)指示劑的樣品液泳動(dòng)到濃縮膠與分離膠結(jié)合處，調(diào)整電壓至110 V，電泳至指示劑泳動(dòng)到分離膠下端邊緣1.0～1.5 cm時(shí)再停止泳動(dòng)，時(shí)間控制在50～60 min。每個(gè)電泳槽內(nèi)雙面安放兩塊長(zhǎng)短玻璃板，其中一面玻璃板中的凝膠在結(jié)束本次凝膠電泳后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30 min，之后將凝膠放入150 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在脫色搖床上搖1～2 h進(jìn)行脫色；另一面長(zhǎng)短玻璃板中的凝膠立即進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將電泳好的凝膠放在去離子水中漂洗，按（負(fù)極）3層濾紙、凝膠、膜、3層濾紙（正極）的順序進(jìn)行，90 V恒壓1 h。取下膜后用TBST（用NaCl、KCl、Tris base和吐溫、純凈水及濃鹽酸配制的溶液）淋洗，待PVDF膜晾干后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 封閉、一抗反應(yīng)

取上述保存好的PVDF膜，甲醇激活，用TBST淋洗后，放入封閉液中，室溫?fù)u床輕搖1 h；取出PVDF膜，用TBST淋洗3遍，加入一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH），1∶2 000]，改進(jìn)前一抗使用濃度比為1∶5 000。取出PVDF膜后，用TBST漂洗3次，每次10 min。

2.6 二抗反應(yīng)

將PVDF膜放入用辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗體溶液中，室溫?fù)u動(dòng)1 h，仍用TBST洗滌3次，每次10 min。改進(jìn)前二抗?jié)舛缺葹?∶3 000，改進(jìn)后按1∶2 000進(jìn)行稀釋。

2.7 觀察、記錄

打開化學(xué)發(fā)光圖像分析儀，預(yù)冷20 min以上，使其電荷耦合元件（Charge Coupled Device，CCD）溫度在﹣30 ℃以下，用發(fā)光條進(jìn)行測(cè)試，圖像清晰完整方可用于拍攝。

將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（Enhanced Chemiluminescence，ECL）A、B按1∶1等量混合。將PVDF膜從器皿中取出，放到化學(xué)發(fā)光圖像分析儀上，在膜上加ECL，使其完全覆蓋膜表面，反應(yīng)1～3 min后進(jìn)行測(cè)定，讀取數(shù)據(jù)并保存。

3 結(jié)果與討論

3.1 制膠與考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果分析

用改進(jìn)前的凝膠配制方案，80.0%以上的學(xué)生配制的SDS-PAGE容易出現(xiàn)各種問題，如凝膠內(nèi)部極易產(chǎn)生氣泡（見圖1），凹槽“梳條”高低不平、不直、易彎曲，凹槽大小不均勻，凝膠聚合時(shí)間較長(zhǎng)；部分學(xué)生的凝膠不能良好地聚合，導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

圖1 改進(jìn)前的制膠結(jié)果

凝膠配制質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用改進(jìn)前的凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，分離條帶較粗，容易呈彎曲狀，拖尾，清晰度與分辨率均較差。

改進(jìn)凝膠配方后，將加樣梳從濃縮膠中拔出后，凹槽“梳條”具有良好的韌性，不易彎曲，不易斷裂，凹槽形狀完整（見圖2）；凝膠聚合時(shí)間縮短，同時(shí)受溫度影響較小，制備成功率高。分離膠與濃縮膠制備均可控制在20～30 min完成。改進(jìn)后，幾乎所有學(xué)生制膠都能成功，學(xué)生都能進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖2 改進(jìn)后的制膠結(jié)果

用預(yù)染Marker觀察電泳的進(jìn)程和Marker條帶的分離情況[11]，牛血清白蛋白（Bovine Albumin，BSA）67 kD純品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，和提取的總蛋白質(zhì)樣品同時(shí)用改進(jìn)后的凝膠進(jìn)行電泳。考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，經(jīng)2～3次脫色后，分離條帶清晰度與分辨率均極高，稀釋一倍后，雖然顏色變淡，分離條帶仍具有很好的清晰度與分辨率，同時(shí)條帶拖尾和彎曲現(xiàn)象明顯減少（見圖3）。改進(jìn)后，學(xué)生可清晰地觀察到蛋白質(zhì)樣品條帶，根據(jù)Marker推算出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（BSA）的相對(duì)分子質(zhì)量。改進(jìn)前，由于多數(shù)學(xué)生配制的凝膠質(zhì)量差，只有少數(shù)學(xué)生可以清晰地觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。完成第一步的SDS-PAGE，意味著蛋白質(zhì)印跡技術(shù)能順利應(yīng)用，是該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的關(guān)鍵步驟。

圖3 改進(jìn)后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

3.2 CCD成像檢測(cè)結(jié)果分析

凝膠配制質(zhì)量會(huì)直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)前，學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多不理想，由于跑膠后有些電泳條帶變成斜線或曲線，印記雜交顯影后有的條帶彎曲，有些條帶不清晰或不完整（見圖4A、B）。

此外，抗體濃度對(duì)顯影也有很大影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)不斷調(diào)整和改進(jìn)抗體的濃度，選擇最合適的濃度很有必要。在實(shí)驗(yàn)中不斷調(diào)整和改進(jìn)抗體濃度，一抗（GAPDH）濃度比由原來的1∶5 000調(diào)整為1∶2 000；二抗?jié)舛缺扔?∶3 000調(diào)整為1∶2 000。調(diào)整前，CCD成像直觀性不理想，背景條帶多而雜，發(fā)光條帶有的亮度過曝，有的顯示不足（見圖4C、D）。調(diào)整后，CCD成像合成結(jié)果Marker條帶與發(fā)光條帶相當(dāng)清晰，背景干凈，沒有亮度過曝情況（見圖5）。

圖4 改進(jìn)前的Western blotting CCD成像結(jié)果

圖5 改進(jìn)后的Western blotting CCD成像合成結(jié)果

SDS-PAGE是蛋白印跡雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟[12-13]，學(xué)生如果在這一步出現(xiàn)問題，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將無法進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)自開設(shè)以來，因技術(shù)步驟較多和操作復(fù)雜等，學(xué)生在操作過程中出現(xiàn)的問題較多，多數(shù)學(xué)生在制膠環(huán)節(jié)就失敗，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不能繼續(xù)進(jìn)行，或者每批學(xué)生的結(jié)果都不穩(wěn)定、重復(fù)性差，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不理想。為使學(xué)生熟練且穩(wěn)定地掌握該技術(shù)，本研究經(jīng)過長(zhǎng)期的摸索和實(shí)踐，反復(fù)改變實(shí)驗(yàn)條件，最后通過改進(jìn)凝膠各成分配比方案，有效增強(qiáng)了凝膠配制的時(shí)效性，大大提高了凝膠電泳后續(xù)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和成功率[14-15]。通過優(yōu)化蛋白質(zhì)印跡過程中關(guān)鍵試劑的使用濃度、控制ECL加樣時(shí)間，確保目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶清晰、結(jié)果理想。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間控制合理，制膠成功率高，印記雜交顯影后非特異性條帶少，可操作性強(qiáng)，學(xué)生滿意度較高。

改進(jìn)后，學(xué)生能熟練操作、完整體驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程，經(jīng)過蛋白質(zhì)提取、凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分段式練習(xí)，學(xué)生的動(dòng)手操作能力、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析能力和綜合思考能力都得到了有效鍛煉和提高。

4 結(jié)語

項(xiàng)目從蛋白質(zhì)的提取到SDS-PAGE分離檢測(cè)，再到蛋白印跡技術(shù)，3個(gè)部分具有良好的系統(tǒng)性和連貫性，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)、提高學(xué)生的綜合實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力具有很好的引導(dǎo)作用。因此，不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法、提高實(shí)驗(yàn)的成功率極其重要。該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生，特別是本科生得到了較強(qiáng)的實(shí)踐鍛煉和較好的操作體驗(yàn)，得到了系統(tǒng)性的培養(yǎng)，提高了學(xué)生對(duì)分子醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的興趣。掌握該實(shí)驗(yàn)的研究方法不僅能更好地為今后所涉及的前沿科學(xué)研究項(xiàng)目（如蛋白質(zhì)組學(xué)等研究）服務(wù)，也能促進(jìn)思考與判斷，拓寬學(xué)生的科研和創(chuàng)新思路，凸顯教學(xué)成效。