花生果腐病致病真菌的分離及抗性種質資源鑒定

朱立飛，張初署，唐月異，韋瀟，王冕，于強，宋福榮，張建成

(1.山東省花生研究所/農業農村部花生生物學與遺傳育種重點實驗室，山東 青島 266100；2.遼寧工程技術大學，遼寧 阜新 123000；3.青島天祥食品集團有限公司，山東 青島 266100)

花生(Arachis hypogaeaL.)是一種地上開花、地下結果的喜溫豆科作物，富含蛋白和油脂，是世界范圍內廣泛種植的油料和經濟作物。我國是花生生產和消費大國，花生總產量和出口量均占世界第一[1]。花生適宜種植在疏松的沙土地上，適應性較強，但其生長過程中土傳病害種類較多。已報道的花生土壤侵染性病害有多種，包括真菌性病害、細菌性病害和線蟲病害等。其中真菌病害主要有莖腐病、根腐病、果腐病等。

花生果腐病又稱“爛果病”。發病時，花生莢果果皮先出現深褐色的病斑，隨后病斑逐漸擴展到整個莢果，最終變黑、腐爛，不同發育階段的莢果均可受害。此外，果柄與莢果的結合部容易染病，發病后果柄與莢果結合不牢固，收獲時極易落果[2]，花生籽仁也會發黑霉爛，嚴重影響花生的產量和品質。該病2009年在河北新樂、定州、行唐和河南濮陽及山東部分地區造成大幅減產[3]。近年來此病在我國北方產區呈連年加重之勢，已成為花生生產上的主要病害，對花生產量和品質構成嚴重威脅。

花生果腐病的病原是復合病原(peanut pod rot complex)，包括病原真菌、植物寄生線蟲和土壤螨類等[4]。Frank[5]在1968年首次鑒定了花生爛果病的病原菌是群結腐霉(Pythium myriotylum)，而后分離出多種病原真菌。Garcia[6]在1975年證實，花生果莢埋在含有腐霉菌、鐮刀菌和根結線蟲的土壤中爛果更為嚴重。Shew等[7]在1979年證實，超過50%的花生莢果與伯氏嗜木螨屬(Caloglyphus)螨蟲有關，土傳螨顯著增加花生果腐病的發病率。Hollowell等[8]通過田間調查分離出絲核菌(Rhizoctonia)、腐霉菌(Pythium)和花生黑腐病菌(Cylindrocladium paraasiticum)等5種真菌。Cilliers[9]發現，南非花生果腐病病原是Chalara elegans。利比亞果腐病病原為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)及該屬其它種[10]。此外，Crous等[11]發現枝雙孢霉屬(Cylindrocladium)是導致花生果腐病的病原菌，Lombard等[12]在2009年分離得到該病菌，并于2010年對由Cylindrocladium引起的植物各種病害進行了統計分析[13]。

花生果腐病的病原復雜致使防控困難[14]。殺菌劑是農業防控果腐病的手段之一，但是這些殺菌劑都是針對腐霉菌和絲核菌等引起的花生果腐病，而對于其他真菌，例如鐮孢菌、糞殼菌等的防效未見報道。抗病育種是最經濟、安全有效的花生果腐病防控手段。已有研究表明，普通型花生更易感染花生果腐病，而珍珠豆型花生品種“Toalson”對于腐霉菌(Pythium)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)具有顯著抗性，花生品系Georgia Browne對立枯絲核菌也有一定抗性[15]，但是這種抗性花生種質資源較少。因此花生果腐病病原真菌的篩選、培養和致病性研究尤為重要。

本研究以花育917為試驗材料，從發生花生果腐病的籽仁中分離和鑒定出一株真菌(PPRF－05)，結合形態學觀察及ITS序列分析對菌種進行鑒定，并對本課題組保存的花生資源和突變體材料進行抗病鑒定，以期為開展花生果腐病抗病機理研究和育種提供理論基礎和種質材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種均為本實驗室育成并保存。花生離體組織取自花育917。

1.2 供試菌株的分離

將發生花生果腐病的莢果去掉外殼，發黃發黑籽仁浸泡于50 mL PDA液體培養基中，25℃過夜培養后倒掉籽仁，用脫脂棉過濾培養基。將過濾后的培養基3 000×g離心10 min后棄液體培養基，2 mL PDA培養基重懸菌體，后用涂抹法純化菌體至單菌落。

1.3 菌種鑒定

使用通用引物ITS5:5′－ACCCGCTGAACTTAAGC－3′，ITS4:5′－BTCCTGAGGGAAACTTCG－3′進行ITS序列擴增[16]，選擇單一明亮的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用BLAST進行序列比對。

1.4 花生各離體組織接菌

種子消毒:75%乙醇浸泡5 min，5%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗5～6遍，清水浸泡8 h，后置于水培培養箱中，25℃培養至四葉期。

離體組織的獲得:在超凈工作臺中，無菌水沖洗幼苗，滅菌剪刀剪下葉片、莖和根備用。子葉取自二葉期幼苗。將各種離體組織置于培養皿中浸濕的棉花上培養2 d備用。

接種:將花生不同組織置于超凈工作臺中，先用接種針輕輕劃傷花生組織表面，然后將直徑0.5 cm的菌餅置于傷口處，培養20 d，以不接種致病菌作為對照組。每組2個重復，每個試驗重復3次。

1.5 花生果腐病感－抗模型的建立

參考王冕等[17]的方法。不同品種均取飽滿、健康、無霉變的鮮種子，平分為兩份，一份直接接種果腐病病原菌，另一份進行培育并在幼苗子葉上接種病原菌。每天記錄鮮種子和幼苗子葉的發病率、病害嚴重程度以及病斑大小，對種子進行抗病分級。

鮮種子接種5 d出現病斑，發病率90%以上，接種點腐爛，病斑直徑0.5 cm以上為易感病(HS)品種；接種5 d出現病斑，發病率在70%～90%，接種點發黑，病斑直徑0.2～0.5 cm為感病(S)品種；接種7 d無病斑，發病率在10%～20%，接種發黃為抗病(R)品種；接種7 d無病斑，發病率在10%以下，接種點無變化，種子可以正常萌發為高抗病(HR)品種。

統計不同感抗病品種鮮種子對應的花生幼苗子葉發病情況，將對應的幼苗子葉發病情況作為花生果腐病感－抗模型。

易感病(HS):接種5 d出現病斑，發病率90%及以上，子葉整體發黑，接種點腐爛，病斑直徑1.0 cm以上；感病(S):接種5 d出現病斑，發病率在70%～90%，子葉整體發黃，接種點發黑，病斑直徑0.3～1.0 cm；抗病(R):發病率在10%～20%，接種點發黃；高抗病(HR):發病率在10%以下，接種點無變化，莖部正常生長。

1.6 花生抗病種質資源的篩選

將花生種子放在無菌水中浸泡8 h后鋪于平皿上培養至露白，水培至4片真葉，幼苗全長10～15 cm。將幼苗用無菌水洗凈，取花生子葉置于濕棉花上，25℃光照培養箱中光照16 h、黑暗8 h培養2 d待用。接菌后培養20 d，以不接種致病菌作為對照組，每天記錄子葉的發病率、病害嚴重程度以及病斑大小。導入花生果腐病感－抗模型中，篩選抗病品種。

2 結果與分析

2.1 菌株PPRF－05的分子生物學鑒定

從發生花生果腐病籽仁中分離出一株菌株PPRF－05，對其ITS區域進行測序(圖1)，根據Blastn結果進行序列注釋，并提交到GenBank上注冊，序列號:MH368499。其ITS序列經比對與Fusarium oxysporum相似度為100%，確定該菌為尖孢鐮刀菌，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.18130。

圖1 菌株PPRF－05的ITS序列

2.2 菌株PPRF－05的形態特征

PPRF－05接種在PDA培養基上，氣生菌絲為白色絮狀，隨著培養時間增加，培養基質由紅色轉為紫紅色(圖2A)；老熟菌絲上產生許多直徑為1.5 mm的疏松絮狀菌核，及大型鐮刀形分生孢子和小型橢圓形分生孢子(圖2B)。

圖2 菌株PPRF－05的形態特征

2.3 花生各離體組織接種PPRF－05后的癥狀

接種3 d后，花生各組織表現出發黃、發黑等果腐病癥狀。接種7 d后，花生莖略有發黃、發紫，與對照相比沒有明顯變化(圖3A)；子葉接種位置明顯腐爛，并向未接種位置擴散(圖3B)；根系主根明顯發黑，并向未接種位置擴散，對照根系發黃(圖3C)；葉片在接種7 d后出現病斑、發黃并向未接種位置擴散(圖3D)；此外，PPRF－05菌株可以侵染花生種子的任一發育階段(圖3E)。

圖3 花生各離體組織接種PPRF－05后的癥狀

2.4 花生果腐病感－抗模型的建立

接種5 d后，種子發病情況如圖4所示。種子抗病分級情況及對應幼苗子葉發病情況如表1、表2所示，以此作為花生果腐病感－抗模型。

表1 鮮種子抗病性分級

表2 幼苗子葉感病統計

圖4 鮮種子發病情況

表2(續)

2.5 花生種質資源鑒定

用上述感－抗模型對種質資源進行抗果腐病篩選鑒定，結果顯示:花育36和花育915為易感品種；花育20和花育24為感病品種；花育916和花育50為抗病品種；T1611和R18－4為高抗品系(表3)。

表3 種質資源抗病分級

表3(續)

3 討論與結論

花生果腐病的病原復雜多樣，Csinos[18]在1986年分離出Rhizoctonia、Pythium和Cylindrocladium等6種真菌，同時明確不同地域或同一地域不同年份的病原微生物組成存在差異；另外土壤環境因素的改變也可能加重果腐病的發生，甚至某些營養元素的改變會導致果腐病的發生。王傳堂等[3]利用分子克隆技術，發現萊西農場的果腐病與真菌感染有關，并且鐮刀菌可能是主要病原。李術臣等[19]研究發現，在中國臺灣地區花生果腐病的主要病原有Fusarium solani、Rhizoctionia solani和Pythium myriotylum及寄生性線蟲等；河北省病原種類與其基本一致，都是多真菌病害共同作用的結果。本研究分離得到的PPRF－05菌株，ITS區測序表明其屬于鐮刀菌屬。

感染果腐病的花生植株地上部與正常植株無差異，但莢果發黑腐爛，不易發現[20]。病害嚴重的植株莖葉濃綠，收獲期無明顯落葉現象，秧苗不死，根系繁茂但表皮發黑，但莢果幾乎全部腐爛[21]。本研究將PPRF－05菌株接種花生各離體組織，根、子葉出現明顯的發黑腐爛現象，莖和葉片出現病斑，但癥狀較輕。與果腐病的發病癥狀一致，進一步證實PPRF－05菌株是果腐病的主要致病菌。

目前，關于花生果腐病的研究主要集中在病原菌的分離鑒定及其致病性，在抗果腐病花生種質資源篩選鑒定方面相對較少。2018年何美敬等[22]通過田間自然發病對引進的77份美國資源和39份國內資源進行連續2年的鑒定；于靜等[23]采用自然病圃鑒定法，對萊西試驗站76個花生品種(系)進行了花生果腐病抗性評價。我國對花生果腐病的抗性種質資源篩選采用的是Wheeler等[24]的果腐病等級劃分法以及何美敬等[22]建立的田間抗性評價體系。本研究建立的離體接種快速篩選方法，能夠在實驗室內簡潔、高效地篩選抗病品種。下一步將對篩選所得花生品種進行田間試驗，結合何美敬等[22]引入的田間抗性評價體系，進一步驗證離體接種快速篩選方法的可行性，為抗果腐病花生品種快速選育提供新路徑。