家族性腺瘤性息肉病與散發(fā)性結(jié)直腸腺瘤血清代謝物特征譜的比較分析

尹馥梅， 郭家池， 許俊鋒， 張 杰， 王鳳玉， 潘元明， 盛劍秋，

1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科； 3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部； 4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院腫瘤研究中心

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP)和散發(fā)性結(jié)直腸腺瘤(colorectal adenoma，CRA)是結(jié)直腸癌主要的癌前病變，其中85%～90%的結(jié)直腸癌來源于CRA[1]，1%來源于FAP[2]。FAP作為一種常染色體顯性遺傳病，若不及時(shí)處理，結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)可達(dá)100%，遠(yuǎn)高于CRA。FAP發(fā)生腺瘤通常由家族性腺瘤樣結(jié)腸息肉病易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)等位基因發(fā)生突變引起[3]，其中一個(gè)等位基因發(fā)生遺傳突變，而另一等位基因發(fā)生體細(xì)胞突變或基因缺失，進(jìn)而導(dǎo)致功能性APC蛋白缺失和β-連環(huán)蛋白異常蓄積[4]。近年來，隨著代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的研究開始關(guān)注疾病相關(guān)代謝物的變化，其中血液代謝物的異常分布與結(jié)直腸癌的發(fā)展已成為研究熱點(diǎn)[5-6]。有研究[7]表明，APC基因突變致使Wnt信號(hào)通路及其靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活后會(huì)引起代謝譜的改變。因此，本研究基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography and tandem mass-spectrometry，UPLC-MS/MS)檢測(cè)平臺(tái)，通過Metwell數(shù)據(jù)庫(kù)和多元統(tǒng)計(jì)分析，比較FAP與CRA患者的血清代謝物差異，篩選出FAP特異性代謝譜，為其發(fā)病機(jī)制的深入研究提供新的思路，同時(shí)根據(jù)重要代謝譜特征，為FAP疾病的發(fā)展建立預(yù)警指標(biāo)模型提供相關(guān)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象在2017年3月1日至2020年12月31日于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)鏡中心行結(jié)腸鏡檢查的患者中進(jìn)行篩選。最終共收集32例受試者，包括FAP患者(n=24)和性別、年齡相匹配的CRA患者(n=8)。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2022-132)，所有受試者均同意留取血液標(biāo)本，并簽署知情同意書。

1.2 血液標(biāo)本收集及保存晨起空腹采集外周血5 ml(采用不含抗凝劑的真空采血管)，靜置60 min待血液凝固。隨后，以3 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。最后將上清液分裝至凍存管，保存在-80 ℃冰箱中。

1.3 血清樣品制備從-80 ℃冰箱中取出血清樣品，在4 ℃下解凍。取100 μl血清于EP管中，加入甲醇300 μl。隨后，使用攪拌機(jī)(MM400，Retsch)，渦旋3 min后，在12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。最后，取上清液于新的EP管中，在12 000 r/min，4 ℃條件下再次離心3 min后，吸取上清液保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括UPLC-MS/MS。液相條件主要包括：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：A相為超純水(0.04%的乙酸)，B相為乙腈(0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min水/乙腈(95∶5 V/V)，11.0 min為5∶95 V/V，12.0 min為5∶95 V/V，12.1 min為95∶5 V/V，15.0 min為95∶5 V/V；流速0.4 ml/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μl。質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和代謝組學(xué)分析

1.5.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理：基于Metwell數(shù)據(jù)庫(kù)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，使用軟件Analyst1.6.1對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的一級(jí)譜、二級(jí)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。通過MultiaQuant軟件，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)進(jìn)行定量分析，對(duì)色譜峰進(jìn)行積分和校正，每個(gè)色譜峰的曲線下面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。

1.5.2 質(zhì)控分析：本實(shí)驗(yàn)主要采用的是主成分分析(principal component analysis，PCA)，我們?cè)赑CA過程中每10個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入1個(gè)質(zhì)控樣本(quality control，QC)，以監(jiān)測(cè)血清樣本分析過程的重復(fù)性和穩(wěn)定性。其中，QC由樣本提取物混合制備而成。QC樣本聚集得越好，就越表明儀器的穩(wěn)定，則采集到的數(shù)據(jù)質(zhì)量越好。

2 結(jié)果

2.1 FAP和CRA患者的臨床資料本研究共納入32例受試者，24例FAP患者分別來自22個(gè)確診的FAP家系，男12例，女12例，年齡(38.0±14.9)歲(16～69歲)；8例CRA患者選自我院消化內(nèi)科門診，男4例，女4例，年齡(42.4±5.2)歲(34～52歲)。兩組患者在性別(P=0.5)和年齡(P=0.43)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)AP和CRA患者的結(jié)腸鏡下表現(xiàn)和病理特征如圖1所示。

2.2 FAP與CRA的血清代謝譜比較PCA評(píng)分圖顯示了CRA與FAP組之間的分離趨勢(shì)，兩組之間存在明顯差異(見圖2A)。隨后構(gòu)建OPLS-DA模型，并基于238種代謝物，選出前10個(gè)上調(diào)(紅色標(biāo)記)和前10個(gè)下調(diào)的(綠色標(biāo)記)代謝物(見圖2B)。通過兩個(gè)正交成分和一個(gè)預(yù)測(cè)成分(R2X=0.619，R2Y=0.999，Q2Y=0.995)(見圖2C)來證明建模和預(yù)測(cè)能力。進(jìn)一步對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行排列驗(yàn)證(n=200，即進(jìn)行200次排列實(shí)驗(yàn))(見圖2D)。最終結(jié)果表明，通過UPLC-MS/MS檢測(cè)的FAP患者的血清代謝譜與CRA組不同。

2.3 FAP血清特異性代謝物篩選基于OPLS-DA模型的結(jié)果，我們同時(shí)選擇符合VIP值(≥1)和FC(≤0.5或≥2)條件的代謝物，最終確認(rèn)了85個(gè)顯著差異代謝物，其中20個(gè)上調(diào)代謝物，65個(gè)下調(diào)代謝物。圖3A的火山圖展示了FAP組和CRA組血清代謝物表達(dá)的差異。為了進(jìn)一步挖掘代謝物的變化，我們對(duì)具有顯著差異的代謝物進(jìn)行了歸一化處理，并繪制了聚類熱圖(見圖3B)。與CRA組相比，反，反-粘康酸(Trans, Trans-muconic acid)是FAP患者代謝物中表達(dá)下降最為顯著的一種，其倍數(shù)變化最大(FC=483.4)。1，5-無水葡萄糖醇(1,5-anhydro-D-glucitol)是FAP患者中表達(dá)增加最為顯著的代謝物(FC=4.33×10-5)。如圖2B所示，顯著上調(diào)前10位的血清代謝物包括1，5-無水葡萄糖醇、阿糖肌苷(Hypoxanthine-9-B-D-arabinofuranoside)、苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)、D-木糖酸鋰鹽(D-xylonic acid lithium salt)、3-甲基-2-氧基丁酸(3-methyl-2-oxobutanoic acid)、D-天冬氨酸(D-aspartic acid)、乳清酸(Orotic acid)、氫化肉桂酸(Hydrocinnamic acid)、L-鳥氨酸(L-ornithine)和2，6-二氨基庚二酸(2,6-Diaminooimelic acid)。顯著下調(diào)的前10位血清代謝物包括反，反-粘康酸(Trans, Trans-muconic acid)、L-瓜氨酸(L-citrulline)、N-乙酰-L-亮氨酸(N-acetyl-L-leucine)、牛磺鵝脫氧膽酸(Taurochenodesoxycholic acid)、甘氨脫氧膽酸(Glycodeoxycholic acid)、L-無水天冬酰胺(L-asparagine anhydrous)、甲基丙二酸(Methylmalonic acid)、牛磺膽酸(Taurocholic acid)、甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholic acid)和棕櫚烯酸[Palmitoleic acid (C16∶1)]。

注：A：PCA圖；B：前10個(gè)上調(diào)(紅色標(biāo)記)和前10個(gè)下調(diào)(綠色標(biāo)記)的代謝物；C：OPLS-DA圖(R2X、R2Y和Q2Y是評(píng)估模型的預(yù)測(cè)參數(shù)，這三個(gè)指標(biāo)越接近1，模型越穩(wěn)定且可靠，Q2Y>0.5視為有效模型，Q2Y>0.9視為出色的模型)；D：OPLS-DA模型驗(yàn)證。

2.4 FAP特異性代謝物功能分析KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，如圖3C～3D所示，與CRA組相比，F(xiàn)AP組有77個(gè)關(guān)鍵代謝途徑改變，其中主要涉及氨基酸和核苷酸代謝(包括谷胱甘肽代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)、碳水化合物代謝和脂肪酸代謝等。本研究將主要關(guān)注表1中碳水化合物和氨基酸的改變。與CRA組相比，F(xiàn)AP患者的1，5-無水葡萄糖醇表達(dá)明顯升高，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖表達(dá)下降。在氨基酸中，甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達(dá)顯著降低。

表1 通過KEGG分析鑒定的碳水化合物和氨基酸代謝中的主要代謝產(chǎn)物

注：A：火山圖(每個(gè)點(diǎn)代表代謝物)；B：聚類熱圖；C：KEGG注釋代謝物分類；D：KEGG富集的代謝產(chǎn)物分類。

3 討論

近年來，分析和監(jiān)測(cè)與疾病相關(guān)的代謝改變，尤其是腫瘤微環(huán)境與代謝途徑的變化，以探索更多的潛在機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究[8]通過SW480細(xì)胞和APCmin/+小鼠表達(dá)APC基因截短蛋白表明，APC基因突變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝譜的改變。然而，截至目前在FAP患者中分析APC突變引起的代謝組學(xué)變化的研究甚少。本研究通過UPLC-MS/MS分析，首次比較分析了FAP和CRA的血清代謝譜特征，掌握了APC基因突變引起的代謝特征。共篩選出85種在兩組中具有明顯差異的代謝物，包括表達(dá)上調(diào)的20種和表達(dá)下調(diào)的65種。進(jìn)一步通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，與CRA組相比，F(xiàn)AP患者的碳水化合物代謝中，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖的表達(dá)均下降，而1，5-無水葡萄糖醇的表達(dá)明顯升高。同時(shí)FAP患者氨基酸代謝異常，包括甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達(dá)顯著降低。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)AP患者血清中存在特征性代謝譜改變，涉及碳水化合物代謝和氨基酸代謝。有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，APC基因突變導(dǎo)致功能喪失引起Wnt/β-catenin信號(hào)過度激活，可能調(diào)控三羧酸(Tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)和氨基酸代謝相關(guān)的通路。

與CRA相比，在FAP患者的碳水化合物代謝中，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖的表達(dá)均下降，而1，5-無水葡萄糖醇的表達(dá)明顯升高。這些代謝物均與糖酵解、TCA循環(huán)等碳水化合物相關(guān)，可能是因?yàn)镕AP患者的高腺瘤負(fù)荷導(dǎo)致的能量供給不足[10]。FAP患者的1，5-無水葡萄糖醇是急性葡萄糖波動(dòng)(葡萄糖峰值)的標(biāo)志物，其表達(dá)升高表明體內(nèi)存在低血糖，可能成為監(jiān)測(cè)FAP患者癌變的潛在生物標(biāo)志物[11]。

與CRA相比，我們發(fā)現(xiàn)FAP患者的甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達(dá)均顯著降低。其中異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸為必需氨基酸。細(xì)胞需要攝入必需氨基酸維持基本生命活動(dòng)。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)必需氨基酸的需求明顯增加[12]。這與我們的研究一致，F(xiàn)AP患者的平均腺瘤數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CRA患者，同時(shí)與CRA患者相比，F(xiàn)AP患者對(duì)異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸等必需氨基酸的高消耗可能用于維持腫瘤細(xì)胞的快速增殖。谷氨酰胺不是必需氨基酸，它在人體內(nèi)可由谷氨酸、異亮氨酸和纈氨酸合成。腫瘤細(xì)胞使用谷氨酰胺分解過程中產(chǎn)生的介質(zhì)來參與三羧酸循環(huán)促進(jìn)細(xì)胞能量代謝[13-14]。同時(shí)，谷氨酰胺和甘氨酸、半胱氨酸參與合成谷胱甘肽，其具有抗氧化功能。胱氨酸是由兩個(gè)半胱氨酸通過二硫鍵形成的。在腸道腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞通過糖酵解消耗大量的氧，進(jìn)而產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen，ROS)。ROS的積累對(duì)生物分子造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。因此，腫瘤細(xì)胞中需要大量的抗氧化劑(例如谷胱甘肽)來平衡ROS的產(chǎn)生[16]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)相較于CRA患者，F(xiàn)AP患者的谷氨酸和甘氨酸的表達(dá)下調(diào)，這可能與FAP患者息肉負(fù)荷量大，進(jìn)而需要足量的谷氨酰胺和谷胱甘肽相關(guān)。胱氨酸的表達(dá)顯著降低可能是谷胱甘肽需求增加導(dǎo)致半胱氨酸的過量消耗。谷氨酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成天冬氨酸，天冬氨酸和瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶的作用下生成精氨琥珀酸，并進(jìn)一步生成精氨酸，完成尿素循環(huán)。有研究[10]表明在FAP患者中，瓜氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的表達(dá)濃度顯著降低，可能是由于APC基因突變引起了氨基酸譜的變化。

本研究通過UPLC-MS/MS法檢測(cè)CRA與FAP患者的血清代謝物，篩選出FAP特征性代謝譜，并通過KEGG功能注釋和富集分析闡明其重要相關(guān)的代謝通路途徑，可為APC基因突變誘導(dǎo)的代謝組學(xué)改變進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的深入機(jī)制研究提供新的思路。此外，定期監(jiān)測(cè)FAP患者的血清代謝物改變，可為疾病的發(fā)展提供預(yù)警。同時(shí)，根據(jù)FAP患者的特征性小分子代謝物改變，為FAP從腺瘤發(fā)展為結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防提供新的依據(jù)。本研究受限于單中心、小樣本，研究結(jié)論有待多中心以及擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證。