腫瘤相關(guān)糖蛋白72在胃癌組織和外周血中的表達(dá)及臨床意義

何秋鳳， 李 琳， 張彩麗， 朱元民

1.北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 航天中心醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100049；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科

2020年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌在常見(jiàn)惡性腫瘤中位居第五，且位于腫瘤相關(guān)死亡率的第四位[1]。尋找有效、特異的胃癌分子標(biāo)志物對(duì)于疾病診斷、治療、預(yù)后判斷具有重要意義。

腫瘤相關(guān)糖蛋白72(tumor-associated glycoprotein 72，TAG-72)是一種具有黏膜特性的膜結(jié)合高分子糖蛋白復(fù)合物[2]。該分子在1981年首次被發(fā)現(xiàn)，后證實(shí)在多種腫瘤組織中高表達(dá)。TAG-72可分泌至外周血，稱為糖類抗原724(carbohydrate antigen 724，CA724)，是臨床上常見(jiàn)的上皮腫瘤標(biāo)志物[3-5]。基于中國(guó)人群的薈萃分析顯示，相比CEA、CA199等其他腫瘤標(biāo)志物，血清CA724是診斷胃癌特異性和敏感性最高的分子標(biāo)志物，其敏感性和特異性分別為50%和80%[6]。目前TAG-72在胃癌中的研究主要集中于CA724在胃癌診斷中的應(yīng)用，尚缺乏組織中TAG-72表達(dá)情況及臨床意義的研究以及二者相關(guān)性的分析。

本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)胃癌組織中TAG-72的表達(dá)情況，旨在探究組織TAG-72與胃癌患者臨床病理特征及生存預(yù)后之間的關(guān)系，并分析胃癌組織及術(shù)前外周血中TAG-72在表達(dá)水平、臨床意義方面的相關(guān)性及差異性。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選用1996年1月至2007年1月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本149例。入選標(biāo)準(zhǔn)為：患者在手術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何化療或放療；所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查證實(shí)。胃癌的分期采用AJCC癌癥分期手冊(cè)第7版[7]?；颊吣?7例，女52例，平均年齡60歲(51～67.5歲)。TNM分期包括Ⅰ期13例，Ⅱ期24例，Ⅲ期92例，Ⅳ期20例；癌細(xì)胞侵襲深度包括T16例，T218例，T319例，T4106例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移包括N118例，N237例，N366例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例；分化類型包括低分化113例，中分化29例，高分化7例。其中，71例胃癌標(biāo)本檢測(cè)有術(shù)前外周血CA724值3.16 U/ml(1.35～8.65 U/ml)。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織TAG-72檢測(cè)：免疫組化技術(shù)采用EnVision二步法。組織切片脫蠟止水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，EDTA9.0修復(fù)液高壓修復(fù)3 min，質(zhì)量濃度為100 g/L的羊血清封閉液室溫封閉1.5 h，滴加一抗兔抗人多克隆抗體(abcam，ab16838)、4 ℃孵育過(guò)夜(>14 h)。滴加二抗(Dako，K5007)，室溫孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，透明，樹(shù)脂封片。染色評(píng)分根據(jù)染色強(qiáng)度分為四級(jí)：0，陰性；1，弱陽(yáng)性；2，中等強(qiáng)度；3，強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性面積分為五級(jí)：0，無(wú)陽(yáng)性染色；1，陽(yáng)性面積<10%；2，陽(yáng)性面積10%～20%；3，陽(yáng)性面積20%～50%；4，陽(yáng)性面積>50%。染色強(qiáng)度與染色面積的評(píng)分綜合判定標(biāo)準(zhǔn)如下：-，無(wú)細(xì)胞著色；±，<10%的細(xì)胞著色；+，10%～20%的細(xì)胞呈弱陽(yáng)性至中度著色；++，10%～20%的細(xì)胞呈中等強(qiáng)度染色或20%～50%的細(xì)胞弱陽(yáng)性著色；+++，20%～50%的細(xì)胞呈中等強(qiáng)度以上著色，或>50%的細(xì)胞呈陽(yáng)性著色。根據(jù)評(píng)判結(jié)果將TAG-72表達(dá)分為陰性表達(dá)(-，±)及陽(yáng)性表達(dá)(+，++，+++)兩組。

1.2.2 術(shù)前血清CA724檢測(cè)：采集研究對(duì)象空腹靜脈血3 ml，離心(4 000 r/min)5 min后，取上層血清，采用羅氏Elecsys 602型電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，檢測(cè)受試者術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物CA724，試劑由羅氏公司配套提供，按說(shuō)明書操作。CA724正常值參考范圍為0～6.9 U/ml，超過(guò)參考值為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件和Graph-Pad Prism 8.0(GraphPad，San Diego，CA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。TAG-72表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法和Log-Rank法評(píng)估TAG-72陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的生存率；采用Cox回歸分析評(píng)估多個(gè)變量對(duì)生存的影響；分類變量的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAG-72在胃癌組織、癌旁正常組織中的表達(dá)各組織標(biāo)本基本情況如表1所示。采用免疫組化法檢測(cè)TAG-72在胃癌中的表達(dá)。TAG-72在胃癌組織中呈棕黃色染色，定位于胞漿和/或胞膜(見(jiàn)圖1)。TAG-72在胃癌組織中的陽(yáng)性率為53.02%(79/149)，高于癌旁正常組織的陽(yáng)性率12.94%(11/85)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，TAG-72在20例腸化組織中有19例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率95.00%(見(jiàn)圖2)。

注：A：癌旁正常組織(陰性)；B：胃癌組織(陰性)；C：胃癌組織(++)；D：胃癌組織(+++)；E：腸化組織(++)；F：腸化組織(+++)。

表1 各組織標(biāo)本基本情況

續(xù)表1

2.2 TAG-72表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系分析149例胃癌患者組織中TAG-72表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，TAG-72表達(dá)與性別、年齡、分化程度、TNM分期、癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 TAG-72表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系[例數(shù)(%)]

2.3 TAG-72表達(dá)與生存預(yù)后密切相關(guān)生存分析顯示,TAG-72表達(dá)陽(yáng)性組總體生存率顯著低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=5.380，P=0.02)(見(jiàn)圖3A)；TAG-72表達(dá)陽(yáng)性組的5年生存率也顯著低于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=7.058，P=0.008)(見(jiàn)圖3B)。Cox回歸分析顯示，TAG-72表達(dá)、年齡、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

注：A：總體生存曲線；B：5年生存曲線。

表3 胃癌患者死亡率的多因素分析

2.4 胃癌患者組織TAG-72表達(dá)與術(shù)前外周血CA724相關(guān)性149例胃癌標(biāo)本中有71例進(jìn)行術(shù)前外周血CA724檢測(cè)，采用Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者組織中TAG-72表達(dá)與術(shù)前外周血中CA724表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.314(P=0.008)，為弱相關(guān)。

2.5 術(shù)前外周血CA724與胃癌患者預(yù)后無(wú)關(guān)分別分析71例胃癌患者組織和術(shù)前外周血中TAG-72表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，胃癌組織TAG-72表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組患者5年生存率有顯著差異(Log-Rankχ2=5.638，P=0.018)(見(jiàn)圖4A)；而術(shù)前外周血CA724陽(yáng)性組與陰性組間5年生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.416)(見(jiàn)圖4B)。進(jìn)一步聯(lián)合組織和血清TAG-72判斷胃癌患者5年生存率，結(jié)果顯示,組織-/血清-雙陰性患者生存最優(yōu)，而組織+/血清-患者預(yù)后最差(見(jiàn)圖4C)。

注：A：5年生存曲線(TAG-72)；B：5年生存曲線(CA724)；C：5年生存曲線(TAG-72聯(lián)合CA724)。

3 討論

TAG-72在多種腫瘤組織中高表達(dá)，而正常人體細(xì)胞中缺乏表達(dá)，其“腫瘤特異性”備受關(guān)注，已作為腫瘤識(shí)別靶點(diǎn)應(yīng)用于放射免疫等領(lǐng)域，可顯著改善患者預(yù)后[8]?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)出針對(duì)TAG-72的B72.3抗體和CC49抗體用于分子檢測(cè)及治療[9-10]。在胃癌中，目前針對(duì)TAG-72的研究多關(guān)注外周血CA724在胃癌診斷中的價(jià)值和應(yīng)用[11-13]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，胃酸中高水平TAG-72是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。而TAG-72在胃癌組織中的表達(dá)、功能以及與患者生存預(yù)后之間的關(guān)系尚未明確。本研究對(duì)胃癌組織中TAG-72表達(dá)情況及其臨床意義進(jìn)行研究，為TAG-72作為胃癌腫瘤靶點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)TAG-72在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，與劉棟才等[4]研究結(jié)果一致。TAG-72在胃癌中普遍高表達(dá)這一特性提示其或可成為其他藥物、工程細(xì)胞等識(shí)別胃癌細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)。胃癌通常是由多階段分子改變積累形成的復(fù)雜過(guò)程，從非萎縮性胃炎到萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生，最后發(fā)展為浸潤(rùn)性癌，其中腸上皮化生被認(rèn)為是胃癌的重要癌前病變[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)TAG-72在腸化組織中的表達(dá)率高達(dá)95%，提示TAG-72可能參與腸型胃癌早期發(fā)生過(guò)程，或可成為胃黏膜腸上皮化生的標(biāo)志物。但本研究腸化組織樣本量較小，尚需要進(jìn)一步功能研究闡釋TAG-72與腸化之間的關(guān)系。

我們的分析顯示TAG-72表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)間并無(wú)相關(guān)性。低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移患者其TAG-72表達(dá)陽(yáng)性率高于中-高分化、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TAG-72可能通過(guò)其他腫瘤生物學(xué)特征影響胃癌患者生存預(yù)后。既往研究[17]表明，腫瘤細(xì)胞表面的大分子糖蛋白可以和免疫細(xì)胞表面的凝集素結(jié)合或抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能參與腫瘤免疫逃逸。TAG-72作為膜表面糖蛋白分子，免疫逃逸可能是TAG-72影響胃癌發(fā)生發(fā)展的效應(yīng)途徑之一，有待進(jìn)一步功能研究明確。而大分子糖蛋白由于其糖鏈緊密包裹蛋白分子，難以實(shí)現(xiàn)蛋白敲低和過(guò)表達(dá)。受限于實(shí)驗(yàn)技術(shù)，針對(duì)TAG-72的功能研究相對(duì)缺乏，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展，TAG-72在胃癌中的功能機(jī)制有望突破。

本研究證實(shí)TAG-72陽(yáng)性表達(dá)的胃癌患者總體生存率和5年生存率低于陰性表達(dá)患者，高表達(dá)TAG-72是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這與一項(xiàng)在結(jié)直腸腺癌中的研究結(jié)論相同[3]，進(jìn)一步提示TAG-72可能具有影響腫瘤患者預(yù)后的重要分子生物學(xué)功能。

外周血CA724是目前胃癌篩查常用的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性和敏感性并不高，不能充分滿足臨床要求[6]。胃癌組織細(xì)胞表達(dá)和分泌TAG-72，進(jìn)入外周血后稱為CA724。本研究分析了術(shù)前CA724和腫瘤組織中TAG-72表達(dá)間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者存在正相關(guān)，但相關(guān)程度弱，相關(guān)系數(shù)僅為0.314，這或能部分解釋TAG-72在胃癌組織中高表達(dá)而術(shù)前CA724用于胃癌診斷則敏感性不足。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組織中TAG-72表達(dá)與預(yù)后顯著相關(guān)，而術(shù)前CA724與患者預(yù)后無(wú)關(guān)。該結(jié)果提示胃癌患者術(shù)前CA724檢測(cè)與組織TAG72表達(dá)具有不同臨床含義，前者更具診斷價(jià)值，后者則對(duì)預(yù)后判斷更具意義。

綜上所述，TAG-72在胃癌組織和腸化組織中高表達(dá)，是胃癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有望作為胃癌潛在的治療靶標(biāo)和預(yù)后判斷指標(biāo)。術(shù)前外周血CA724與組織TAG-72在表達(dá)水平上呈弱相關(guān)，術(shù)前外周血CA724在預(yù)后判斷方面價(jià)值有限。TAG-72在胃癌中的機(jī)制尚未闡明，免疫逃逸可能是效應(yīng)途徑之一，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，其在胃癌中的分子機(jī)制有望實(shí)現(xiàn)突破。