羊乳中摻入牛乳的鑒別技術研究進展

岳明星，簡偉杰，陳 思，李 浡，危 晴，陳 亮，辛秀蘭

（北京電子科技職業學院生物工程學院，北京 100176）

現代營養學研究發現，羊乳與人乳蛋白質組成相似，氨基酸比例接母乳，營養成分均衡，消化時間短。另外，羊乳脂肪球小，中短鏈脂肪酸含量高，易于人體消化吸收，更適合嬰兒、中老年人食用。羊乳可降低嬰幼兒發生過敏的幾率，與牛乳相比，羊乳含有更多易于消化吸收的a-乳清蛋白，含有較少的致敏蛋白αs1-酪蛋白，可解除或緩解大部分寶寶因牛奶蛋白引起的過敏癥。同時，羊奶中免疫球蛋白、核苷酸等天然成分含量也比較高，對嬰幼兒的生長發育大有益處。因此，羊乳以其營養豐富、易于吸收等優點被稱為“奶中之王”，是世界上公認的最接近于人奶的乳品[1]。

但羊乳產量低、養殖要求高，價格高于牛乳。莎能奶山羊產奶量最高，年產奶量僅為600~1 200 kg，而一頭荷斯坦奶牛平均年產7 000~10 000 kg，最高可達12 000 kg。因為羊奶的資源相對牛奶要珍貴很多，奶山羊與奶牛對生存環境的要求不同，奶牛適宜圈養，喂人工飼料，而奶山羊適宜放牧養殖，以吃青草和干草為主，不喂人工飼料。在國際市場上羊奶比牛奶普遍貴2~5倍。另外，羊奶具有極高的營養價值、醫療保健價值和美容護膚價值。因此，羊奶價格比牛奶高的事實很難改變。

在國際市場，羊乳產品的生產和銷售呈現出強勁的增長勢頭。近年來，我國的羊乳制品在市場上得到了消費者的認可，不少消費者選擇了喝羊乳。嬰幼兒羊乳粉的價格也普遍高于牛乳粉。

近年來，隨著羊乳消費人數的增加和消費市場的不斷擴大，在羊乳中摻入牛乳的現象時有發生。為了降低成本、提高供應量，一些不法商販在羊乳及羊乳制品（如奶粉、酸奶、奶酪等）中摻牛乳成分冒充羊乳，以此來欺騙消費者。同時，羊乳中摻入牛乳的行為可能會導致對牛乳過敏者不知情況下誤食，發生過敏反應，危害消費者健康與嬰幼兒的生命安全[2]。

針對這一問題，如何快速鑒別羊乳中摻入牛乳，對保障消費者安全、保護守法羊乳企業的合法權益具有重要意義。如何快速鑒別羊乳及其制品中摻入牛乳源成分，保證羊乳的營養健康和質量安全對維護羊乳制品消費市場健康可持續發展至關重要。從電泳法、免疫法、色譜法等方面鑒別分析了羊乳中摻入牛乳，對不同方法的靈敏度、檢出限進行了對比。

1 羊乳與牛乳主要組分比較

鑒別之前，熟知羊乳和牛乳組分含量差異是非常必要的，以找到合適的標記成分進行鑒別摻假。

羊乳與牛乳中蛋白質種類及含量[3]見表1。

表1 羊乳與牛乳中蛋白質種類及含量/g·（100 g蛋白質）-1

從表1可看出，羊奶與牛奶組成相近，但其各組分含量存在差別，因此這些組分差距是建立鑒別方法的依據。

2 電泳法

2.1 聚丙烯凝膠電泳法（SDS-PAGE）

SDS-PAGE是分析蛋白的一種常用技術，技術原理是通過各種蛋白分子量大小、攜帶電荷數的不同導致的遷移速率不同而進行分離。Tamimed A Y等人[4]利用SDS-PAGE法對αs1-酪蛋白進行標記，發現牛乳中αs1-酪蛋白的遷移速率顯著高于羊乳中αs1-酪蛋白。Kaminarides S E等人[5]利用牛乳酸乳中的副κ-酪蛋白為標記成分，對羊乳酸乳進行檢測，牛乳檢出限為1%。Veloso A C A等人[6]采用尿素-PAGE法根據牛乳αs-酪蛋白組成不同于羊乳，可將混入羊乳中5%的牛乳檢出。

2.2 等電點聚焦（IEF）

等電點聚焦是根據蛋白等電點主要對不同基因變異體的酪蛋白進行分離。該方法對山羊原料乳和乳制品中摻牛乳的檢出均有很高的靈敏度。依據的主要標記成分是γ-caseins的水解產物，γ2-caseins和γ3-caseins，這2種蛋白的等電點范圍在pH值6.5~7.5。該方法的檢出靈敏度可達到0.5%[7]，缺點是不適用鑒別羊乳中摻入牛乳清濃縮蛋白。

2.3 毛細管電泳（CE）

毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細管電泳，是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。毛細管電泳實際上包含電泳、色譜及其交叉內容，使分析化學得以從微升水平進入納升水平，并使單細胞分析，乃至單分子分析成為可能。長期困擾生物大分子（如蛋白質）的分離分析也因此有了新的轉機。

毛細管電泳在乳制品檢測分析中，可對乳清蛋白和酪蛋白進行有效分離和精準的定量。Cartoni G等人[8]開展采用毛細管電泳法鑒別了羊乳制品中摻入的牛乳源性成分。以pH值9.2的硼酸鈉為背景電解質，利用甲基硅烷毛細管，目標蛋白峰具有很好的分辨率。混合液體乳樣品中牛乳的最低檢出限2%，混合奶酪樣品中檢出體積分數為4%。個體遺傳差異和熱處理會影響檢測結果。

De Jong N等人[9]已成功將羊乳中摻入的牛乳（＞1%）檢出。Molina E等人[10]分析混合乳中酪蛋白的毛細管電泳圖，利用偏最小二乘回歸法和主成分回歸分析法，對獲得的目標蛋白峰進行了判定，采用二次多項式模式分析時，不同品種乳制品含量百分比的均方根預測誤差低于2.4%。毛細管電泳的出現將αs1-酪蛋白作為標記組分，可以使混入牛奶的檢出限從8%降到1%[11]。此外，β-酪蛋白、κ-酪蛋白也可作為指紋成分[12]。

電泳法鑒別羊乳和牛乳的標記組分見表2。

表2 電泳法鑒別羊乳和牛乳的標記組分

3 PCR技術

根據對不同動物組織中存在的特異性DNA序列設計引物，進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，根據不同動物組織中特異性序列的差異進而達到鑒別乳品種的目的。Lopez-Calleja I等人[13]利用針對線粒體12S rRNA的基因引物，建立了對綿羊和山羊奶中摻入牛奶的聚合酶鏈反應（PCR）鑒定方法。利用與保守DNA序列互補的正向引物，以及針對奶牛的反向引物，從牛奶的DNA中獲得了一個223 bp的特定片段，而在綿羊和山羊奶DNA中沒有獲得擴增信號。該技術應用于原料乳、巴氏殺菌乳和常溫牛羊混合奶，使對牛奶的特異性檢測具有良好的靈敏度閾值（0.1%）。該技術建立的PCR檢測方法是一種快速、直接的方法，適用于牛奶和其他乳制品的常規鑒定分析。Bania J等人[14]和Maudet C等人[15]已成功采用PCR技術，將混入羊乳及羊乳奶酪中的牛乳檢出，且檢出限可達到0.1%。

基于DNA的穩定性，經過高溫處理的乳樣也可以達到此檢出限。目前，已發展出一種連接酶鏈式反應（LCR）和酶免疫測定（EIA）相結合的PCR技術。以不同于綿羊和山羊乳的牛乳中β-酪蛋白中8411位基因為基礎，提取DNA，PCR擴增β-酪蛋白，以擴增得到的片段為模板，進一步和不同品種乳特異性引物進行LCR反應，檢測出牛乳[16]。以DNA為基礎的檢測方法的優點就是靈敏性高、檢測速度快。由于DNA是來自于體細胞，而體細胞的計數會受許多因素的影響，導致該方法難以準確定量牛乳的含量。

4 ELISA酶聯免疫法

近年來，隨著免疫學技術的成熟和發展，利用ELISA方法在羊乳中定量檢測摻入的牛乳成分受到越來越多的關注。該方法的原理主要是利用特定單抗和多抗與乳清蛋白（牛β-Lg，羊乳清）、酪蛋白（牛β-casein，κ-casein，αs1-casein）及酪蛋白水解肽發生特異性反應，達到檢測目的，其檢測靈敏度可低于0.5%。和其他技術相比，ELISA方法操作簡單、靈敏高、檢測成本低，缺點就是該方法耗時長、要求較高的抗血清濃度[17]。

Hurley I P等人[18]開發了一種間接競爭性ELISA方法，用于快速鑒別山羊、綿羊和水牛奶中的摻入牛奶。該試驗使用了一種針對牛IgG產生的單克隆抗體，該抗體可識別牛IgG和IgG重鏈上的一個物種特異性表位。使用過氧化物酶偶聯的抗小鼠IgG抗體檢測結合的單克隆抗體，隨后底物在酶的作用下，通過測定不同摻假乳樣混合物時，吸光度有明顯差異。ELISA方法具有高度特異性的。該檢測方法的檢測限為1.0 g/mL牛IgG，或0.1%的牛乳檢測限。該方法具有較高的重復性，適用于高通量篩選。此外，夾心-ELISA法[19-20]在檢測牛乳成分方面得到廣泛應用。

薛海燕等人[21]在羊乳中摻入牛乳的間接ELISA定量檢測時選擇抗β-酪蛋白多克隆血清，間接ELISA法用于原乳檢測時，摻入牛乳的百分含量與A450 nm在4%~50%呈線性關系，該方法的最低檢出量為4%。所建立的ELISA方法變異系數＜5%，回收率在94%~105%，符合方法學要求，可用于牛乳摻假的定量檢測。對滅菌乳的檢測表明，熱處理不改變β-酪蛋白與抗體反應的特性，方法還可用于經熱加工的乳品檢測中。

以ELISA原理開發的快檢試劑盒具有準確度高、專一性強、靈敏度高等優點，操作方便，不需要特殊的儀器設備，可同時對幾十個甚至上百個樣品進行檢測，避免了常規檢測方法存在的耗時長、操作繁瑣等缺點。因此，該方法適合乳品質量安全現場快速檢測，是乳品摻假檢測技術的重要手段。

ELISA技術鑒別羊乳中的摻入牛源性成分見表3。

表3 ELISA技術鑒別羊乳中的摻入牛源性成分

5 色譜技術

5.1 液相色譜HPLC

HPLC分析技術是鑒別羊乳中摻入牛乳的另一項技術。此項技術的優勢在于其高速、簡單，可實現自動化。目前，反向色譜（RP-HPLC）、離子交換色譜、疏水性液相色譜均可用于分析乳蛋白。RPHPLC主要用于分析乳中的乳清蛋白（α-La，β-Lg和BSA），根據羊乳和牛乳中各種乳清蛋白的保留時間不同進行區分[22]。Veloso A C A等人[6]也采用RPHPLC技術成功以α-casein為標記成分，檢測出羊乳中摻入5%的牛乳。疏水交互作用色譜（HIC）與強變性劑結合，分析酪蛋白的峰面積比值，如αs1酪蛋白/κ酪蛋白，αs2酪蛋白/β酪蛋白，β酪蛋白/κ酪蛋白，αs2酪蛋白/αs1酪蛋白，作為檢測羊乳中摻入牛乳的指標[23]。

液質聯用的新技術，目前在檢出牛乳方面得到發展和應用。根據蛋白結構建立的牛乳指紋圖譜，可以快速、簡單地對蛋白樣品進行檢測。Cozzolino R等人[24]使用基質輔助激光解析/電離質譜（MALDI MS）以牛β-乳球蛋白A和B為標記成分成功準確檢出羊奶中混入的牛奶。

5.2 氣相色譜

低分子量脂肪酸在羊乳和牛乳的脂肪中含量均比較高。但羊乳中C6∶0，C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0直鏈脂肪酸含量均高于牛乳，其中C10∶0直鏈脂肪酸含量的差別最為顯著。以此為基礎，可以檢測羊乳產品中摻入的牛乳。

葛武鵬等人[25]分析牛、羊乳及其酸乳、奶酪脂肪酸組成及變化特點，羊乳及其制品的脂肪酸質量優于牛乳及其制品，牛、羊乳加工后長鏈飽和脂肪酸含量降低，短鏈飽和脂肪酸含量增加。Benassi建立了基于C12/C10比值的檢測技術，當羊乳中摻入牛乳的含量在15%~20%時都可以檢測出來。相關研究表明，基于C4/C6+C8和C12/C10的比例可以定量檢測羊乳及其制品中摻入的牛乳成分。

6 光譜技術

近紅外光譜技術是近年來發展起來的一項高速、高效分析技術。褚瑩等人[26]利用近紅外光譜技術結合多種化學計量方法，快速鑒別摻假羊乳。分別對用偏最小二乘差別分析（PLS-DA），fisher線性辨別和多層感知器（MLP）神經網絡法建立校正的模型進行檢驗驗證。其中，MLP神經網絡法鑒別效果最佳，正確率可達100%。近紅外光譜技術結合適當的化學計量學法，實現羊奶摻假檢測的快速無損鑒別。

7 感官法

目前，采用電子舌對羊乳的真假進行鑒別也成為一種新型技術。電子舌有36個交叉靈敏的傳感器，可成功辨別5種基本的味道。Dias L A等人[27]將電子舌設備與線性判別分析相結合，測定記錄不同數據信號，建立模型，進而對脫脂乳中是否摻有牛乳進行辨別，其中辨別靈敏度和特異性分別可達到97%和93%。

8 結語

羊乳制品作為新興的乳制品，正逐漸被廣大消費者接受，未來具有廣闊的市場前景。因此，針對羊乳制品中摻入牛乳這一檢測需求，選擇特異性強、靈敏度高、檢測速度快的鑒別方法，對確保我國羊乳營養品質、質量安全水平、產業健康發展具有重要意義。通過對以上各種方法進行比較，在將來快速、簡單、無損、實時性、低成本的方法還有待繼續探索與推廣。