基于專利網(wǎng)的中藥防治糖尿病核心藥組挖掘及其分子作用機制研究*

潘建輝 ，孫星怡 ，劉暢 ，董雨蓉 ，王朔 ，，趙佳

（1.天津市胸科醫(yī)院，天津 300222；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；3.天津醫(yī)科大學，天津 300203）

糖尿?。―M）是一種由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗，導致血糖水平升高的慢性代謝性疾病。在過去的30年里，全球糖尿病患病率翻了兩倍，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟估算，預計到2023年，全球?qū)⒂?.43億糖尿病患者，而到2045年，糖尿病患病人群將增至7.83億[1-2]。糖尿病的高患病率及其并發(fā)癥帶來的致殘率給社會帶來巨大經(jīng)濟負擔，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，2019年約有150萬例死亡直接歸因于DM[3]。糖尿病分為1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病占總比的90%，通過口服二甲雙胍聯(lián)合吡格列酮、磺脲類藥物、氯茴苯酸和α-葡萄糖苷酶抑制劑等其他降糖藥物進行治療，但目前的DM療法不易實現(xiàn)長期血糖控制，且對于胃腸道、心血管時間的不良反應和局限性尚不明確[4-5]。中醫(yī)藥在防治糖尿病方面歷史悠久，根據(jù)患者多飲、多食、多尿及消瘦的癥狀，歸屬于“消渴病”范疇，以“益氣、養(yǎng)陰、清熱”為主要治法，并以葛根芩連湯、大柴胡湯、白虎加人參湯等經(jīng)典名方進行辨證論治[6]。中藥復方聯(lián)合西藥在防治糖尿病過程中具有良好作用，可通過抑制炎癥反應、降脂、調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂等作用改善胰島素抵抗，發(fā)揮降糖的臨床療效，因此防治糖尿病的研究逐漸成為中醫(yī)藥領域研究熱點之一[7-8]?；谔悄虿“l(fā)病機制復雜性和中藥多靶點多途徑的藥理作用特點，對于中醫(yī)藥防治糖尿病的基礎研究及臨床轉(zhuǎn)化尚需進一步挖掘和探究[9-10]。

專利信息服務平臺簡稱專利網(wǎng)，收載不同領域科學技術發(fā)展的最新專利信息，反映各領域發(fā)明創(chuàng)造的最新動態(tài)，根據(jù)專利網(wǎng)對中藥組方規(guī)律、中藥新藥研發(fā)等中醫(yī)藥領域相關數(shù)據(jù)進行分析，能更精確掌握中醫(yī)藥臨床和科研發(fā)展方向，揭示中醫(yī)藥行業(yè)布局和研發(fā)態(tài)勢，為中醫(yī)藥防治不同疾病提供新的研究思路。本研究應用數(shù)據(jù)挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學的方法對專利網(wǎng)治療糖尿病的中藥處方的用藥規(guī)律進行統(tǒng)計分析，并從“疾病-藥物-化學成分-關鍵靶點-功能分析”角度闡明核心中藥防治糖尿病的作用機制，為中藥復方防治糖尿病的臨床應用提供理論依據(jù)，并為后期開展核心相關中藥復方防治糖尿病作用機制的臨床研究提供前期基礎，同時為揭示中醫(yī)藥防治糖尿病科學內(nèi)涵的相關研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 登錄中國專利信息中心專利之星檢索系統(tǒng)（https：//www.patentstar.com.cn/），以糖尿病為檢索詞，收集所有中藥治療糖尿病的信息。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 納入及排除標準 納入所有以中藥或中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及糖尿病相關并發(fā)癥（糖尿病性腎病、糖尿病足、糖尿病心血管并發(fā)癥、糖尿病性腦血管病、糖尿病神經(jīng)病變等），且處方藥物詳細的專利。剔除有關保健品、營養(yǎng)粥、代餐、功能飲料，并未明確方藥有效的專利。

1.2.2 數(shù)據(jù)錄入及管理 將通過納入標準篩選所得的方藥錄入Microsoft Excel表中，以《中藥學》《中華本草》《中國藥典》2015年版為參考，剔除未出現(xiàn)在上述參考書中的中藥，并對中藥名稱進行規(guī)范，統(tǒng)計已錄入中藥及其四氣五味、歸經(jīng)及功效分類的頻次。

1.2.3 數(shù)據(jù)的相關性分析 使用SPSS Modeler 18.0，設置最大前項數(shù)為2，置信度60%，支持度10%，根據(jù)Apriori算法進行關聯(lián)規(guī)則分析。使用SPSS statistics 22.0對使用頻數(shù)排名前25的中藥進行系統(tǒng)聚類分析，統(tǒng)計高頻藥物的常用配伍。

1.3 生物信息學方法對預測方劑的深度分析 將預測得到的高頻藥組，通過TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）平臺篩選每味中藥的有效成分，并以糖尿?。╠iabetes mellitus）為關鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、TherapeuticTargetDatabase（TTD）數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//omim.org）數(shù)據(jù)庫檢索相關靶點，在Cytoscape 3.7.1中構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖，通過STRING（https：//string-db.org）聯(lián)合Cytoscape 3.7.1平臺繪制蛋白互作網(wǎng)絡圖（PPI），并利用進行優(yōu)化及繪制，采用R4.0.2軟件將GO功能和KEGG通路可視化，最后通過分子對接，以預測專利網(wǎng)中防治糖尿病高頻方藥的潛在作用機制。

2 結(jié)果

2.1 中藥頻次統(tǒng)計 對納入的2 056個中藥處方進行統(tǒng)計，共23 625味中藥，其中單個藥物使用頻次大于200的有25味，占比47.2%，使用頻次由高到低依次為：黃芪（1002）、地黃（799）、山藥（739）、葛根（724）、麥冬（592）等，見表 1。

表1 治療糖尿病的中藥使用頻次（＞200次）Tab.1 Usage frequency of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetesmellitus(＞200 times)

2.2 中藥四氣五味統(tǒng)計 對錄入的2 056個中藥處方進行統(tǒng)計，共23 625味中藥、四氣頻次為23 625次，五味頻次為38 291次，四氣頻次及比例具體見表2，圖1A。五味頻次及比例具體見表3，圖1B。

圖1 治療糖尿病的中藥四氣五味統(tǒng)計圖Fig.1 Statistical diagram of four qiand five flavour of traditional Chinese medicine for diabetes mellitus

表2 中藥四氣統(tǒng)計表Tab.2 Statistical table of TCM four qi

表3 中藥五味統(tǒng)計表Tab.3 Statistical table of five flavors of TCM

2.3 中藥歸經(jīng)統(tǒng)計 根據(jù)《中華本草》，對納入的23 625味中藥進行歸經(jīng)統(tǒng)計，實際統(tǒng)計23 207味中藥，歸經(jīng)頻次為62 719次，其中肺經(jīng)11 871次，18.93%；肝經(jīng)10 303次，16.43%；腎經(jīng)9 931次，15.83%；脾經(jīng)9 320次，14.86%；胃經(jīng)8 204次，13.08%，見圖 2。

圖2 治療糖尿病的中藥歸經(jīng)統(tǒng)計圖Fig.2 Statistical chart of menstruation of Chinese herbs in the treatment of diabetes mellitus

2.4 中藥功效分類統(tǒng)計 根據(jù)第十版中藥教材，對23 696味中藥進行分類統(tǒng)計，實際統(tǒng)計20 498味中藥，其中補虛藥7 700次（補氣藥3 567次，補陰藥2 549次，補陽藥851次，補血藥733次），37.56%；清熱藥3 898次，19.02%；解表藥1 440次，7.03%；收澀藥1 349次，6.58%；活血化瘀藥1 341次，6.54%；利水滲濕藥1 326次，6.47%；其余見圖3、圖4。

圖3 治療糖尿病的中藥分類統(tǒng)計圖Fig.3 Statistical figure of TCM classification for diabetes mellitus

圖4 治療糖尿病的補虛藥統(tǒng)計圖Fig.4 Statistical chart of tonic herbs for diabetes mellitus

2.5 中藥功效統(tǒng)計 統(tǒng)計納入的23 696味中藥所有功效，共統(tǒng)計功效頻次74 665次，排名前5的功效頻次及比例依次如下：生津止渴1 699次，2.28%；清熱解毒1 486次，1.99%；清熱瀉火1466次，1.96%；生津養(yǎng)血1362次，1.82%；利水消腫1357次，1.82%等，其余出現(xiàn)600次以上的功效見表4。

2.6 中藥關聯(lián)規(guī)則 對納入的12 123味中藥使用SPSS modeler 18.0進行關聯(lián)規(guī)則分析，設置最大前項數(shù)為2，置信度60%，支持度10%，高頻使用藥對：黃芪-地黃 799，黃芪-山藥 739，黃芪-葛根 724，地黃-麥冬592，黃芪-麥冬572；常用的中藥配伍共納入5條兩項：黃芪-地黃；黃芪-山藥；黃芪-葛根；地黃-麥冬；黃芪-麥冬；3條3項關聯(lián)組：地黃-山藥、黃芪；黃芪-山藥、地黃；黃芪-麥冬、地黃。見表5。

表5 治療糖尿病藥物關聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果Tab.5 Analysis results of association rules of drugs for treatment of diabetes mellitus

2.7 高頻中藥聚類分析 對使用頻次排名前25的中藥進行聚類分析，得到8個藥物聚合組，第1組：黃芪、葛根、丹參；第2組：地黃、麥冬、天花粉；第3組：茯苓、澤瀉、山藥、山茱萸；第4組：人參、黃精、玉竹、地骨皮；第5組：白術、當歸、甘草、桑葉；第6組：枸杞子、玄參、蒼術；第7組：知母、五味子；第8組：石斛、黃連。統(tǒng)計結(jié)果見表6、圖5。

圖5 治療糖尿病高頻藥物聚類圖Fig.5 Cluster of high-frequency drugs in the treatment of diabetes mellitus

表6 治療糖尿病高頻藥物聚類統(tǒng)計表Tab.6 Cluster statistics of high-frequency drugs in the treatment of diabetes mellitus

2.8 成分靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建 依據(jù)藥代動力學參數(shù)，設置DL≥0.18，OB≥30，共檢索得到黃芪、葛根、丹參有效成分89個，其對應靶點1 346個，糖尿病疾病靶點420個，藥物靶點與糖尿病疾病靶點取交集共得到共有靶點57個，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖”，見圖6。

圖6 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖Fig.6 Drug-ingredient-target-disease network diagram

2.9 PPI網(wǎng)絡分析和核心靶點篩選 為進一步探討靶點在蛋白水平的作用關系，將STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果導入 Cytoscape 3.7.1軟件并通過 Network Analyzer插件進行拓撲分析，以>2倍DC中位數(shù)27為篩選條件，篩選中心靶點28個，再次以≥BC中位數(shù)14.87為條件，得到該方劑治療糖尿病的最相關靶點 14 個，分別是 TNF，AKT1，IL1B，IL6，STAT3，PPARG，MMP9，TP53，CXCL8，CCL2，PTGS2，NOS3，PPARA，ESR1，見圖 7。

圖7 PPI網(wǎng)絡圖Fig.7 PPI network diagram

2.10 GO和KEGG通路富集結(jié)果與分析 利用R語言對該方劑治療糖尿病的57個潛在靶點進行GO功能注釋，并按P值進行排序（閾值為P＜0.05），將排名前20的潛在生物過程（BP）進行展示，同時，將潛在靶點進行KEGG功能分析，并將排名前20通路進行展示，見圖8。

圖8 GO和KEGG通路富集結(jié)果Fig.8ResultsofGO和KEGGpathway

2.11 分子對接結(jié)果分析 選取關鍵靶點AKT1、IL-6、TNF與相應關鍵活性成分作分子對接，構(gòu)建分子對接互作模式圖，結(jié)果顯示相關靶點與活性成分可自發(fā)結(jié)合，形成穩(wěn)定構(gòu)象，具有良好結(jié)合活性，見圖9。

圖9 分子對接結(jié)果Fig.9 Molecular docking results

3 討論

中醫(yī)將糖尿病歸為“消渴病”范疇，其病機主要為陰津虧損，燥熱偏盛，病理性質(zhì)以陰虛為本、燥熱為標，根據(jù)三消辨證法，將其分為“上消”“中消”“下消”，分以白虎加人參湯、葛根芩連湯、金匱腎氣丸進行論治[11-12]。

本次數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示黃芪、地黃、山藥、葛根、麥冬等使用頻率較高，四氣五味分別以平性、寒性藥物占比最大（46.52%），甘味、苦味占比最大（64.09%），分析可知臨床治療糖尿病仍以能和能緩，能燥能堅的清熱益氣、瀉火存陰功效藥物為主[13]。另外關聯(lián)規(guī)則顯示黃芪-地黃，黃芪-山藥，黃芪-葛根，地黃-麥冬，黃芪-麥冬，置信度較高，是治療糖尿病較為常見的藥物組合，其功效亦主要以清熱生津，益氣養(yǎng)陰為主。

根據(jù)聚類分析所得的新的高頻中藥方劑組方由黃芪、葛根、丹參組成，其中黃芪補中益氣固表，葛根清熱生津止渴，丹參活血祛瘀通絡，三者相合共奏益氣養(yǎng)陰，養(yǎng)血通絡之功。通過成分靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)該方劑的藥物靶點與糖尿病疾病靶點共57個，且該可能通過Przewalskin B、isoflavanone、（2R）-3-（3，4-二羥基苯基）-2-[（Z）-3-（3，4-二羥基苯基）丙烯?；鵠氧基丙酸、（Z）-3-[2-[（E）-2-（3，4-二羥基苯基）乙烯基]-3，4-二羥基-苯基]丙烯酸 、（6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-quinone、丹參醌新酮Ⅱ等有效成分發(fā)揮治療作用。PPI網(wǎng)絡分析和核心靶點篩選結(jié)果顯示，TNF，AKT1，IL1B等可能為該方劑治療糖尿病的關鍵因子，GO功能顯示，該方劑對糖尿病的防治主要涉及基因表達的正向調(diào)控，一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控，炎癥反應，平滑肌細胞增殖的正調(diào)節(jié)，血管生成的正向調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等方面，KEGG富集通路顯示，流體剪切應力和動脈粥樣硬化，AGERAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用，脂質(zhì)和動脈粥樣硬化，癌癥的途徑，TNF信號通路等可能為重要通路，其中TNF信號通路在核心靶點、功能富集及通路富集中均有顯示，可能為該方劑防治糖尿病的關鍵通路。

本研究應用數(shù)據(jù)挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學的方法對專利網(wǎng)治療糖尿病的中藥處方的用藥規(guī)律作統(tǒng)計分析，并通過分子對接實現(xiàn)虛擬驗證，初步揭示該藥組防治糖尿病的作用機制，后期將通過該組方配制的中藥代茶飲進行臨床研究，完成該藥組對防治糖尿病的療效評價，并結(jié)合藥物分析、分子生物學驗證等實驗研究方法探究該藥組的藥效物質(zhì)基礎，為中藥復方防治糖尿病的臨床應用提供依據(jù)，也為揭示中醫(yī)藥防治糖尿病科學內(nèi)涵的相關研究提供思路。