嵌合抗原受體巨噬細胞的研究進展

呂翠翠，沈 俊，鄧 琦

(1. 天津市第一中心醫院 血液科, 天津 300192；2.中國醫學科學院血液病醫院血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室, 天津 300020)

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)介導的細胞免疫療法是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法，該方法能夠實現對腫瘤細胞的快速識別和高效精準殺傷。近些年，基于CAR的免疫細胞療法(如CAR-T和CAR-NK)正處于快速發展中，其中嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)療法目前已在血液腫瘤中取得了巨大的成效，尤其是在急性B淋巴細胞白血病的治療中[1-5]。在實體瘤治療中CAR-T和嵌合抗原受體修飾的自然殺傷細胞(chimeric antigen receptor-engineered NK cells，CAR-NK)的療效有限(表1)，其主要瓶頸包括T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cells, NK)的滲透性不足以及免疫抑制性微環境等[6-8]。與T細胞或NK浸潤不良相反，巨噬細胞在實體瘤的腫瘤微環境中可被廣泛募集[9-11]。此外，與免疫抑制微環境會促使腫瘤浸潤的T淋巴細胞發生衰竭不同，腫瘤浸潤的巨噬細胞不會發生衰竭，具有更高程度的表型可塑性[9-11]。有研究發現，結合了CAR的巨噬細胞(CAR-M)在實體瘤內更易傾向發展成M1型活化的巨噬細胞，能在實體瘤內持續發揮抗腫瘤效應[12-14]。另外，作為抗原呈遞細胞，巨噬細胞還能提呈抗原給T細胞，從而激活T細胞，進一步發揮抗腫瘤作用。與T細胞相比，巨噬細胞無組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)的限制性和發生移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的風險，在體內循環時間有限，非腫瘤靶向毒性也較小(表1)。因此，巨噬細胞有潛力被開發為靶向腫瘤的CAR-M療法，基于CAR-M的免疫細胞療法是攻克實體瘤的重要途徑。本文通過對當前CAR-M的相關研究(包括CAR-M的細胞來源，CAR-M載體的結構構建和傳遞及CAR-M的臨床研究)進行綜述，旨在為CAR-M的臨床轉化應用提供參考和奠定理論基礎。

表1 不同CAR免疫細胞比較

1 CAR-M的細胞來源

1.1人腫瘤細胞系 人腫瘤細胞系(THP-1)是從一名1歲兒童患者中分離出來的一種急性單核細胞白血病細胞系。該細胞系具有與人原代單核細胞類似的形態學和功能學特性。例如，THP-1可被佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)等誘導分化為巨噬細胞；在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的刺激下能進一步被誘導為M1型巨噬細胞；而在白細胞介素(interleukin，IL)-4等刺激下又可向M2型巨噬細胞轉變。與人原代單核/巨噬細胞不同的是，THP-1具有穩定一致的遺傳背景，易于體外擴增、存儲和基因編輯。因此在實驗室條件下，THP-1常被用來探究單核/巨噬細胞生理行為的調節，如免疫反應、細胞間相互作用和信號轉導途徑[15]。盡管THP-1與原代單核/巨噬細胞具有高度的相似性，但在生理功能上并不完全一致，因此無法完全替代原代單核/巨噬細胞。例如，在原代巨噬細胞中通?？梢杂^察到LPS的誘導耐受，但THP-1來源的巨噬細胞能通過上調核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等特定基因信號的表達，從而維持對LPS的敏感性[15]。此外，在M1極化過程中，相對于外周血的原代單核細胞，THP-1中的IL-6和IL-10的表達會缺失，IL-8的分泌會減少[15]。隨著CAR技術的進步，THP-1可被用作CAR-M載體結構設計和篩選的工具用來研究和提高CAR-M抗原依賴性的吞噬能力。有研究發現，以CD3ζ為基礎的CAR可增強THP-1源性巨噬細胞的抗腫瘤吞噬功能[13]。然而，考慮到成瘤風險，將來THP-1介導的CAR-M應用于臨床面臨著較大的挑戰。

1.2人外周血單核細胞 人外周血單個核細胞包含多種類型的免疫細胞，如單核細胞。在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)等細胞因子的刺激下，單核細胞可進一步向巨噬細胞分化[13]。與THP-1相比，外周血來源的單核/巨噬細胞能更好地保留其原始形態[15]。此外，外周血來源的單核/巨噬細胞具有更強大的促炎癥特性：在LPS和IFN-γ刺激下，原代單核/巨噬細胞能產生更多的促炎因子，如IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，并表達更高水平的表面標志物，包括利鈉肽受體、CD14和CD68[15]。借助腺病毒轉染體系，有研究者利用外周血來源的單核/巨噬細胞構建了靶向實體瘤抗原的CAR-M，并在體內外實驗中驗證了原代CAR-M良好的抗腫瘤效應[13]。然而，考慮到原代巨噬細胞的來源有限，轉染困難及無法有效擴增和凍存(表1)，將來人外周血單核細胞介導的CAR-M在臨床上的大規模應用面臨著巨大的挑戰。

1.3人多能干細胞 人多能干細胞 (human pluripotent stem cells, hPSC)包括胚胎干細胞和誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有自我更新和多向分化潛能，理論上可以源源不斷地分化成巨噬細胞[16-19]。目前，借助于共培養或基質膠介導的2D分化方案或擬胚體介導的3D分化體系，研究人員已能夠將hPSC在體外誘導分化出巨噬細胞[20]。hPSC來源的巨噬細胞首先解決了原代巨噬細胞來源不足的問題，而且利用單克隆來源的hPSC還可以生成同質性的標準化的巨噬細胞產品(表1)。此外，hPSC易于被基因編輯，經基因編輯和純化后的hPSC在分化過程中能百分百攜帶編輯位點，因此，結合CAR等技術能夠做到高靶向性(表1)。此外，hPSC來源的巨噬細胞可以在分化早期進行凍存和復蘇，易于做成現貨型產品(表1)?；谏鲜鰞烖c，hPSC正在成為巨噬細胞分化和治療的研究熱點。實際應用中，我們可以將特定的CAR轉導到hPSC中，然后經過分選和單克隆擴增建立CAR-hPSC, 最后利用分化技術將CAR-hPSC分化成巨噬細胞，從而源源不斷地得到均一的CAR-M(圖1)。在一項以iPSC為種子細胞的CAR-M研究中，研究者首先使用編碼重編程因子的非整合載體誘導iPSC克??；然后將含有4-1BB和CD3ζ胞內結構域的CAR轉導到iPSC中再進一步誘導為巨噬細胞，這些誘導來的CAR-M具有M2表型; 當遇到靶細胞時，這些CAR-M能吞噬靶細胞，并向M1型轉化；體內研究進一步表明，iPSC來源的CAR-M可以發揮腫瘤靶向作用[12]。

圖1 利用hPSC構建CAR-M的過程 注：hPSC:人多能干細胞；CAR-hPSC: 嵌合抗原受體人多能干細胞； CAR-M:嵌合抗原受體巨噬細胞

2 CAR-M載體的構建和傳遞

在CAR結構設計上，CAR-M整體上遵循CAR-T的構建原則，包括細胞外抗原識別域、鉸鏈區和一個或多個胞內信號轉導域。CAR-M與CAR-T結構設計的主要不同在于胞內結構域。

2.1吞噬信號激活載體的設計 CAR-M載體結構設計的重點和難點在于細胞內信號轉導結構域。CD3ζ信號轉導結構域包含免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，在CAR-T中介導T細胞的信號轉導[13]。與CAR-T類似，CAR-M可以直接使用CD3ζ信號轉導結構域激活吞噬信號，但激活的分子機制與CAR-T不同。在CAR-T中，ITAM在CAR結合時被Src家族激酶磷酸化，接著與激酶ZAP70中的串聯SH2結構域結合，進而激活CAR-T以發揮殺傷作用[21]。巨噬細胞不表達ZAP70，而是表達另一種含有串聯SH2結構域的激酶Syk，可以結合CD3ζ并在巨噬細胞中傳遞吞噬信號[21]。除CD3ζ外，其他含有ITAM的細胞內結構域，如Fc受體共同γ鏈(Fc receptor common gamma chain, FcRγ)和多個表皮生長因子樣結構域蛋白10(multiple epidermal growth factor-like domains protein 10, Megf10)，也被發現與CD3ζ具有相當的吞噬作用，而含有黏附G蛋白偶聯受體B1(adhesion G protein-coupled receptor B1, Bai1)和酪氨酸蛋白激酶 Mer (tyrosine-protein kinase Mer, MerTK) 胞內結構域的CAR-M則不能進行有效的吞噬[22]。研究發現，FcRγ主要介導巨噬細胞中抗體依賴性細胞吞噬信號的轉導，而Megf10在巨噬細胞吞噬凋亡細胞中起關鍵作用[22]。在另一項靶向C-C趨化因子受體7型(C-C chemokine receptor type 7, CCR7)的CAR-M研究中，研究者則發現相比Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)2、TLR4和TLR6等信號轉導結構域，含有MerTK的CAR-M在體外具有較強的吞噬能力和細胞殺傷活性[23]。

大多數CAR-M僅能內化靶細胞片段，而不能整個吞噬腫瘤細胞，如何提高CAR-M對靶細胞的整體吞噬能力是該領域的難點。在CAR-T相關研究中發現含有CD3結構域而不含共刺激結構域的第一代CAR-T在體內的活性和功能有限[24-27]。因此，現階段批準上市的CAR-T產品都含有共刺激胞內結構域，CD28和(或)41BB。與第二代和第三代CAR-T類似，額外的信號傳導域或許能進一步增強巨噬細胞的吞噬作用。此前有報道稱，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)信號對大顆粒的吞噬作用很重要，這表明額外的PI3K信號或許能增強CAR-M的吞噬作用[28]。研究者通過將CD19-PI3K募集結構域串聯融合到基于FcRγ的CAR結構中，結果使靶細胞的整體吞噬作用顯著增強[28]。

2.2非吞噬信號激活載體的設計 除了設計上述具有激活吞噬作用的細胞內結構域，有研究者設計了一種含有CD147激活域(CAR-147)的CAR用來降解腫瘤微環境中的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)[14]。CD147是一種調節基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)表達和ECM重塑的蛋白質。ECM所造成的物理屏障是引起免疫細胞向腫瘤浸潤不足的重要原因。CAR-147不轉導吞噬信號，CAR-147巨噬細胞與靶細胞的結合顯著上調某些MMP的表達，但不影響巨噬細胞的其他功能，如吞噬作用、促進活性氧產生和炎性細胞因子分泌等[14]。研究發現，CAR-147巨噬細胞上調少量MMP的表達可顯著降低腫瘤中的膠原含量，誘導CD3+T細胞浸潤并抑制腫瘤生長[14]。

2.3CAR-M載體傳遞方式 單核/巨噬細胞對基因操縱具有天然抵抗力，因此將CAR和其他基因轉導進單核/巨噬細胞具有一定的挑戰性[29]。目前針對巨噬細胞的主要傳遞策略有病毒和非病毒兩種，在具體操作上又分為體外傳遞和體內傳遞。

Bobadilla等[30]創造了新的HIV-1衍生慢病毒顆粒，能夠通過利用病毒輔助蛋白Vpx感染髓系細胞。Vpx平臺可以容納任何預先存在的基于艾滋病病毒(HIV)的慢病毒載體，因此提供了一種編輯髓系細胞的可行性策略。鑒于巨噬細胞的增殖能力有限，有研究者假設非整合、復制缺陷型腺病毒載體或許具有好的轉導效果，并依此設計了一種復制功能不全的嵌合腺病毒載體作為向巨噬細胞遞送CAR的方法[13]。該策略不僅顯示出轉導的高效性，而且在不同供體之間展現了可重復性[13]。此外一些非病毒策略也被開發用于工程化單核/巨噬細胞，包括質粒DNA，信使核糖核酸(mRNA)和轉座子系統[31-33]。

在CAR傳遞的具體操作上，目前基本上都是基于體外編輯后系統回輸這種傳統操作。為了避免復雜和昂貴的體外制備過程，一種基于納米載體的體內編輯遞送技術正在興起。有研究表明，在體內注射巨噬細胞靶向納米載體和編碼CAR-IFN-γ的質粒DNA所組成的納米復合物后能夠誘導體內巨噬細胞形成CAR-M1型巨噬細胞，并能發揮抗腫瘤作用[34]。在另一項研究中，研究者構建了一種可注射的基因納米載體-水凝膠超結構遞藥系統，可對術后瘤腔周圍巨噬細胞進行原位編輯，并成功應用于惡性腦膠質瘤動物模型的術后免疫治療[35]。

3 CAR-M臨床研究進展

在一項針對非肌肉浸潤性膀胱癌的多中心、隨機臨床試驗中，研究者已證實大劑量(109個/次)多次回輸巨噬細胞后無明顯毒副作用[36]。此外，到目前為止，已有一項CAR-M的I期臨床試驗被美國FDA批準 (Clinicaltrials.gov 號:NCT04660929)。該試驗來自CARISMA Therapeutics的候選藥物CT-0508。這是一種來源于外周血單核細胞經由腺病毒載體轉導的抗人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)的自體CAR-M療法，主要適應證是治療復發/難治性HER2過表達的腫瘤患者。該試驗于2021年開始，目前該款CAR-M產品在人體內的安全性和有效性仍有待進一步驗證。

4 小結與展望

基于CAR-M的細胞免疫療法在實體瘤的治療上盡管展現出了巨大的發展潛力，但仍有很多問題亟待解決。可靠的細胞來源和可持續擴增是CAR-M臨床應用的必要條件。相比腫瘤細胞及外周血單核細胞，hPSC是CAR-M將來能做到成藥的重要候選細胞。然而，當前hPSC向巨噬細胞的分化仍然面臨效率低下，功能不足等難題，基于多能干細胞的高效分化策略仍有待進一步開發和優化。其次，如何提高CAR-M的抗腫瘤效應是CAR-M臨床應用的另一難點。設計和篩選針對巨噬細胞的胞內信號轉導結構域是進一步提升CAR-M功效的重要手段。鑒于實體瘤靶點不明確，篩選合適的靶點對于提升CAR-M的療效也有積極意義。從安全性角度考慮，巨噬細胞雖無GVHD風險，但在CAR-M的制作上仍然面臨很多安全問題。hPSC具有成瘤風險，篩選高純度的巨噬細胞能大大降低多能干細胞的殘留。此外，CAR-M多采用病毒轉導的方法，可能會誘發插入突變；體內直接編輯也存在靶向性問題、遞送效率問題和毒性問題等。然而，隨著美國FDA批準的基于CAR-M的I期臨床試驗的開展，將來關于CAR-M的臨床研究會越來越多，相關的各種難題也會隨著技術的進步逐漸被攻克?？梢灶A期未來基于CAR-M的腫瘤免疫療法在實體瘤的治療中將發揮重要作用。