經皮冠狀動脈介入治療術后替格瑞洛及其代謝物濃度測定LC-MS方法的建立和應用

秦 軍，王 楠，相 芳，初曉玲，李 祥，陳 群，初曉倩

0 引 言

隨著社會生活條件的日益提高，急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)也逐漸呈年輕化的趨勢，其中高血壓、糖尿病、血脂異常以及炎癥等均是導致ACS發病的危險因素[1]。當動脈粥樣硬化不穩定斑塊破裂或侵蝕導致的冠狀動脈內急性血栓形成，成為多數ACS發病的基礎[2]，血小板激活在其中起著重要作用[3]。有效的抗血小板治療成為預防ACS血栓事件的重要手段。近年來，P2Y12受體抑制劑聯合小劑量阿司匹林(75～150 mg)被認為是ACS患者經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)時的標準治療方法[4]。氯吡格雷受基因多態性影響，常產生氯吡格雷抵抗，繼而引起心血管不良事件風險增加[5]。替格瑞洛作為一種可逆的、直接作用的P2Y12受體抑制劑，用于降低ACS患者的血栓事件(心肌梗死、中風)風險，具有比氯吡格雷更快、更強、更一致的特點，而不增加總體大出血率[6-7]。PLATO研究后，國內外指南推薦替格瑞洛作為急性冠狀動脈綜合征(ACS)患者首選的P2Y12血小板抑制劑。

臨床觀察發現，目前中國ACS患者PCI術后替格瑞洛的常規給藥劑量可能偏高，存在一定的用藥風險，但尚缺乏相應的循證醫學證據。有研究表明，替格瑞洛血藥濃度與出血事件成正相關[8]。ACS患者往往存在高齡、女性、腎功能不全、貧血、低BMI、合用口服抗凝劑等出血風險因素[9]，用藥風險進一步加大，臨床需要關注替格瑞洛的用藥安全性，目前國內有關ACS患者替格瑞洛血藥濃度及其與人群特征關系的研究較少。因此，本研究旨在建立ACS患者PCI術后定量測定替格瑞洛血漿濃度的LC-MS/MS方法并觀察其特征分布，為臨床建立可靠的監測方法，為替格瑞洛的安全、有效應用打下基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究為隨機單中心研究，研究對象為2020年9月至2022年1月東部戰區總醫院秦淮醫療區確診為ACS以及需要植入藥物洗脫支架的患者120例。所有受試者在參與前均提供書面知情同意書，并得到醫院倫理委員會批準(批準號：81YY-KYLL-19-13)，且研究是根據臨床實踐協調準則國際會議和赫爾辛基宣言進行的。入組標準：①確診為ACS以及使用替格瑞洛的患者；②規律使用替格瑞洛的患者。排除標準：①對阿司匹林、替格瑞洛等藥物不耐受的患者；②急性心衰或心源性休克、心律失常的患者；③活動性消化道潰瘍、嚴重感染、惡性腫瘤的患者；④血液系統疾病、出血性疾病或有出血傾向的患者；⑤在研究過程中服藥依從性差，包括酒精濫用、精神疾病、藥物依賴的患者；⑥孕婦或者哺乳期婦女；⑦因合并其他疾病，預期生存期不超過 1 年的患者.

1.2 方法學的建立和濃度測定

1.2.1 血樣的采集符合入組要求的患者，入院后口服治療劑量替格瑞洛藥(90 mg，1天2次)，達到穩態后(約3～5個半衰期，約30～50 h)，于下次服藥前1 h左右采集靜脈血，2 h內分離血漿并轉移至EP管內，-80 ℃保存，并由本單位完成濃度測定及數據采集。

1.2.2 替格瑞洛及其他心血管藥物LC-MS/MS方法學的建立①試劑(規格，廠家，批號)：空白血清(NA，東部戰區總醫院秦淮醫療區，NA)，甲醇(MS級，Fisher，201603)，乙腈(HPLC級，Fisher，196024)，甲酸(MS級，Fisher，193068)，純水(MS級，Honeywell，DY616)。②標準品名稱(純度，來源，批號)：替格瑞洛(97%，TRC，2-AGE-110-1)；替格瑞洛-d7(96%，TRC，4-AKT-180-5)；去羥乙氧基替格瑞洛(98%，TRC，27-MJC-49-1)；去羥乙氧基替格瑞洛-d7(99.75%，TRC，3-MSI-60-2)；藥品信息：替格瑞洛片90 mg/片(商品名：倍林達，廠家：阿斯利康制藥有限公司，批號：2005047、2007087、200834及2009063)。③儀器(型號，廠家)：液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(ACQUITY HPLC-MS-Class，Waters corporation)，高速冷凍離心機(Heraeus FRESC021，日立(日本))，純水儀(Unique-R10，銳思捷(廈門)純化技術公司)，渦旋混合儀(G560E，美國Scientific Industries)，移液器(2-20、10-100、20-200、100-1000 μL，Thermo)，電子天平(XSR205(十萬分之一)，METTLER TOLEDO)，超聲波清洗機(SB-3200DTD，寧波新芝生物科技公司)，醫用保存箱(2～8 ℃)(MPR-312DCN-PC，Panasonic Appliances Cold(大連))，低溫保存箱(-20 ℃)(DW-YL270，美菱生物醫藥(安徽))，超低溫保存箱(-70 ℃)(MDF-U54V，Panasonic Healthcare(上海))，量筒(100、500 mL，博美、金正)。④色譜條件：流動相A：0.1% 甲酸水溶液；流動相B：乙腈；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；色譜柱：Kinetex 2.6 μm XB C18，50mm×3 mm。⑤質譜條件：質譜離子源參數，Capillary(V)：3000(ESI+)4000(ESI-)；Nozzle Voltage(V)：200(ESI+)500(ESI-)；Gas Temp(℃)：300；Gas Flow(L/min)：7；Nebulizer(psi)：45；Sheath Gas Temp(℃)：300；Sheath Gas Flow(L/min)：11。⑥檢測對象：替格瑞洛(Ticagrelor，TIC)、去羥乙氧基替格瑞洛(Deshydroxyethoxy Ticagrelor，DHTIC)。⑦標準溶液的配制。標準溶液的配制：精密稱取各藥物標準品適量，精密稱取純度分別為97%及98%的替格瑞洛和活性代謝物，加入1.808和0.979 mL的溶劑，渦旋均勻得到濃度分別為2 mg/mL和1 mg/mL的化合物儲備液。分別準確移取母液濃度2000 μg/mL的替格瑞洛及濃度1000 μg/mL的其活性代謝物10 μL，各自加入80%乙腈溶液443 μL，充分混勻得到0.5 mL濃度分別為40 000及20 000 ng/mL混合標溶液(S0)。內標溶液的配制：精密稱取純度分別為96%的TIC-d7及99.75%的DHTIC-d7，加入0.959 mL和0.998 mL溶劑，渦旋均勻得到濃度分別為0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的藥物同位素內標儲備液。準確移取體積為5 μL的TIC-d7及DHTIC-d7的內標儲備液，分別加入80%乙腈溶液440 μL，充分混勻得到2種0.5 mL濃度均為1500 ng/mL的10倍內標SI溶液，使用時用乙腈稀釋10倍，可得到濃度均為150 ng/mL的2種內標工作液。

1.3 血漿樣品的處理用移液器準確移取待測標本50 μL于標記好的1.5 mL EP管中，加入20 μL 內標工作溶液(IS-1)，加入180 μL乙腈，渦旋均勻；振蕩5 min，14 800 r/min，4 ℃離心5 min，轉移EP管中的上清液80 μL待進樣，進樣量為3 μL。

1.4 相關參數考察分別對樣品的特異性、回收率、準曲線制備及定量下限測定、基質效應、批內、批間精密度試驗、準確度試驗、穩定性試驗進行考察，確保符合樣本定量檢測的要求。

2 結 果

2.1 方法學考察

2.1.1 特異性在實驗所采用的色譜條件下，DHTIC、DHTIC-d7、TIC、TIC-d7各目標藥物及同位素內標出峰時間分別為3.5、3.48、3.51、3.51 min。目標化合物和內標峰形良好，無雜峰干擾測定，基線平穩。本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中的替格瑞洛及其活性代謝物的濃度，靈敏度較高。

2.1.2 標準曲線及定量下限TIC歸方程為Y=0.022615X+0.008650(R2=0.99922869)；DHTIC直線回歸方程為Y=0.028250+0.028721(R2=0.99920823)；目標物在合適范圍內呈良好的線性關系。另外，各藥物在在血漿中的定量下限見表1。

表1 替格瑞洛及其活性代謝物的定量下限(n=6)

2.1.3 回收率試驗(絕對回收率)及基質效應不同濃度的2種藥物其回收率均在80%～110%之間，其相對標準偏差(RSD%)均小于10%，符合回收率的實驗標準。不同濃度的各種藥物(高、中、低)內標歸一化的基質因子平均值，結果發現活性代謝物在5、100、800 ng/mL及150 ng/mL內標中其ME平均值均在合理范圍內，替格瑞洛在10、200、1600 ng/mL及內標150 ng/mL中其ME平均值也均在合理范圍內。

2.1.4 精密度與準確度以高、中、低3個濃度對連續5批次各藥物樣品的批件和批內RSD進行考察，結果顯示各藥物樣品批內及批間RSD均在15%以內，該實驗結果符合生物樣品分析方法的要求。見表2。

表2 不同濃度對連續5批次各藥物樣品HPLC-MS/MS法的批內、批間精密度考察

2.1.5 穩定性考察不同濃度的2種藥物(高、中、低)樣品立刻進樣，室溫放置6 h，4 ℃冰箱放置24 h，以及-80 ℃條件下反復凍融下測定，RE值均在合理范圍之內，表明2種藥物在上述條件下均保持穩定。見表3。

表3 人體血漿中替格瑞洛及其活性代謝物穩定性

2.2 臨床特征

2.2.1 患者基本資料入組120例行經皮冠狀動脈介入治療術的急性冠脈綜合征患者根據性別將其分組，納入年齡、體重、心血管危險因素、臨床分型、合并用藥等臨床資料，統計分析發現2組患者在年齡(P=0.001)、吸煙(P=0.000)、飲酒(P=0.000)、PCI術后(P=0.000)及合并用地爾硫卓(P=0.004)方面差異有統計學意義。

2.2.2 替格瑞洛及活性代謝物穩態谷濃度在不同年齡段的分布特征和相關性通過上述LC-MS/MS方法學的建立，并根據WHO對年齡段的劃分，對入組患者藥物穩態谷濃度進行監測并分析了濃度與年齡之間的相關性，結果發現替格瑞洛及其活性代謝物3組之間濃度差異無統計學意義(P=0.078)，但替格瑞洛谷濃度在≤50歲與>60歲2組之間差異具有統計學意義(P=0.041)。同時也發現隨著年齡的增長，替格瑞洛血藥濃度與年齡呈正比。見表4。

表4 不同年齡段之間的替格瑞洛及其活性代謝物谷濃度的差異性

3 討 論

根據相關研究報道，替格瑞洛及ARC-124910XX的離子掃描模式正、負離子模式均有[10-11]。實驗前期，我們比對了目標物在正負離子模式下的響應，發現在正離子模式下存在干擾峰而最終選擇負離子掃描模式；另外本實驗參考了柯東升等[12]研究，發現采用0.1%甲酸-乙腈為流動相保留時間，峰形等均良好。本研究成功建立了測定臨床心血管抗血小板藥物替格瑞洛的LC-MS/MS法。經考察，該方法準確度高，穩定且簡便。

一項亞洲人群ACS患者的薈萃分析結果顯示[13]，相比于氯吡格雷的雙聯抗血小板方案，雖然替格瑞洛致命性出血的發生率沒有差異，卻顯著增加了其他出血事件(如非致命性大出血、輕微出血等)的風險。除增加出血風險外，隊列研究發現[14]，接受PCI并服用替格瑞洛長達1年的ACS患者中，呼吸困難風險也有顯著增加。

本研究對入組患者的基本資料分析發現，2組患者(以性別分組時)在年齡、吸煙、飲酒、PCI術后及合并用藥等方面可能存在差異性。另外，在對年齡進行分段研究發現替格瑞洛血藥濃度隨著年齡增加而增加，且在≤50歲與>60歲2組之間存在顯著性差異，表明年齡段與谷濃度可能存在相關性，且呈正相關，但仍需進一步的臨床研究。一項對40名健康人群的研究發現[15]，接受200 mg替格瑞洛后，年齡≥65歲患者較年輕者AUC和Cmax分別增加52%和63%；女性比男性患者的AUC和Cmax分別高37%和52%，證實了年齡、性別對藥代動力學/藥效學(PK/PD)的影響；因所有入組患者血小板聚集抑制率均達標，因此研究者認為年齡、性別對療效影響沒有臨床意義。這可能與替格瑞洛本身抑制血小板聚集功能較強有關，但其樣本量較少，且PK/PD的差異性與出血、呼吸困難等不良反應的相關性還有待研究。既往研究顯示替格瑞洛出血風險增加，與女性、年齡>75歲，同時使用非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和抗栓藥物有關[16]。REPLACE-2研究顯示[17]，女性患者是PCI術后發生出血事件的獨立危險因素，機制尚未完全明了，可能與微血管病變、血管相關并發癥以及相對于低體重指數的過度抗凝有關。

本研究通過對120例PCI術后ACS患者的血漿樣本進行分析，建立了ACS患者PCI術后血漿中替格瑞洛及其代謝物HPLC—MS/MS測定法，方法穩定且符合生物樣品定量分析要求，并成功應用于臨床。從血藥濃度監測的結果證實了替格瑞洛谷濃度與不同人群特征之間可能存在相關性，這不僅豐富了替格瑞洛在中國冠心病患者人群中的研究，對指導ACS患者抗血小板藥物的個體化治療和開展有效性、安全性臨床研究提供了一定的參考價值。