miR-205-5p負靶向調控血管內皮生長因子A對子宮內膜異位癥的影響

閔逸飛，應小燕

0 引 言

子宮內膜異位癥是一種良性的婦科炎癥性疾病，子宮內膜組織異常，育齡婦女發病率高，高達10%[1]。流行病學研究結果顯示，育齡婦女子宮內膜異位癥的發病率高達15%，全球患者數量超過2億，近年來發病率逐年上升。治療方案主要是藥物治療和手術治療，但藥物治療的不良反應普遍比較大，手術治療風險高，并發癥多[2]。有文獻報道，miRNAs在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等多種婦科疾病中起調控作用，但在子宮內膜異位癥中的研究較少[3-5]。miR-205-5p在子宮內膜異位癥患者中表達降低，且通過靶向子宮內膜基質細胞中的 ANGPT2 抑制人類子宮內膜異位癥的進展[6]，但其作用機制尚不完全清楚。眾所周知，miRNAs通常與其靶mRNA共同作用，通過mRNA的降解影響癌癥的發生發展[7]。血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)屬于血小板衍生生長因子(PDGF)/血管內皮生長因子(VEGF)家族，以二硫鍵連接的同二聚體形式存在[8]。此外，VEGFA可誘導血管生成，促進內皮細胞生長和轉移，抑制細胞凋亡，并參與內皮細胞的生理和病理生物學過程[7]。本研究旨在探討miR-205-5p通過靶向VEGFA對子宮內膜異位癥患者異常表達的影響機制，為子宮內膜異位癥的治療提供理論的依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集2019年8月-2020年12月因良性婦科疾病在南京醫科大學附屬常州第二人民醫院60例行子宮切除術患者的組織和血清樣本，將患者樣本分為子宮內膜異位癥(EC)組(n=30)與正常子宮內膜(EN)組(n=30)，接受激素治療或同時患有惡性腫瘤的患者被排除在外。本研究經南京醫科大學附屬常州第二人民醫院倫理委員會批準(倫理批準號：[2019]YLB016)。

1.2 主要試劑與設備RIPA裂解液(KL131008250)和雙熒光素酶報告試劑盒(RG027)及Tunel試劑盒(C1098)均購自上海碧云天生物科技有限公司。Trizol試劑盒(15596-026)購自Invitroge。熒光定量PCR儀(7300)購自美國ABI公司，顯微鏡是上海光學儀器廠生產。

1.3 子宮內膜基質細胞獲取及處理收集子宮內膜組織，用PBS沖洗3次，用無菌眼剪切破碎，加入5 mLI型膠原酶(1 mg/mL)，在37 ℃培養箱中消化60 min，每20 min攪拌一次。然后將混合的細胞懸液通過200和400目不銹鋼細胞過濾器進行過濾。然后在DMEM/F-12培養基和37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

使用免疫細胞化學熒光染色鑒定子宮內膜基質細胞純度。用0.3%Triton-X-100 37 ℃孵育30 min，4%甲醛固定30 min，用5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min，然后用波形蛋白一抗(ab8978和Abcam)抗體4 ℃過夜。使用一抗孵育之后，分別采用0.3%Triton-X-100和PBS沖洗3～4次，加入一抗所對應的二抗，37 ℃的環境下孵育40 min。最后，加入100 μL 4,6-生物胺-2-苯甲酰(DAPI)15 min，沖洗，甘油密封，熒光顯微鏡觀察。

使用轉染技術在子宮內膜基質細胞中轉染miR-205-5p模擬，將細胞分為NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質粒組、miR-205-5p模擬+質粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測mRNA的表達量利用RT-PCR技術檢測組織、細胞和血液樣本中miR-205-5p的表達。使用Trizol試劑提取組織、細胞和血液樣本中的總RNA。使用SYBRGreen定量PCR試劑盒完成PCR反應，反應的體系及反應的條件，均按照試劑盒的說明進行實驗，并放置實時熒光定量PCR儀進行擴增，并采用2-ΔΔCt計算相關因子的表達量。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗將不同方法處理的細胞接種于96孔的反應板中，接種后，分別于24 h、48 h、72 h后加入CCK-8的溶液，并放置酶標儀中進行檢測。

1.6 采用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(Edu)法檢測細胞增殖情況將細胞濃度調整到1×106/mL，以每孔500 μL接種于，預覆蓋玻片的24孔板中，培養基每3 d更換一次。在每個設定時間點前2 h，加入50 μLEdU培養物，沖洗細胞，加入細胞固定液。按照EdU試劑盒的說明書進行染色，并拍照并計數。

1.7 蛋白印跡法檢測增殖和凋亡相關蛋白的表達采用蛋白印跡法檢測增殖[增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki67]相關蛋白和凋亡(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9)相關蛋白的表達水平。加入含PMSF(Bio-Rad)的細胞裂解液，冰下裂解細胞20 min，4 ℃，離心5 min，收集上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，進行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳，轉膜上，5%的脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜。加入一抗對應的二抗孵育2 h，用TBST洗滌顯影。利用ImageJ軟件對其灰度值進行分析。

1.8 細胞凋亡根據凋亡試劑盒說明，在不同方法處理的細胞中加入緩沖液，將細胞懸液轉移到含有5 μL AnnexinV/FITC和10 μL碘化丙啶的流動管中，室溫孵育0.5 h，流式細胞術分析。

1.9 劃痕實驗將不同方法處理的細胞接種于6個孔的反應板中，培養24 h。當細胞滿85%時，使用微采樣器垂直交叉，PBS洗滌，加入基礎培養基，在37 ℃，5%CO2培養箱中培養。觀察并記錄了細胞的遷移情況。使用ImageJ軟件從6～8條水平線中計算細胞間距離的平均值。

1.10 Transwell實驗在Transwell上室中加入200 μL不同方法處理的細胞懸液，下室中加入600 μL10%胎牛血清培養基。孵育24 h后，固定中性甲醛，染色1%結晶紫，顯微鏡下計算NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質粒組、miR-205-5p模擬+質粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組細胞數量。

1.11 雙熒光素酶報告基因實驗使用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測細胞中熒光素酶的反應強度，使用相對熒光素酶活性(%)表示絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)基因的表達水平。

1.12 統計學分析采用SPSS 22.0進行數據分析，使用配對t檢驗比較miR-205-5p在正常和異位子宮內膜組織和血清中的表達差異。使用非配對t檢驗比較兩組獨立樣本之間的差異性。使用單因素方差分析兩組及以上的差異性。使用雙因素方差分析CCK-8實驗不同組間的差異性。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-205-5p在組織和血液中的表達與正常子宮內膜(EN)組相比，子宮內膜異位癥(EC)組患者的組織和血液中miR-205-5p的表達明顯降低(P<0.01)，見圖1。

a：組織樣本；b：血液樣本

2.2 子宮內膜基質細胞純度檢測培養24 h后，細胞大多數呈梭形，細胞生長達滿視野需要7 d，傳代后細胞生長達滿視野需要3 d。通過免疫熒光鑒定出兩種細胞的特性，波形蛋白(vimentin)陽性是基質細胞，角蛋白(cytokeratin)陽性是上皮細胞，見圖2。

圖2 Vimentin/Cytokeratin免疫熒光染色鑒定分離的子宮內膜基質細胞(×400)

2.3 miR-205-5p對異位子宮內膜基質細胞增殖和凋亡的影響RT-PCR結果顯示，轉染miR-205-5p模擬后，miR-205-5p的表達顯著提高(P<0.01)。CCK8、EdU和Western Blot實驗結果表明，與NC模擬組相比，miR-205-5p模擬組細胞活力和增殖下降(P<0.01)，細胞中增殖相關蛋白(PCNA、Ki67)水平降低(P<0.01)。提示miR-205-5p顯著抑制子宮內膜基質細胞的增殖和活力。見圖3。

a：RT-PCR驗證轉染效率；b：CCK-8檢測細胞活力；c：EdU檢測細胞增殖；d：Western blot檢測增殖相關蛋白

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，與NC模擬組相比，miR-205-5p模擬組細胞凋亡增加(P<0.01)。Western blot結果顯示凋亡相關蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)表達升高(P<0.01)，Bcl-2表達降低(P<0.01)。提示miR-205-5p促進子宮內膜基質細胞凋亡。見圖4。

a:流式細胞儀檢測細胞的凋亡；b:Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白

2.4 miR-205-5p對異位子宮內膜基質細胞遷移侵襲的影響進一步使用劃痕實驗和Transwell來檢測miRi-205-5p過表達對子宮內膜基質細胞遷移和侵襲的影響。結果顯示，miR-205-5p模擬組子宮內膜基質細胞的遷移和侵襲能力明顯降低(P<0.01)。與NC模擬組相比，miR-205-5p組的遷移和侵襲相關蛋白(Cox-2、MMP-2和MMP-9)的表達水平顯著降低(P<0.01)。提示miR-205-5p可抑制子宮內膜基質細胞的遷移和侵襲。見圖5。

a：遷移實驗檢測細胞的遷移能力;b:Transwell檢測細胞的遷移和侵襲能力;c:Western blot實驗檢測遷移與侵襲相關蛋白

2.5 miR-205-5p的下游靶基因篩選及鑒定結果使用生物信息學來預測miR-205-5p的結合位點，見圖6。并使用雙熒光素酶報告基因分析來驗證VEGFA是miR-205-5p的靶點，見圖7。與健康個體相比，子宮內膜異位癥組織中VEGFA的表達明顯增加(P<0.01)，見圖8，提示miR-205-5p可能負調控VEGFA。RT-PCR和免疫印跡檢測顯示，過表達miR-205-5p后，子宮內膜基質細胞中VEGF的表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖9、圖10。這表明VEGFA是miR-205-5p的一個靶點，并受到負調控。

圖6 生物信息學預測miR-205-5p 的靶標

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

*P<0.01

2.6 拯救實驗探索miR-205-5p和VEGFA對子宮內膜基質細胞的影響的結果RT-PCR結果顯示，轉染過表達VEGFA質粒后，VEGFA在細胞中的表達顯著升高;CCK8和EdU實驗結果表明，與miR-205-5p模擬+質粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細胞活力和細胞增殖顯著升高(P<0.01);見圖11。

a:RT-PCR檢測VEGFA的表達;b:CCK-8檢測細胞活力;c:EdU檢測細胞增殖

流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，與miR-205-5p模擬+質粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細胞的凋亡顯著降低(P<0.01)，見圖12。提示VEGFA的過表達可以逆轉miR-205-5p過表達引起的細胞的凋亡升高。

與NC模擬+質粒組相比，*P<0.01；與miR-205-5p模擬+質粒組相比，#P<0.01

Transwell和劃痕實驗結果表明，與miR-205-5p模擬+質粒組相比，miR-205-5p模擬+VEGFA組的細胞的遷移和侵襲能力顯著降低，見圖13。提示VEGFA的過表達可以逆轉miR-205-5p過表達引起的細胞增殖、遷移和侵襲能力的降低，以及細胞凋亡的升高。即miR-205-5p通過負調控VEGFA抑制細胞的增殖，遷移和侵襲，降低細胞的活力，促進細胞的凋亡。

a:Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲；b:劃痕實驗檢測細胞的遷移

3 討 論

子宮內膜異位癥(EM)是一種與雌激素相關的慢性良性婦科疾病，主要癥狀為痛經、盆腔疼痛，可引起不孕，育齡婦女較高，易復發，并發癥較多[9]。EM具有生長迅速、侵襲性強、多器官轉移等類似惡性腫瘤的特點。關于其發病機制有多種理論，但其發病機制尚不清楚[10-11]。

微小RNA(miRNA)是一組由18～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，在轉錄調控后水平調控相關基因的表達中起關鍵作用[12]。有文獻報道miRNA在多種細胞過程中發揮關鍵作用，影響腫瘤細胞的分化、凋亡、遷移[13-14]。研究發現，肺癌、肝癌、乳腺癌等常見的惡性腫瘤的發生可能與miRNA的異常表達有關[1]。有文獻研究發現，在子宮內膜異位癥患者中，miR-34a-5p和AKT1基因的表達水平在子宮內膜組織中呈負相關，提示miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因影響子宮內膜基質細胞的增殖和自噬，并影響細胞的遷移及侵襲能力，進而影響子宮內膜異位癥的發病[15-16]。miR-205-5p在子宮內膜異位癥患者的組織和血清中的表達與健康者相比顯著降低[6]。

為了進一步研究miR-205-5p對基質細胞的增殖凋亡的影響。本研究采用轉染技術，以子宮內膜基質細胞為研究對象，轉染miR-205-5p模擬，過表達miR-205-5p。結果顯示，過表達miR-205-5p后，細胞活力和細胞增殖降低，相反，細胞的凋亡增加。Ki67和PCNA屬于腫瘤細胞的增殖因子[17-18]，可以作為指標來評估細胞的增殖狀態[19-20]。Bcl-2、Bax、裂解半胱天冬3和裂解半胱天冬9蛋白是細胞凋亡的重要因素，Bcl-2表達升高提示抑制凋亡，而Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達升高可促進凋亡[21-22]。過表達miR-205-5p后細胞的增殖相關蛋白(PCNA、Ki67)水平降低，凋亡相關蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)的表達升高，Bcl-2的表達下降。提示miR-205-5p促進子宮內膜基質細胞的凋亡，抑制其增殖和活力。

細胞的遷移和侵襲是一個復雜過程，受黏附因子的調控，從而實現在體內的遷移和侵襲[23-24]。文獻報道表明，環氧化物酶Cox-2可上調MMPs的表達，促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲[25]。在子宮內膜異位癥的研究中，MMP-9和 MMP-2可以作為子宮內膜異位癥組織或者細胞侵襲能力檢測指標之一[26]。本研究結果表明，miR-205-5p過表達抑制子宮內膜基質細胞遷移與侵襲相關蛋白(Cox-2、MMP-2、MMP-9)的表達。提示miR-205-5p降低子宮內膜基質細胞的遷移和侵襲能力。

先前研究發現VEGFA在子宮內膜異位癥組織和細胞中顯著高表達，miR-17-5p可以通過負調控VEGFA的表達來抑制子宮內膜異位癥中的細胞增殖、遷移和侵襲[7]。本研究進一步研究證實VEGFA的過表達可以逆轉miR-205-5p過表達引起的細胞增殖的降低，細胞遷移和侵襲能力的降低。

綜述所述，miR-205-5p通過負調控VEGFA抑制細胞的增殖，降低細胞的活力，促進其凋亡，同樣降低細胞的遷移和侵襲能力。