魚腥草炭疽病病原鑒定及室內藥劑篩選

周潔，吳金平，王明安，齊傳東，鄧紅軍，文生巧，郭鳳領*

（1湖北省農業科學院經濟作物研究所，湖北武漢 430070；2湖北省蔬菜種質創新與遺傳改良重點實驗室，湖北武漢 430070；3湖北省十堰市房縣蔬菜服務中心，湖北十堰 442100；4宜昌市農業技術推廣中心，湖北宜昌 443000；5中華人民共和國武漢海關，湖北武漢 430040）

0 引言

【研究意義】魚腥草（Houttuynia cordataThumb.）屬三白草科蕺菜屬多年生草本植物，富含多種甾醇、多酚、黃酮等生物活性物質（Yang and Jiang，2009），具有清熱解毒、抗炎鎮痛、抑菌抗病毒和增強免疫力等功效，被譽為“神草”和“天然第一抗生素”，被國家衛生部確定為“既是藥品，又是食品”的特色野菜資源，是具有巨大發展潛力的食用和藥用資源（谷婷等，2021）。魚腥草地上莖葉和地下根莖均可食用，深受我國中部、西南及東南各地人們喜愛。隨著人們生活水平的不斷提升以及魚腥草開發利用的逐步深入，市場對魚腥草的需求與日俱增，魚腥草種植面積不斷擴大，據相關部門統計數據顯示，中國魚腥草之鄉——湖北省宜昌市當陽市兩河鎮2021年魚腥草種植面積已超過1000 ha，產值超5億元，產品廣銷貴州、北京等20多個省（市）。為了提高魚腥草產量及生產效益，農戶通常進行大肥大水集約化種植，從而導致病害發生日益嚴重，其中魚腥草葉部病害的發生呈逐年上升趨勢。目前，關于魚腥草的研究多集中于醫療保健方面，對病害的研究相對較少，因此，明確魚腥草葉部病害的致病菌，了解其生物學特性及篩選有效防控藥劑，對指導大田魚腥草病害科學防治具有重要意義。【前人研究進展】關于魚腥草病害相關研究國內最早為董寶成（2004）對四川雅安的魚腥草紫斑病進行了病原鑒定及防治藥劑篩選，發現球黑孢霉屬（Nigrospora.sp）真菌為致病菌，甲基托布津和多菌靈對該病防治效果較好；吳遠惠等（2007）通過對貴陽烏當魚腥草病樣上分離的病原菌進行致病性測定和形態特征分析發現，魚腥草葉斑病致病菌為葉點霉屬（Phyllostictasp.）病菌，魚腥草莖腐病致病菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），魚腥草白絹病由齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起，以上鑒定均基于病原菌形態，并未對病原菌進行分子鑒定；呂茹婧等（2009）對湖北宜昌當陽魚腥草葉斑病進行鑒定，首次發現該病由鏈格孢（Alternaria alternata）侵染所致；趙茜（2010）通過形態特征和ITS序列分析發現四川雅安魚腥草炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），最適生長溫度為28℃，病菌對多種糖類碳源利用率較高，氮源利用率以無機硝態氮最好，多菌靈對該病菌的抑制效果較好；Zheng等（2011）也發現鏈格孢可侵染魚腥草引起葉斑病。此后10多年間關于魚腥草的研究主要集中于生物活性物質的開發利用，直至2020年高晉等（2020）首次發現擬盤多毛孢（Pestalotiopsissp.）是貴州省施秉縣魚腥草褐斑病致病菌，并發現葡萄糖、蛋白胨和光照有利于擬盤多毛孢菌絲體的生長。目前生產上對魚腥草病害的防控仍以化學防治為主。高立波等（2020）對桂林市魚腥草白絹病的發病規律進行了研究，并結合物理防控和化學防控方法制定了魚腥草白絹病防治措施，甲基托布津、多菌靈和波爾多液對魚腥草種莖進行消毒后可有效降低白絹病的發生。對于魚腥草根腐病的防治多以甲霜惡霉靈進行葉面噴施和藥液灌根為主（侯彪等，2020）。除了常規的化學藥劑防治外，其他防治方法也有相關研究。轉基因魚腥草中外源抗菌肽的表達也可增強魚腥草植株對立枯絲核菌引起的莖基腐病的抗性（易浪等，2011）；使用木霉分生孢子制劑對魚腥草種莖進行浸種和土壤處理后對白絹病的田間防效可達70%以上（魏林等，2012）。炭疽病作為世界上“十大最重要病害”之一，在植物生長及貯藏期均可發生，同時炭疽菌寄主范圍廣，病菌種類復雜多樣。目前，炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌的分類主要以Sutton的分類系統為依據，包含膠孢炭疽菌、尾孢炭疽菌（C.cadatum）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）等39個種，其中包含14個復合種（劉麗萍等，2020）；對炭疽菌的鑒定主要采用無性型形態學特征與多基因分子鑒定相結合的方法，相較于單一的ITS序列準確識別率更高（李其利等，2020）。此外，基于多基因分子系統學的分析鑒定方法在新種和復合種中的鑒定上優勢明顯，已逐步應用于炭疽菌的分類研究（Liu et al.，2016）。截至2016年，被鑒定的炭疽菌種多達190個。近年來，平均每年均有新的炭疽菌新種被發現，多集中于茶、辣椒和大豆等經濟作物（劉麗萍等，2020）。植物炭疽病的防治仍遵循“預防為主，綜合防治”的方針，三唑類和咪唑類殺菌劑在該病防治中占有重要地位，同屬脫甲基化酶抑制劑類殺菌劑，其中咪鮮胺和苯醚甲環唑為常用藥劑，主要應用于蔬菜、水果等經濟作物（孫偉等，2022）。徐從英等（2021）發現5種殺菌劑中咪鮮胺對云南橡膠炭疽病菌的防治效果最佳。同時，苯并吡唑類殺菌劑如多菌靈（Han et al.，2018）和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如嘧菌酯（韋繼彥等，2020）等其他類型藥劑在作物炭疽病的防治上也有所應用。此外，羅躍等（2021）通過菌絲生長抑制法測定的7種殺菌劑原藥中丁香菌酯對葡萄膠孢炭疽菌的抑制作用最強，其抑制中濃度（EC50）為0.18 mg/L。竺利紅等（2022）通過盆栽試驗發現稀釋100倍的芽孢桿菌SM905粉劑對鐵皮石斛膠孢炭疽菌的防效為80.74%，效果優于稀釋800倍的10%苯醚甲環唑水分散粒劑。可見，生物制劑對炭疽菌的生長也有較好的抑制效果。【本研究切入點】隨著市場對魚腥草需求的增加，勢必會促進魚腥草種植業的發展，相關病害研究是該產業能否健康可持續發展的重要環節，而目前對于魚腥草的病害研究相對較少。據當陽市兩河鎮農技推廣中心調查數據顯示，作為西南魚腥草主產區，炭疽病已成為該種植區的主要病害之一，近年來呈明顯上升趨勢，2021年當地魚腥草炭疽病平均發病率達30%左右，導致魚腥草產量降低，已成為影響魚腥草產業健康發展的主要病害之一。因此，有必要對該病原菌進行分析鑒定，從而對其進行有效防控，減少種植戶損失。【擬解決的關鍵問題】采用組織分離法對湖北省宜昌市當陽市兩河鎮魚腥草炭疽病病原進行分離，基于柯赫氏法則進行病原菌致病性測定，結合病原菌形態特征和多基因序列分析，明確致病菌種類及生物學特性，并進行室內殺菌劑篩選，獲得有效的魚腥草炭疽病防控藥劑，為魚腥草炭疽病大田防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

魚腥草炭疽病病樣采自當陽市兩河鎮魚腥草示范基地。供試藥劑：30%甲霜噁霉靈水劑（佛山市盈輝作物科學有限公司）、25%吡唑醚菌酯懸浮劑（山東榮邦化工有限公司）、250 g/L嘧菌酯懸浮劑（先正達南通作物保護有限公司）、62%嘧環·咯菌腈水分散粒劑（杭州宇龍化工有限公司）和50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇藍豐生物化工股份有限公司）；其中，甲霜噁霉靈屬于苯酰胺類殺菌劑，作用方式為抑制核酸合成（吳永剛等，2009）；吡唑醚菌酯和嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，作用方式為抑制線粒體呼吸作用（Btrett et al.，2002）；多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，作用方式為抑制細胞骨架的生物合成（孫偉等，2022）；嘧環·咯菌腈屬于吡咯類殺菌劑，作用方式為抑制信號轉換（吳永剛等，2009）。

1.2 病原菌的分離與致病性檢測

采用組織分離法對采集的魚腥草病葉樣本進行病原菌分離，將新長出的菌絲尖端轉入新的PDA平板，如此反復，直至病原菌純化，于PDA培養基上培養5 d備用（Dong et al.，2016）。致病性檢測采用菌絲塊接種法（陳業等，2021），選取魚腥草健康葉片，用75%酒精進行表面消毒，于葉片正面中部用無菌接種針形成傷口，在培養基上打取6 mm菌塊，菌絲朝下接種于葉片傷口處，以無菌PDA塊為對照，25℃培養，每處理3次重復，每天觀察葉片發病情況。葉片發病后重新分離并鑒定病原菌是否與接種病原菌一致。

1.3 病原菌形態學鑒定

將分離純化的病原菌在PDA培養基上25℃培養5 d后進行菌落形態及菌絲觀察，病原菌回接后進行分生孢子和附著胞特征觀察。

1.4 病原菌分子鑒定

利用CTAB法提取魚腥草炭疽病病原菌基因組DNA（吳發紅等，2009），利用引物ITS1/ITS4、GDF/GDR、Bt2a/Bt2b、ACT-512F/ACT-783R和CL1/CL2進行PCR擴增（Weir et al.，2012；徐丹丹等，2021）（表1），將擴增得到的序列委托武漢天一輝遠生物科技有限公司測序，將所得的序列在NCBI中進行BLAST比對分析，下載同源性高的序列和常用模式菌株序列，利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建多基因系統發育進化樹。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Sequences of tested primer in the experiment

1.5 病原菌生物學特性測定

經致病性及分子鑒定后，選取典型菌株采用菌絲生長速率法測定病原菌生物學特性（劉一賢等，2022）。

1.5.1 不同pH對病原菌菌絲生長的影響.用稀鹽酸和氫氧化鈉分別將PDA培養基pH調節至5、6、7、8、9、10和11，制備不同pH的PDA培養基，接菌塊后25℃培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.5.2 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響.以Czapek培養基為基礎，分別以葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、甘露醇、麥芽糖、D-果糖和可溶性淀粉以2%的添加量作為碳源，配制不同碳源培養基；分別以蛋白胨、酵母提取物、亞硝酸鈉、甘氨酸、L-谷氨酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀和牛肉浸粉以0.3%的添加量作為氮源，配制不同氮源培養基。菌塊分別接于不同的碳、氮源培養基正中央，25℃培養5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

1.5.3 病原菌孢子致死溫度測定.將菌塊放入裝有無菌水的滅菌PE管中，分別置于35、40、45、50、55、60和65℃水浴鍋中水浴10 min，隨后放置于PDA培養基上25℃培養，連續觀察3 d后確定菌絲致死溫度范圍，隨后通過以上方法以1℃為梯度進行致死溫度測定（潘忠梅等，2022）。

1.6 病原菌對供試殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定病原菌對5種供試殺菌劑的敏感性。分別制成不同濃度的PDA含藥培養基平板，以不含藥的PDA平板為對照，各接入6 mm菌絲塊于平板中央，每處理3次重復。25℃恒溫培養7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑不同濃度菌絲抑制率并建立毒力回歸方程，得出各藥劑的EC50。

1.7 統計分析

采用Excel 2016整理數據，利用SPSS 16.0進行相關數據的統計分析。以藥劑終濃度的對數值為x值，對應的菌絲生長抑制率為y值，建立相應殺菌劑的毒力回歸方程y=ax+b，進而計算出各藥劑對病原菌的EC50。

2 結果與分析

2.1 魚腥草炭疽病癥狀

魚腥草炭疽病主要發生在葉片，發病初期葉片上呈現灰褐色小點，逐步擴大后形成橢圓形或近圓形病斑，病斑中部灰褐色，邊緣深褐色，葉片褪綠，嚴重時植株葉片全部枯萎（圖1-A）。

2.2 魚腥草炭疽病病原菌的分離及病原菌形態特征和致病性測定結果

從采集的病葉樣本中共分離獲得6株菌株，選取具有代表性的菌株YXC26進行形態特征和致病性測定。

菌株YXC26于培養基上培養3 d后，菌落正面為白色，菌絲絨毛狀（圖1-D）。繼續培養后顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子盤形態分別如圖1-E和圖1-F所示，分生孢子梗呈柵欄狀排列；分生孢子為單胞無色，長圓柱形或長棒形，大小為（13.5~22.17）μm×（4.8~6.1）μm，含油球1個（圖1-G）；分生孢子萌發時中間有隔膜狀物質將其一分為二，兩部分均可萌發形成長橢圓形的附著胞（圖1-H）。

菌株YXC26回接在健康的魚腥草葉片上5 d后，葉片呈現灰褐色圓形病斑，病斑周圍有黃色暈圈，與田間發病癥狀相似（圖1-B），對照葉片未見感病癥狀（圖1-C）。從回接葉片上重新分離純化得到的菌株與接種病菌一致，由此判斷菌株YXC26為魚腥草炭疽病致病菌。

圖1 魚腥草炭疽病癥狀與病原菌形態Fig.1 H.cordata Thumb.anthracnose symptoms and pathogen morphology

2.3 病原菌分子鑒定結果

利用不同的特異性引物擴增得到菌株YXC26的ITS、GAPDH、TUB2、ACT和CAL基因序列分別為555、523、463、255和749 bp，將得到的5個基因序列在NCBI進行BLAST比對，結合下載的同源性較高的序列和菌株進行系統進化分析（表2），結果（圖2）顯示，菌株YXC26與C.gloeosporioides聚類在一支，且具有較高支持率，結合病原菌形態特征和分子鑒定結果，確定魚腥草炭疽病致病菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。

圖2 基于ITS、GAPDH、TUB2、ACT和CAL基因序列構建的菌株YXC26系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YXC26 based on ITS，GAPDH，TUB2，ACT and CAL gene sequences

表2 病原菌序列信息Table 2 Sequence information of pathogens

2.4 病原菌生物學特性測定結果

菌株YXC26對pH的適應范圍較廣，pH 5~11時均可生長，且菌絲致密，菌落背面均呈粉色；菌絲生長最適pH為6，菌落直徑最大，為7.57 cm；隨著pH的升高菌絲生長逐漸減慢，出現散生小黑點，當pH達9以上時菌落中密布小黑點和橘色分生孢子團，表明pH的升高有利于分生孢子的產生；pH 8~10時菌絲生長無顯著差異（P＞0.05），表明菌株YXC26具有一定的耐堿性（圖3）。

圖3 pH對菌株YXC26菌絲生長的影響Fig.3 Effects of pH on mycelium growth of strain YXC26

在供試氮源中，菌株YXC26對酵母提取物和牛肉浸粉的利用率最高，菌落直徑分別為6.48和6.57 cm，其次為蛋白胨、甘氨酸和硝酸鉀，對硫酸銨的利用率最低（圖4）。除甘氨酸外，其他氮源培養基上菌落菌絲均較致密；除硫酸銨外，其他氮源培養基上菌落邊緣菌絲呈輻射狀；此外，以蛋白胨、酵母提取物和牛肉浸粉為氮源的培養基上菌落中均有小黑點分布，其中酵母提取物為氮源的培養基上還有橘色分生孢子團產生，推測有機氮源有利于菌株YXC26分生孢子的產生。

圖4 氮源對菌株YXC26菌絲生長的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on mycelium growth of strain YXC26

在供試碳源中，菌株YXC26對麥芽糖和葡萄糖的利用率最高，菌落直徑分別為5.90和5.75 cm，其次為蔗糖、D-果糖和可溶性淀粉，對甘露醇的利用率最低，菌落直徑為4.55 cm（圖5）。在以α-乳糖和甘露醇為碳源的培養基上菌落菌絲略為稀疏，且菌落背面為無色，其他碳源培養基上菌落菌絲均較致密，背面呈粉色，所有碳源培養基上均無橘色分生孢子團產生。

圖5 碳源對菌株YXC26菌絲生長的影響Fig.5 Effects of carbon source on mycelium growth of strain YXC26

菌株YCX26在50℃熱處理后可以生長，經55℃熱處理后不能生長。因此，以50℃為起始溫度，1℃為梯度設置溫度梯度至55℃，結果發現52℃熱處理后菌株YXC26菌絲可以生長，53℃熱處理10 min后菌絲無法生長，由此得到菌株YXC26菌絲致死溫度為53℃處理10 min。

2.5 病原菌對供試殺菌劑的敏感性測定結果

由表3可看出，5種供試殺菌劑對菌株YXC26的抑制效果差異較大，其中，以多菌靈對菌株YXC26菌絲生長的抑制效果最好，其EC50為0.04 mg/L，其次為吡唑醚菌酯，其EC50為0.14 mg/L，嘧環·咯菌腈的抑菌效果也較好，EC50為1.16 mg/L，而甲霜噁霉靈和嘧菌酯對菌株YXC26的EC50分別為31.26和39.63 mg/L，對菌株YCX26的菌絲生長抑制效果較差。

表3 5種殺菌劑對菌株YXC26的室內毒力測定結果Table 3 Results of indoor toxicity determination of 5 fungicides against strain YXC26

3 討論

魚腥草因富含多種生物活性成分廣泛應用于醫藥和保健行業，隨著市場需求量逐漸增加，魚腥草種植面積隨之擴大，種植中炭疽病的逐年加重嚴重影響了魚腥草嫩芽和地下根莖的品質和產量。本研究結合當陽兩河鎮魚腥草病害發生情況對炭疽病進行了病原菌分離鑒定，首次通過多基因序列比對明確了當陽魚腥草炭疽病病原為膠孢炭疽菌，趙茜（2010）結合病原形態學和ITS序列確定了四川雅安魚腥草炭疽病病原為膠孢炭疽菌，本研究與之結果相同。

生物學特性測定結果顯示，魚腥草膠孢炭疽菌的最適pH為6，且具有一定的耐堿性，在湘西西瓜上分離獲得的膠孢炭疽菌在pH為6時菌絲生長速度最快（黃蔚等，2022），二者結果相似。本研究膠孢炭疽菌的最適pH與江小冰等（2022）在杧果上分離到的膠孢炭疽菌最適pH在7~9存在一定差異，可能與寄主種類和種植氣候不同有關。在本研究供試碳、氮源中，膠孢炭疽菌菌絲生長的最佳碳源為麥芽糖和葡萄糖，以麥芽糖利用率最高，西瓜膠孢炭疽菌的最佳碳源為葡萄糖和蔗糖（黃蔚等，2022），二者結果有一定的相似性，病原菌對葡萄糖的利用率均較高。而河南商丘月季膠孢炭疽菌菌絲生長最佳碳源為淀粉（婁喜艷等，2021），本研究中膠孢炭疽菌對淀粉的利用率略低于麥芽糖。本研究中魚腥草膠孢炭疽菌的最佳氮源為酵母提取物和牛肉浸粉，酵母提取物為氮源的培養基上有橘色分生孢子團產生，三葉青膠孢炭疽菌在以酵母膏為氮源的培養基上產孢量最大，菌絲在以牛肉浸膏為氮源的培養基上生長最快（李戌清等，2020），本研究結果與之相似。本研究中病原菌菌絲致死溫度為53℃處理10 min，而有研究表明板栗栗果腐爛病致病菌膠孢炭疽菌的致死溫度為55℃處理10 min（王俊鳳，2020），二者之間的差異可能是由于病原菌來自不同寄主所致。

本研究通過室內藥劑篩選，確定了當陽魚腥草炭疽病的防控可選用多菌靈，不推薦使用甲霜噁霉靈和嘧菌酯。炭疽病是一種重要的作物病害，在辣椒、蘋果和葡萄等多種植物上均有發生，侵染能力強，寄主范圍廣。目前炭疽病仍以化學防治為主。花椒上膠孢炭疽菌的防治以苯醚甲環唑和百菌清抑菌效果較好，EC50為2 mg/L左右，多菌靈對該病原菌的抑制效果較差，EC50達99.42 mg/L（趙祜等，2015）；在本研究中多菌靈對魚腥草炭疽病菌的抑制效果則最佳，EC50僅為0.04 mg/L。本研究結果與已有的報道比較發現多菌靈對不同寄主上膠孢炭疽菌的抑制效果存在較大差異，可能是由于不同寄主類型及防治藥劑使用存在差異所致。崔一平等（2022）發現膠孢炭疽菌可侵染廣東懷集青心菊花朵引起炭疽病，苯醚甲環唑和咪鮮胺對其防治效果較好，噻呋嘧菌酯防治效果一般。本研究中的嘧菌酯與噻呋嘧菌酯同屬甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對魚腥草炭疽病的防治效果一般，兩者研究結果相似。隨著病原菌抗藥性的發生，對炭疽病的生物防治也日益受到關注。謝立等（2020）研究發現枯草芽孢桿菌Czk1發酵液與咪鮮胺和根康（惡霉靈和強活化抗病因子）分別復配后對橡膠炭疽病菌的抑菌活性均有明顯的增效作用。羅躍等（2021）明確了貴陽花溪葡萄炭疽病致病菌為膠孢炭疽菌，丁香菌酯對其抑制作用最強，與化學藥劑混配施用后協同增效效果顯著。此外，研究發現香茅精油熏蒸處理不僅可抑制引起番木瓜炭疽病的膠孢炭疽菌菌絲生長，還能提高果實抗病相關酶的活性（陳曉晶等，2022）。本研究甲霜噁霉靈和嘧菌酯在室內毒力測定中EC50均超過30.00 mg/L，防治效果較差，可能與當地農戶在魚腥草種植過程中長期使用嘧菌·噁霉靈有關，可選擇多菌靈等其他類型的殺菌劑進行防控，同時推薦多種不同類型殺菌劑交替使用，結合部分生物制劑配施，盡可能減緩田間病原菌抗藥性的發生，提高藥劑使用效率，提升田間病害防控效果。

4 結論

湖北省宜昌市當陽市兩河鎮魚腥草炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides），該菌生長的最適pH為6，對麥芽糖、葡萄糖、酵母提取物和牛肉浸粉利用率較高，菌絲致死溫度為53℃處理10 min。50%多菌靈可濕性粉劑、25%吡唑醚菌酯懸浮劑和62%嘧環·咯菌腈水分散粒劑對魚腥草炭疽病菌菌絲生長均有較好的抑制作用，可作為魚腥草炭疽病田間防治的候選藥劑。