短穩桿菌對草地貪夜蛾的殺蟲活性及其體內解毒酶的影響

武懷恒，向禮波，李文靜，許敏，姜理濤，許冬，叢勝波，萬鵬

（農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農作物病蟲草害防控湖北省重點實驗室/湖北省農業科學院植保土肥研究所，湖北武漢 430064）

0 引言

【研究意義】草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）隸屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），原發生于美洲熱帶和亞熱帶地區，是一種分布廣泛的世界性農業害蟲（Montezano et al.，2018）。草地貪夜蛾具有遷飛習性，其擴散速度快，且對作物危害嚴重。據歐洲地中海植物保護組織和亞洲各國發布的信息，截至2019年1月，草地貪夜蛾已在全球100多個國家分布（王磊等，2019）。草地貪夜蛾的入侵對我國農業生產和糧食安全造成嚴重威脅（楊普云等，2019）。草地貪夜蛾以幼蟲取食玉米葉片、葉心和果穗等對玉米直接危害（洪鼎剴等，2021），并造成鐮孢菌和黃曲霉等微生物從受害部位侵入植株，產生毒素，造成玉米產量、質量下降（梁沛等，2020）。目前，有關化學殺蟲劑防治草地貪夜蛾的研究較多，并且在生產上化學農藥亦是防治該蟲的主要手段（趙勝園等，2019；關秀敏等，2021）。在草地貪夜蛾不斷擴散和暴發為害的趨勢下，大量使用化學農藥并非防控害蟲的長久之計，必須尋求其他防控手段以減少或替代化學農藥，以實現草地貪夜蛾的可持續治理。生物防治作為害蟲綠色防控的重要組成部分，對農業可持續發展、食品安全保障等提供了物質基礎和技術支撐。病原微生物殺蟲劑作為一類生物農藥，具有能持續控制害蟲、對環境友好且不易引起害蟲產生抗性等優點，在害蟲防治中發揮著重要作用。短穩桿菌（Empedobacter brevi）是一種從感病斜紋夜蛾（Spodoptera litura）體內分離的病原微生物，其作用機理是通過昆蟲取食進入蟲體并大量繁殖，在生長發育過程中產生蛋白質毒素，干擾蟲體新陳代謝，從而殺死昆蟲（趙磊等，2017）。研究短穩桿菌對草地貪夜蛾的殺蟲活性及其對解毒酶活性的影響，對于減少化學農藥使用、高效綠色防控草地貪夜蛾具有重要意義。【前人研究進展】草地貪夜蛾的入侵，導致我國防治該蟲的化學農藥使用量大幅增加。有學者研究發現，草地貪夜蛾入侵云南后，玉米田化學農藥總使用量顯著增加，施用次數由2.1次增加至6.4次（Yang et al.，2021）。然而，化學殺蟲劑的大量不規范使用極易導致草地貪夜蛾產生抗藥性。田間抗性監測研究報道，草地貪夜蛾部分種群對常用化學防治藥劑有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類農藥已達中至高等水平抗性（王芹芹等，2019；趙勝園等，2019；Zhang et al.，2021），對甲維鹽和氯蟲苯甲酰胺等新型農藥表現出中低水平抗性（蘇湘寧等，2020）。生物農藥具有安全高效、選擇性強、不易對環境造成污染等優點，害蟲防治中使用生物農藥可減緩害蟲對化學殺蟲劑抗藥性增強，同時減少化學農藥使用量，是農藥發展的方向（顏成生等，2015）。短穩桿菌作為新型的生物農藥對多種鱗翅目及雙翅目害蟲具有良好的殺蟲活性。相關研究發現，短穩桿菌對大豆卷葉螟（Lamprosema indicata）和茶尺蠖（Ectropis oblique）均有很好的室內殺蟲效果（關成宏等，2016；姚惠明等，2017），不僅如此，短穩桿菌對田間害蟲也有優良的防治效果，其對水稻田二化螟（Chilo suppressalis）、玉米田黏蟲（Mythimna seperata）、煙草上的煙青蟲（Heliothis assulta）、大棚內黃瓜上的美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）等防治效果均可達80%以上，與化學藥劑相當（吳銘忻等，2016；孫劍華等，2018；王義生等，2018；遲騰和紀祥龍，2020）。昆蟲可憑借生理、生化防御機制來抵御殺蟲劑及其他外源或內源有害物質（Zhang et al.，2017；李長春等，2019；魯智慧等，2020）。在自身防御機制中，昆蟲可利用解毒酶系來進行解毒和排毒（Felton and Tumlinson，2008）。昆蟲體內的主要解毒酶谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和羧酸酯酶（CarE），以及乙酰膽堿酯酶（AChE）均參與外源有毒物質的分解和代謝（Yang et al.，2013；張鑫乾等，2014）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內有關生物農藥對草地貪夜蛾解毒酶活性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】測定短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲的室內毒力與田間防效，并檢測短穩桿菌處理后草地貪夜蛾幼蟲體內GST、CarE和AChE活性變化，以明確短穩桿菌對草地貪夜蛾的殺蟲活性及其解毒酶的影響，為草地貪夜蛾的高效綠色防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試昆蟲.供試草地貪夜蛾在實驗室用人工飼料飼養。室內殺蟲活性測定試驗時，分別選擇個體大小一致且健康的1、2和3齡幼蟲。

1.1.2 供試藥劑100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑（SC）（江蘇省鎮江市潤宇生物科技公司生產）；0.5%苦參堿水劑（SL）（江蘇省南通神雨綠色藥業有限公司生產）；200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（SC）（美國杜邦公司生產）。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內殺蟲活性測定.采用葉片浸漬法測定。試驗藥劑短穩桿菌設置為1.00×108、1.00×107、5.00×106、2.50×106、1.25×106孢子/mL等5個梯度濃度處理，以清水處理為對照。用剪刀將玉米嫩葉剪至5 cm大小，然后在不同藥劑處理中浸10 s后取出并晾干，放入直徑為9 cm的塑料培養皿中，接入大小一致已饑餓2 h的草地貪夜蛾幼蟲；其中1和2齡幼蟲每培養皿接入10頭、3齡幼蟲每培養皿接入5頭。每處理重復3次，每重復接蟲30頭左右。將以上處理置于光照培養箱內，設置溫度（27±1）℃、濕度（70±5）%、光周期L∶D=14 h∶10 h，藥后72 h檢查不同處理的死蟲數，計算死亡率。

1.2.2 田間藥效試驗.采用噴霧法測定。選擇受草地貪夜蛾中度為害的玉米田進行試驗，幼蟲多為2~3齡，玉米生育期為小喇叭口期。短穩桿菌懸浮劑對斜紋夜蛾推薦殺蟲用藥量為800~1000倍液，即孢子濃度1.25×107~1.00×107孢子/mL，據此設以下5個處理：（1）100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑800倍液；（2）100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑1000倍液；（3）0.5%苦參堿水劑800倍液；（4）200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑2000倍液；（5）空白對照。試驗采用隨機區組排列，每小區面積60 m2，不同藥劑處理區間隔2 m，每處理4次重復。

調查方法：參考高慶遠等（2021）方法，按照Z字型進行草地貪夜蛾幼蟲調查，每點調查10株玉米，每小區5點共計50株，每處理調查200株，并做好標記。分別于施藥前、施藥后3、5、7 d調查草地貪夜蛾幼蟲數量，計算蟲口減退率及防治效果。蟲口減退率（%）=（藥前活蟲數-藥后活蟲數）/藥前活蟲數×100；防治效果（%）=（處理區蟲口減退率-對照區蟲口減退率）（/100-對照區蟲口減退率）×100。

1.2.3 解毒酶和AChE活性測定.用短穩桿菌亞致死劑量對草地貪夜蛾室內種群進行處理，48 h后測定未死亡草地貪夜蛾的CarE、GST和AChE活性。

1.2.3 .1 短穩桿菌亞致死劑量處理.根據1.2.1試驗結果分別得出草地貪夜蛾1、2和3齡幼蟲的亞致死劑量（LC20），以亞致死劑量分別處理幼蟲，方法同1.2.1，48 h后取活蟲制備酶液。

1.2.3 .2 酶活性測定.參考徐偉等（2018）的方法，將草地貪夜蛾幼蟲稱重，每0.1 g蟲體加入1 mL提取液，冰浴下勻漿，8000 r/min離心10 min，取上清液待測。根據CarE、GST和AchE試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書步驟利用酶標儀分別測定CarE、GST和AChE活性。每組樣品3次重復。

1.3 統計分析

采用Excel 2010進行統計和整理死亡率、校正死亡率、蟲口減退率、防治效果、解毒酶及AChE活性；采用SPSS 20.0計算毒力回歸方程和半數致死濃度（LC50）、LC20及其95%置信區間，并用鄧肯氏新復極差法對蟲口減退率和防治效果進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 短穩桿菌對草地貪夜蛾的室內殺蟲活性

短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲的室內殺蟲活性測定結果（表1）顯示，短穩桿菌對草地貪夜蛾1~3齡幼蟲均具有較好的毒殺作用，濃度分別為1.00×108、1.00×107、5.00×106、2.50×106和1.25×106孢子/mL時草地貪夜蛾1齡幼蟲的校正死亡率分別為96.55%、86.21%、55.17%、36.21%和24.14%，LC50與LC20分別為3.32×106和9.15×105孢子/mL；2齡幼蟲的校正死亡率分別為94.92%、83.05%、62.71%、32.20%和23.73%，LC50與LC20分別為3.51×106和9.98×105孢子/mL；3齡幼蟲的校正死亡率分別為78.33%、58.33%、43.33%、31.67%和16.67%，LC50與LC20分別為9.14×106和1.02×106孢子/mL。

表1 短穩桿菌對草地貪夜蛾的室內殺蟲活性Table 1 Indoor insecticidal activity of E.brevis to S.frugiperda

2.2 短穩桿菌對草地貪夜蛾的田間藥效

由表2可看出，藥后各藥劑處理的蟲量均較處理前大幅下降。藥后3 d，短穩桿菌800和1000倍液、氯蟲苯甲酰胺2000倍液對草地貪夜蛾均表現出良好的殺蟲活性，防效均在80.00%以上；苦參堿800倍液的效果較差，防效僅為58.20%；分析不同藥劑處理間防效的差異性發現，短穩桿菌800和1000倍液與氯蟲苯甲酰胺2000倍液差異不顯著（P＞0.05，下同），但均顯著高于苦參堿處理（P＜0.05，下同）。藥后5 d，短穩桿菌800和1000倍液、氯蟲苯甲酰胺2000倍液的防效均達90.00%以上，顯著高于苦參堿800倍液處理。藥后7 d，短穩桿菌800和1000倍液、苦參堿800倍液及氯蟲苯甲酰胺2000倍液的防效分別為95.84%、93.78%、85.37%、91.70%，短穩桿菌800和1000倍液的防效稍高于氯蟲苯甲酰胺2000倍液處理，但差異不顯著；短穩桿菌800和1000倍液、氯蟲苯甲酰胺2000倍液的防效顯著高于苦參堿處理。整體結果表明，短穩桿菌800和1000倍液處理后3 d對草地貪夜蛾即有明顯的防治效果，藥后7 d達到最高水平。

表2 短穩桿菌對草地貪夜蛾的田間防治效果Table 2 Field control effect of E.brevis on S.frugiperda

2.3 短穩桿菌對草地貪夜蛾解毒酶和AChE活性的影響

由圖1-A可看出，短穩桿菌LC20劑量處理后草地貪夜蛾1、2和3齡幼蟲的GST活性分別為2.58、2.07、1.96 U/g，分別下降至對照的77%、64%和73%，可見短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲體內GST活性有明顯的抑制作用。

由圖1-B可看出，短穩桿菌LC20劑量處理后草地貪夜蛾1、2和3齡幼蟲的CarE活性分別為4.47、2.29、3.13 U/g，分別下降至對照的77%、49%和67%，可見短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲體內CarE活性有明顯的抑制作用。

由圖1-C可看出，短穩桿菌LC20劑量處理后草地貪夜蛾1、2和3齡幼蟲的AChE活性分別為2714.28、3468.79、2350.2 U/g，分別下降至對照的69%、98%和75%，可見短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲體內AChE活性有明顯的抑制作用。

圖1 短穩桿菌亞致死劑量（LC20）處理后草地貪夜蛾幼蟲體內解毒酶和AChE活性Fig.1 Detoxification enzyme and ACh Eactivity of S.frugiperda after sublethal concentration（LC20）of E.brevis treatment

3 討論

農藥在農作物病蟲害防治中具有重要作用，但隨著現代社會對食品安全、生態和環境安全意識的提高，人們認識到化學農藥的大量使用會造成病蟲害抗性、再猖獗和殘留等問題（王永強等，2019）。生物農藥由于具有低毒、低殘留、環境友好和不易產生抗藥性等特點而日益受到重視（邱德文，2015）。草地貪夜蛾是玉米田的重要害蟲，隨著防治面積和防治頻率的不斷增大，該蟲已對部分化學農藥產生抗性，當前選用生物農藥進行防治十分必要。作為新型的生物農藥，關于短穩桿菌對草地貪夜蛾的研究較少。本研究通過室內殺蟲活性測定發現，短穩桿菌對草地貪夜蛾幼蟲具有優良的毒殺效果；田間藥效試驗結果顯示，短穩桿菌處理7 d后對草地貪夜蛾幼蟲的防效在90.00%以上，高于植物源藥劑苦參堿，與化學藥劑氯蟲苯甲酰胺的防效相當。前人研究結果表明，短穩桿菌對茶尺蠖（姚惠明等，2017）、水稻二化螟（孫劍華等，2018）、玉米黏蟲（王義生等，2018）和水稻稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）（吳琳等，2019）等鱗翅目害蟲均具有較好的防治效果，本研究結果與之相似。然而，100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑是否會對玉米田中性昆蟲及天敵的安全性、天敵的捕食和寄生能力造成影響有待進一步研究。

短穩桿菌通過害蟲的取食進入消化道，并轉移到體腔和血淋巴等處大量增殖，釋放有毒物質，導致病蟲死亡（李良德等，2020）。昆蟲在受到外源有毒物質脅迫后，可通過增加體內解毒代謝酶GST、CarE及AChE活性對有毒物質進行分解和代謝；當蟲體內有毒物質量超過自身解毒代謝能力時，蟲體機能下降，解毒酶活性下降，昆蟲中毒死亡（Yang et al.，2013；張鑫乾等，2014）。李良德等（2020）研究發現，短穩桿菌在處理茶尺蠖幼蟲24 h后，茶尺蠖幼蟲體內GST、CarE和AChE活性呈下降趨勢。本研究中短穩桿菌處理草地貪夜蛾1、2和3齡幼蟲48 h后，蟲體內的GST、CarE和AChE活力整體表現出受抑制現象，與短穩桿菌處理茶尺蠖后的結果類似，推測短穩桿菌對害蟲的GST、CarE和AChE活性的抑制作用與其殺蟲效果相關。結合短穩桿菌對草地貪夜蛾的室內殺蟲活性結果和田間防效，推測該藥劑處理后解毒酶和AChE活性下降可能與蟲體活性下降有關，具體的殺蟲機理有待后續進一步探究。

本研究結果表明，短穩桿菌對草地貪夜蛾低齡幼蟲的生物防治潛力較大，可用于替代當前市場上風險較高的化學農藥，也可在玉米生產上與化學農藥交替使用。玉米田草地貪夜蛾低齡幼蟲多聚集在葉片上，3齡以后的幼蟲分散且進入暴食階段（吳孔明，2020），因此在田間防治時一定要“打早打小”，在草地貪夜蛾低齡幼蟲盛發期使用100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑進行防治，以減少因化學農藥過量施用帶來的害蟲抗藥性、天敵減少以及環境污染等問題。

4 結論

短穩桿菌在室內和田間對草地貪夜蛾低齡幼蟲均有較強的毒殺作用，可作為防治草地貪夜蛾有效的生物農藥使用。在玉米田草地貪夜蛾低齡幼蟲盛發期，使用100億孢子/mL短穩桿菌懸浮劑進行防治時，建議使用800~1000倍液噴施。