花抗繆勒氏管激素基因克隆、抗體制備及其對外源雌激素的響應

張李敏，郭琦，王向斌，黃茜，李學軍，周傳江，趙道全，張建新，劉慧芬*

（1河南師范大學水產學院/河南省水產動物養殖工程技術研究中心，河南新鄉 453007；2河南省黃河流域伊洛河水生生物野外科學觀測研究站，河南鄭州 450000）

0 引言

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表1 引物序列信息Table 1 Primers sequence

1.2 花?Amh基因cDNA克隆及序列分析

1.3 花?Amh基因原核表達及多克隆抗體制備

1.4 重組蛋白AMH免疫熒光定位

1.5 雌二醇處理對花?Amh基因表達的影響

雌激素處理參考Jiang等（2017）的方法，按照0（對照）、100和200 μg/g梯度劑量稱取雌二醇，溶于95%乙醇中，然后均勻噴灑在飼料上。將處理后的飼料置于40℃烘箱中烘干，對照組飼料用95%乙醇噴灑進行同樣處理。選取3月齡幼魚，挑選480尾規格一致的健康個體隨機分成3組，按照設計的試驗組分別于每天8：00、12：00和17：00投喂飼料，60 d后分離不同劑量的處理組和對照組卵巢樣品，置于-80℃保存，用于Amh基因表達分析。

1.6 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

采用TRIzol提取卵巢組織RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用NanoDrop 2000檢測RNA濃度和純度。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將質量合格的RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。以GAPDH和β-actin為內參基因，通過實時熒光定量PCR檢測Amh基因的表達情況，反應體系10.0 μL：TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，無菌水2.0 μL。擴增程序：95℃30 s，95℃5 s，60℃20 s，進行40個循環。每個樣品設3個重復，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.7 數據分析

采用SPSS 22.0進行統計分析，以單因素方差分析（ANOVA）和Duncan's多重比較分別檢驗不同組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Amh基因序列分析結果

基于轉錄組數據，通過PCR擴增獲得Amh基因，其cDNA序列全長1849 bp，ORF為1671 bp，編碼556個氨基酸殘基，5'端非編碼區（5'-UTR）28 bp，3'端非編碼區（3'-UTR）150 bp。ORF編碼的AMH蛋白分子式為C2688H4306N768O845S23，理論分子量為61.60 kD，理論等電點（pI）為5.81，脂肪系數為85.38，親水性系數為-0.385，說明該蛋白為穩定的親水性蛋白。生物信息學軟件分析結果顯示，AMH蛋白具有典型的TGF-β和AMH-N端結構域，為非跨膜蛋白，第1~21位氨基酸為信號肽，且在第21~22個氨基酸間存在信號肽剪切位點，第455~461個氨基酸（RTQRAAR）為纖溶酶蛋白酶裂解位點（圖1）；AMH蛋白定位于細胞膜的概率較高。運用MEGA 7.0基于不同物種AMH基因同源比對結果構建系統發育進化樹，結果發現不同物種AMH基因分為兩支，哺乳動物與硬骨魚各聚為一支，其中，花與同屬于鯉科魚類的斑馬魚、黃河鯉、銀鯽、四川裂腹魚等聚為一小支，與鲆科和合鰓魚科等親緣關系較遠，與花的生物學地位相一致（圖2）。

圖1 花?Amh基因cDNA序列及其推導氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of H.maculatus Amh gene

圖2 基于不同物種AMH蛋白氨基酸序列構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of AMH protein amino acid sequence in different species

2.2 AMH重組蛋白的原核表達及純化結果

將獲得的Amh基因序列與pET-32a載體連接構建重組表達載體pET32a-Amh，并轉化BL21感受態細胞。隨后采用1.0 mmol/L IPTG進行誘導，結果發現，在28.5 kD左右出現目的條帶，而陰性對照和空白對照在同一區域未出現特異條帶，表明重組表達載體pET32a-Amh構建成功。誘導后菌體經超聲破碎、離心、SDS-PAGE電泳分析表明重組蛋白主要存在于上清液中。利用親和純化的方法對AMH重組蛋白進行純化，結果顯示，50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時開始檢測到目的蛋白；200和500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時，檢測到大量的目的蛋白，但200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫時，獲得高濃度和高純度的目的蛋白（圖3）。

圖3 AMH重組蛋白的表達純化結果Fig.3 Expression and purification ofAMH recombinant protein

2.3 多克隆抗體效價檢測及特異性分析結果

小鼠經過4次免疫后進行采血，收集血清。使用ELISA對獲得的AMH多克隆抗體進行效價測定，結果顯示多克隆抗體的效價為2.4×106（表2）。Western blotting檢測結果顯示在28.5 kD附近可見清晰的條帶，其大小與AMH原核表達結果相一致，表明制備的AMH多克隆抗體可有效識別AMH抗原（圖4）。

圖4 Western blotting檢測AMH重組蛋白的特異性Fig.4 The specificity of AMH recombinant protein was detected by Western blotting

表2 AMH多克隆抗體效價檢測結果Table 2 AMH polyclonal antibody potency assay

2.4 花?AMH蛋白細胞定位

圖5 AMH在花?卵巢中的定位結果（標尺=20 μm）Fig.5 Localization of AMH in H.maculatus ovary（scale bar=20 μm）

2.5 雌二醇對花?卵巢組織學影響

組織學分析結果（圖6）顯示，雌二醇處理20 d后，對照組卵母細胞核明顯，嗜堿性強；低濃度處理組（100 μg/g）中的初級卵母細胞數量增多，可觀察到細胞核及核仁；高濃度處理組（200 μg/g）中的卵母細胞體積明顯大于其他試驗組，核質比降低。雌二醇處理40 d后，對照組的卵母細胞進入小生長期，細胞體積增大，核仁數量增多；低濃度處理組的卵母細胞呈圓形，胞核體積增大，核仁大小不一；高濃度處理組的卵母細胞體積不斷增加，但仍可觀察到卵原細胞。根據時間的推移，飼喂60 d后，卵母細胞發育至Ⅱ期中期，核質比上升，胞核嗜堿性減弱，低濃度處理組的卵母細胞增長速度加快，已完成卵原細胞增殖期，且卵膜內緣皮質層不斷擴散，形成強嗜堿性絲狀物質；高濃度處理組中的卵母細胞較低濃度處理組發育緩慢，仍含有一期的卵原細胞（圖6）。

圖6 雌二酵處理下花?卵巢組織學觀察Fig.6 Histology observation of H.maculatus ovary after estradiol treatment

2.6 雌二醇處理對花?卵巢Amh基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測雌二醇處理對花?卵巢Amh基因表達的影響，結果發現Amh基因在低濃度處理組（100 μg/g）和高濃度處理組（200 μg/g）均呈下降趨勢（圖7），其中，低濃度處理組Amh基因表達相對表達量最低，抑制作用顯著（P＜0.05），說明雌激素在卵巢發育中對Amh基因表達具有抑制作用。

圖7 雌二醇對花?卵巢Amh基因表達的影響Fig.7 Effects of estradiol on the expression of Amh gene in H.maculatus ovary

3 討論

AMH是動物性腺發育過程中的一個關鍵因子。在哺乳動物中，較多的研究已證實，Amh基因在卵巢中發揮作用，但目前Amh基因在魚類卵巢發育過程中的基礎生物學研究相對較少。本研究克隆得到花Amh基因cDNA全長序列1849 bp，共編碼556個氨基酸殘基，該蛋白含有TGF-β結構域，屬于典型的TGF-β家族成員。Pfennig等（2015）比較了不同物種Amh基因序列，結果發現不同物種的Amh基因編碼蛋白普遍含有1個N端序列以及緊鄰TGF-β結構域上游的纖溶酶蛋白酶裂解位點（R-X-X-R），該位點為蛋白酶的識別位點，是AMH配體加工所必需的。除日本比目魚（Paralichthys olivaceus）（Yoshinaga et al.，2004）外，大多數魚類中Amh基因編碼的蛋白酶識別位點為雙基序（R-X-X-R-X-X-R）。花AMH蛋白中纖溶酶蛋白酶裂解位點（RTQRAAR）也為雙基序，說明其配體加工過程與哺乳動物類似。氨基酸同源比對分析結果顯示，不同脊椎動物AMH蛋白的氨基酸序列整體相似性較低，且系統發育進化結果顯示，花與斑馬魚、鯉魚等鯉科魚類單獨聚為一支，這與花的生物學分類地位相符合，證明克隆得到的序列為花Amh基因。

從哺乳動物的研究發現，雄性睪丸支持細胞在妊娠第7周就開始分泌AMH，雌性動物在性別分化時不產生AMH，妊娠36周后才能檢測到AMH（Zeng et al.，2015）。研究發現，Amh基因在原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中高表達，優勢卵泡選擇后表達量逐漸下降，在閉鎖卵泡中幾乎檢測不到Amh基因表達（Renato，2018）。魚類Amh基因的研究主要集中在雄性性別分化，常被用作雄性魚類的性別標記，但在雌性性腺中也表達。研究發現，在成熟斑馬魚中檢測到Amh基因在卵母細胞和濾泡層中高表達（Hofsten et al.，2005）。大西洋鱈的Amh基因在卵巢發育早期表達，而在后期信號消失（Johnsen et al.，2013）。黑鯛的Amh基因在卵巢發育早期不表達，在卵黃蛋白原合成期表達量升高（Wu et al.，2010）。本研究克隆獲得花Amh基因的ORF，并成功構建到原核表達載體pET-32a上，經IPTG誘導獲得重組蛋白分子量約為28.5 kD，以可溶性狀態表達，純化后免疫小鼠，獲得多克隆抗體，其能識別重組蛋白。此外，本研究應用多克隆抗體進行免疫熒光試驗，結果顯示AMH蛋白主要表達于顆粒細胞，與在羅非魚（Ijiri et al.，2008）、斑馬魚（Kaviani et al.，2013）中發現的細胞定位結果類似，推測Amh對花卵細胞發育具有重要作用。

雌激素在調節卵巢發育和卵子發生中行使重要功能。劉濤（2012）研究發現，外源17-β雌二醇處理促進中華鱘卵母細胞生長和發育。呂德亮等（2017）研究發現，注射雌二醇可顯著提高海膽的性腺指數，促進其性腺發育。類似的現象在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（沈蓓杰等，2010）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（Liu et al.，2018）中 也有報道。在本研究中，以100 μg/g雌二醇長期喂養花，同樣發現其卵母細胞發育進程高于對照組（0 μg/g）。外源性激素處理除了對動物的性腺發育有影響，對調控通路中的基因表達也有一定的作用。本研究還發現，在雌性花中雌二醇抑制了Amh基因表達。吳燕鐸等（2022）在探究性類固醇激素對斑鱧雌性相關基因Foxl2表達的影響中發現，外源激素濃度過高會抑制內源性激素的分泌，從而抑制雌性相關基因的表達。由此推測長期喂養雌二醇會造成雌性花體內雌激素過高，通過負反饋機制抑制Amh基因表達。因此，深入研究花雌激素與Amh基因表達之間存在的關聯機制，將有助于理解魚類卵巢發育的分子機理。

4 結論

Amh基因含有TGF-β家族典型的結構域，在卵巢顆粒細胞表達，且響應雌激素的調控，可能在花卵巢發育中發揮調控作用。