八角茴香水提物調控宿主免疫反應抗石斑魚虹彩病毒的機制研究

李夢夢，韋紅玲，劉明珠，3，黃帥帥，4，王太霞，黃琳*，李鵬飛，3*

（1河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007；2廣西科學院/廣西水產生物技術與現代生態養殖重點實驗室/廣西漁業重大疫病防控與高效健康養殖產業技術工程研究中心，南寧 530007；3廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007；4北部灣大學海洋學院/廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西欽州 535011）

0 引言

【研究意義】我國水域資源豐富，為漁業經濟快速發展奠定了基礎。2020年我國海洋漁業經濟生產總值超過6.75千億元（農業農村部漁業漁政管理局等，2021）。據統計，全球70多億人口的動物蛋白攝入來源中15%以上是來自水產品。與畜禽動物相比，水產動物肉質更鮮嫩，且脂肪含量少，更有利于人體健康。石斑魚作為我國與東南亞地區的大宗名貴海水養殖魚類，其肉質細膩、蛋白含量高、脂肪含量低，具有極高的經濟價值（肖賀賀等，2021）。2020年我國石斑魚養殖產量已超過19萬t，但隨著養殖規模的擴大，水體養殖環境污染嚴重，導致病毒性疾病暴發率不斷上升，嚴重制約著石斑魚養殖產業的可持續發展（農業農村部漁業漁政管理局等，2021）。石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是一種高致病性魚類傳染性病毒，是危害石斑魚養殖產業的主要病原之一（余慶等，2020）。SGIV在不同種類魚群間傳播迅速且致死率極高（余慶等，2019），對魚類造血器官和組織的破壞極其嚴重，可使感染的魚體出現貧血及多器官衰竭癥狀而死亡。因此，研發出有效抑制SGIV感染的藥物對促進石斑魚養殖產業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】目前，抗生素等化學藥物仍大量用于防治水產細菌性病害，但大量使用抗生素不僅極易造成藥物殘留及耐藥性等問題，還會影響魚體的免疫機能（耿毅和汪開毓，2004）。因此，迫切需要研發出綠色、健康、高效且環境友好的漁用藥物。藥物防治仍是控制水產疫病最主要、有效的手段（李鵬飛等，2018），已有研究證實藥用植物提取物對水生病毒具有顯著的抗病毒效果，且安全無害，對環境友好（李鵬飛等，2021a）。紫花地?。╒iola yedoensisMakino）為雙子葉植物綱堇菜屬多年生草本藥用植物，其花色一般呈紫堇色或淡紫色，主產于我國廣西、貴州及云南等地。紫花地丁不僅具有食用價值和觀賞價值，還具有抗病毒、抗菌及抗氧化等藥用價值（崔雪等，2020）。已有研究證實，紫花地丁水提物可通過干擾SGIV對宿主細胞的吸附、侵入與復制過程，而發揮抗SGIV感染的功效（Yu et al.，2019）。桑葉（Morus alba）為桑科桑屬植物，其葉片一般呈卵形、寬卵形、心形等，在我國南北地區均有種植，具有抗病毒、抗菌等多種生物活性（張倩和張立華，2020）。李鵬飛等（2021b）研究表明，桑葉水提物及桑葉主要活性成分異槲皮苷能有效抑制SGIV感染，其抑制率高達99%。莪術［Curcuma zedoaria（Christm.）Rosc］為芭蕉目姜科姜黃屬植物，在我國臺灣、福建、江西、廣東、廣西、四川及云南等地均有分布，含有莪術醇、莪術二醇和姜黃素等多種天然活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒及抗菌等藥理作用（黃云峰等，2020），其有效活性成姜黃素在細胞水平及活體水平均具有良好的抗SGIV感染效果（Liu et al.，2020a）。八角茴香（Illicium verumHook.f.）為木蘭科八角屬的天然藥用植物，主產于我國廣西西部和南部地區，其果實為由八枚骨突果集成的聚合果，果皮肥厚，單瓣果實前端鈍或鈍尖（陳瑞生等，2011）；八角茴香含有黃酮類、多糖類、萜類等天然化合物，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、鎮痛及免疫調節等藥理作用（黃麗貞等，2015；Yu et al.，2018；吳玲等，2019；Hu et al.，2021）。八角茴香也是開發成天然抗氧化劑的重要資源（趙二勞等，2019）。謝冬惠（2012）、趙二勞等（2019）研究發現，八角茴香提取物具有抗氧化活性，是一種理想的天然抗氧化劑；Peng等（2016）研究表明，八角茴香提取物可激活獲得性免疫反應；Yu等（2018）、Liu等（2020b）研究證實，八角茴香主要成分——槲皮素具有抗SGIV活性?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關八角茴香藥理作用及其抗病毒活性的研究已有較多報道（Cai et al.，2013；黃麗貞等，2015；Khan et al.，2018；Yu et al.，2018；Hu et al.，2021），但鮮見從免疫應答角度探究八角茴香抗SGIV感染的作用機制?！緮M解決的關鍵問題】從免疫應答角度探析八角茴香水提物（IVE）調控宿主免疫反應而發揮抗SGIV的作用機制，以期為八角茴香應用于石斑魚健康養殖產業及開發綠色、健康、高效漁用藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥材八角茴香購自廣西南寧一心大藥房；石斑魚脾臟細胞系（Grouper spleen cell line，GS）由廣西漁業重大疫病防控與高效健康養殖產業技術工程研究中心保存提供；SGIV分離自廣西人工養殖的珍珠龍膽石斑魚（肖賀賀等，2019）。

1.2 IVE制備

將八角茴香粉碎成粉末，稱取25 g浸泡于500 mL超純水中，4℃浸泡過夜，次日將八角茴香浸泡液及藥包置于鍋中煎煮至100 mL，定容得到250 mg/mL的八角茴香水提物母液。經12000 r/min離心10 min，0.22 μm濾膜過濾即得到IVE，-20℃保存備用。

1.3 細胞安全濃度確定

將1×105個GS細胞接種于96孔板中，置于28℃培養箱中培養18 h。以無任何處理的GS細胞為對照組，加入不同濃度IVE為試驗組，每組均設3個平行。分別在用藥后24和48 h通過光學顯微鏡觀察各組細胞的形態變化，并于48 h后棄細胞培養上清液，以磷酸緩沖液（PBS）清洗細胞，向各孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液。室溫避光孵育4 h后，采用酶標儀檢測各組細胞在波長450 nm處的吸光值，計算細胞存活率。存活率計算公式如下：

式中，C為細胞存活率（%），C1為試驗組細胞吸光值，C0為對照組細胞吸光值。

1.4 IVE預處理GS細胞激活細胞免疫反應

將8×105個GS細胞接種于12孔板中，28℃培養箱培養18 h。將IVE在培養基中稀釋至安全濃度后接入GS細胞中，以無任何處理的GS細胞為對照組，在28℃培養箱中繼續培養，分別在用藥后2和4 h收集細胞，提取總RNA。200 ng總RNA經反轉錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板、β-actin為內參基因，采用實時熒光定量PCR檢測干擾素基因（IFN）、蛋白激酶基因（IKKα）、干擾素調節因子IRF3、轉錄激活因子（STAT1），以及干擾素刺激因子STING、PKR和ISG15的表達水平。實時熒光定量PCR擴增引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物序列信息Table 1 Information of sequence of real-time fluorescence quantitative PCR amplification primers

1.5 光學顯微鏡觀察IVE抗SGIV效果

將8×105個GS細胞接種至12孔板中，28℃培養18 h。設2個對照組，對照組1：GS細胞不進行任何處理；對照組2：將L15培養基接入GS細胞孵育2 h后移除培養液，接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，然后移除培養液，以L15培養基清洗細胞2次并加入新的L15培養基。試驗組GS細胞進行如下處理：以L15培養基將IVE稀釋至安全濃度，接入細胞后28℃培養2 h，移除培養液，以L15培養基清洗2次，接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，移除培養液并以L15培養基清洗2次，再加入L15培養基。各組細胞在28℃下繼續培養，分別于病毒感染后24和48 h采用光學顯微鏡觀察各組細胞形態變化。

1.6 實時熒光定量PCR檢測IVE抗SGIV活性

將8×105個GS細胞接種至12孔板中，28℃培養18 h。試驗組細胞中加入以培養基稀釋至安全濃度的IVE孵育2 h（對照組加入等體積的L15培養基），以L15培養基清洗細胞2次并接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，移除培養基，以L15培養基清洗2次，再加入L15培養基。各組細胞在28℃下繼續培養，分別于病毒感染后24和48 h收集細胞，提取總RNA，200 ng RNA經反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內參基因，利用實時熒光定量PCR檢測SGIV的MCP基因表達情況，檢驗IVE抗SGIV活性。每組樣品均設3個平行。

1.7 IVE體外激活宿主細胞抗病毒免疫反應

采用實時熒光定量PCR檢測IVE體外激活宿主細胞抗病毒免疫反應，具體操作方法同1.6。分別在病毒感染后24和48 h收集各組細胞，提取總RNA，200 ng總RNA經反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內參基因，利用實時熒光定量PCR檢測干擾素相關基因IFN、STING、PKR、IKKα、ISG15、IRF3及STAT1的表達情況。每組樣品均設3個平行。

1.8 活體水平檢測IVE抗SGIV活性情況

經預試驗得出IVE腹腔注射石斑魚的安全工作濃度為4 mg/尾。選取30尾體長、體質量相近的石斑魚，隨機分為3組分別暫養于3個30 L的水缸內。對照組石斑魚腹腔注射50 μL SGIV（106TCID50/mL），試驗組石斑魚腹腔同時混合注射4 mg/尾的IVE和50 μL SGIV。SGIV感染后24和48 h，分別采集石斑魚脾臟組織提取總RNA，200 ng總RNA經反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內參基因，利用實時熒光定量PCR檢測MCP基因相對表達量，分析IVE在活體水平的抗SGIV活性。每組樣品均設3個平行。

1.9 統計分析

驗數據使用Excel 2020對進行處理，采用SPSS 22.0的單因素方差分析比較組間差異，并以Graph-Pad Prism 7制圖。

2 結果與分析

2.1 IVE細胞安全工作濃度

不同濃度IVE與GS細胞孵育48 h后，觀察細胞形態變化。由圖1-A可看出，與無任何處理的GS細胞相比，當IVE濃度≤0.50 mg/mL時，GS細胞正常生長，細胞形態正常；當IVE濃度≥1.25 mg/mL時，GS細胞出現不同程度的脫落、皺縮、變圓等細胞病變效應（Cytopathic effects，CPEs）。CCK-8檢測結果（圖1-B）與光學顯微鏡觀察結果一致，因此確定IVE細胞水平的安全工作濃度≤0.50 mg/mL。

圖1 不同濃度IVE對GS細胞的影響Fig.1 Effects of different concentrations of IVE on GS cells

2.2 IVE預處理激活宿主細胞免疫反應

IFN是一種具有免疫調節、抗病毒功能的細胞因子，在宿主抗病毒感染的先天性免疫中發揮重要作用（劉穎等，2012；張輝等，2014）。因此，在確定IVE細胞安全工作濃度后，進一步研究其對干擾素相關免疫基因表達的影響。實時熒光定量PCR檢測結果（圖2）顯示，與對照組GS細胞相比，IVE孵育2 h后可顯著（P＜0.05，下同）或極顯著（P＜0.01，下同）上調干擾素相關基因IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3及STING的表達，僅ISG15基因的表達無顯著變化（P＞0.05，下同）；IVE孵育4 h后STING、STAT1和IRF3基因的相對表達量呈下調趨勢，但仍極顯著高于對照組，IFN、ISG15和PKR基因的相對表達量與對照組間無顯著差異。由于IVE孵育2 h的干擾素相關基因表達量較高，故選擇藥物孵育2 h進行病毒感染試驗。

圖2 IVE對GS細胞干擾素相關基因表達的影響Fig.2 Effects of IVE on expression of IFN-related genes of GS cells

2.3 IVE體外抗SGIV活性分析結果

光學顯微鏡觀察結果（圖3-A）顯示，與僅接種SGIV的對照組GS細胞相比，經IVE預處理再加入SGIV感染的試驗組細胞病變效應明顯減少。實時熒光定量PCR檢測結果（圖3-B）表明，與僅接種SGIV的對照組GS細胞相比，試驗組GS細胞中SGIV的MCP基因相對表達量極顯著降低，故推測IVE通過抑制MCP基因表達而實現抗SGIV感染的效果。

圖3 IVE細胞水平抗SGIV感染的效果Fig.3 SGIV infection effects of IVE level of cells

2.4 IVE激活宿主細胞抗病毒免疫反應

為探究IVE在病毒感染時是否影響細胞免疫因子表達，采用實時熒光定量PCR檢測IVE體外激活宿主細胞抗病毒免疫反應，結果如圖4所示。與僅孵育SGIV的GS細胞相比，試驗組GS細胞中干擾素相關基因IFN、STAT1和IRF3在病毒感染后24 h極顯著上調，但至病毒感染后48 h無顯著差異；PKR、IKKα、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h均呈顯著或極顯著上調趨勢。說明IVE可增強SGIV感染GS細胞中干擾素相關基因的表達。

圖4 IVE調控宿主細胞抗SGIV的免疫反應Fig.4 Immune response of IVE to regulate cells of host against SGIV

2.5 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV效果分析

2.5.1 石斑魚活體用藥安全濃度確定石斑魚腹腔注射不同劑量IVE后觀察魚體1周內的死亡情況，結果（圖5）發現，腹腔注射10 mg/尾IVE的石斑魚存活率為40%，注釋8 mg/尾的存活率為60%，注釋6 mg/尾的存活率為70%，注射劑量≤4 mg/尾的石斑魚進食正常且無死亡，因此確定石斑魚活體的IVE用藥安全濃度≤4 mg/尾。

圖5 IVE注射劑量對石斑魚存活率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of IVE on grouper vability rate

2.5.2 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV活性.如圖6所示，與對照組僅注射SGIV的石斑魚相比，試驗組石斑魚脾臟組織中的MCP基因相對表達量在病毒感染后24和48 h均極顯著降低，說明IVE在活體水平也能有效抑制SGIV感染。

圖6 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV活性Fig.6 Anti-SGIV activity of IVE against grouper in vivo

3 討論

SGIV是危害石斑魚養殖產業的主要病原之一，致死率極高，因此亟待研發出能有效抑制SGIV感染的藥物。與抗生素等化學藥物相比，藥用植物具有諸多優點，包括活性化合物成分多、綠色無藥殘及成本低等（季本安等，2017）。已有研究證實，一些藥用植物具有抗菌、抗病毒功能活性。如黃連水提物具有一定的抑菌功效，具備研發成高效抗水產病害中藥制劑的潛力（劉明珠等，2019）。桑葉有效成分——異槲皮苷可通過破壞SGIV粒子結構，干擾病毒粒子對宿主細胞的吸附、侵入及復制過程而發揮抗SGIV感染作用（李鵬飛等，2021b）。八角茴香富含槲皮苷、β-谷甾醇等多種活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗病毒及免疫調節等多種藥理作用，藥效顯著、用途廣泛。姚莉韻和王麗平（1999）研究發現，八角茴香水溶性成分Ⅱ槲皮素-3-O-β-呋喃葡萄糖甙對單純皰疹病毒1型（HSV-1）有明顯的抑制作用；Liu等（2020b）研究證實，八角茴香主要活性成分具有抑制SGIV感染的效果，其中槲皮素可通過干擾SGIV與宿主靶細胞結合而影響SGIV侵入宿主細胞。至今，鮮見從細胞免疫應答角度闡述IVE抗SGIV感染的研究報道，為此本研究探究IVE對宿主細胞免疫應答的影響，旨在闡明其抗病毒機制。

固有免疫是機體在系統發育和進化過程中形成的天然免疫防御功能，是機體抵御病原微生物感染的第一道屏障（Boraschi et al.，2017）。宿主可通過免疫細胞模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），包括病毒雙鏈DNA（dsDNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、單鏈RNA（ssRNA）等病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），啟動特異性級聯信號轉導，然后誘導I型IFN表達，產生非特異性免疫反應以抵抗病原感染（Akira et al.，2006）。近年來，諸多研究表明STING基因在先天免疫中發揮重要作用（Ishikawa and Barber，2008；Liu et al.，2015），作為細胞質DNA傳感器，STING可通過激活胞質激酶IκB kinase（IKK）及轉錄因子κB（NF-κB），而誘導IFN產生（Ran et al.，2014；Chow et al.，2015）。IFN與細胞表面受體結合，通過激活JAK-STAT信號轉導調控具有抗病毒活性的干擾素刺激基因（Interferon stimulated genes，ISGs），包括ISG15、PKR、ISG56基因的表達而發揮抗病毒作用（Schneider et al.，2014；Xin et al.，2020）。此外，有研究報道藥物可通過調控IFN表達而達到抗病毒效果。如甘草素可通過調控I型IFN信號通路而發揮抗新冠肺炎作用（Zhu et al.，2020）；α-硫辛酸可促進IRF3、IRF7、Viperin、ISG15、IFN1和PKR基因表達而抑制病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）感染（Zhang et al.，2021）；香豆素衍生物7-［（4-aminophenyl）diazenyl］-4-methyl-coumarin（AMC）可通過上調IFN1、MxI、EF1和MDA5基因表達，抑制傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）在感染過程中的復制（Hu et al.，2021）。本研究結果與前人的研究結果相似，IVE處理GS細胞可有效上調IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3和STING等干擾素相關基因表達，故推測IVE可通過激活GS細胞中的干擾素相關基因表達，誘導宿主細胞建立抗病毒狀態而間接發揮抗病毒功能。

近年來，IFN在魚體免疫中的重要作用已受到廣泛關注。Purcell等（2012）研究發現IFN系統的預激活可顯著抑制魚彈狀病毒復制；劉鐳（2018）研究表明香豆素可通過促進HO-1表達，觸發IFN產生從而發揮抗鯉春病毒血癥病毒作用；Zhang等（2021）研究發現，α-硫辛酸可通過抑制VHSV依賴的氧化應激反應和上調抗病毒基因Viperin和ISG15，進而發揮抗VHSV感染的作用。STING基因能通過識別DNA分子，而啟動免疫反應產生I型IFN，在抗病毒感染過程中發揮極為重要的作用（歐陽婷等，2018）。本研究發現，經IVE預處理后可有效抑制SGIV感染GS細胞，且能影響IFN、ISG15、STING、PKR、STAT1和IRF3等干擾素相關基因的表達；石斑魚活體抗病毒試驗進一步證實IVE在石斑魚活體內具有抑制SGIV感染的效果。SGIV是一個正二十面體的雙鏈DNA病毒，STING基因在天然免疫中能識別病毒DNA及藥用植物可調控干擾素信號通路（秦啟偉和黃曉紅，2019）。因此，推測IVE是通過誘導細胞內STING基因表達，增強其對SGIV的識別，同時進一步誘導干擾素相關基因表達，激活宿主細胞建立抗病毒狀態（圖7）而發揮抗病毒功能。

圖7 IVE抗SGIV感染的作用機制示意圖Fig.7 Schematic diagram of anti-SGIV mechanism of IVE

4 結論

IVE具有抑制SGIV感染的生物功能，其作用機制可能是通過誘導干擾素相關基因表達而激活宿主的抗病毒狀態，從而發揮間接抗SGIV效果；也說明八角茴香在水產疫病防控中具有研發成漁用抗病功能制劑的潛力。