基于eDNA宏條形碼技術(shù)的喀斯特高原人工湖泊魚類多樣性分析

許龍飛，姚鄧雕，楊原偉，郭星辰，李君軼，姜海波，安苗，董響紅，邵儉*

（1貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430223）

0 引言

【研究意義】我國以云貴高原為中心的西南地區(qū)喀斯特地貌豐富，是世界三大喀斯特集中分布區(qū)域之一，其中貴州境內(nèi)61.9%的國土面積為喀斯特地貌（李秋華等，2013；阮玉龍等，2013）。西南喀斯特地區(qū)是我國珍稀物種、瀕危物種、特有物種分布最集中、種類最豐富的地區(qū)之一（王波等，2018）；但喀斯特生態(tài)系統(tǒng)也是典型的脆弱生態(tài)系統(tǒng)，土層淺薄，土壤承載力差，生態(tài)地質(zhì)環(huán)境脆弱（賀忠權(quán)等，2021）。近年來，人工筑壩導(dǎo)致的河道破碎、工農(nóng)業(yè)污染引起的水體富營養(yǎng)化及不合理引種造成的外來物種生物入侵等，致使我國喀斯特地區(qū)土著魚類種群受到不同程度的脅迫。因此，亟待摸清喀斯特高原魚類群落現(xiàn)狀，為保護(hù)西南喀斯特地區(qū)魚類多樣性提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】紅楓湖和阿哈湖是典型的喀斯特高原人工湖泊。紅楓湖位于貴州省清鎮(zhèn)市，是貓?zhí)犹菁?jí)水電站攔河而成的人工湖泊，屬長江流域?yàn)踅担ㄔA獻(xiàn)等，2020）；阿哈湖位于貴州省貴陽市西南郊8 km，流域面積180.3 km2，總庫容0.87億m3，同屬長江流域?yàn)踅担S軼婧等，2020）。至今，有關(guān)紅楓湖和阿哈湖的研究多圍繞水質(zhì)評(píng)價(jià)（郭云等，2015；韓翠紅等，2020；金祖雪等，2020；費(fèi)志軍等，2021），涉及魚類資源調(diào)查的研究較少，對(duì)于二者的魚類種群現(xiàn)狀尚不清楚。紅楓湖和阿哈湖作為長江上游重要的生態(tài)屏障，研究其魚類多樣性是維持當(dāng)?shù)厮鷳B(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵，對(duì)于維持和補(bǔ)充長江魚類資源同樣具有重要意義（de Paula Gutiérrez and Agudelo，2020；Wang et al.，2021）。環(huán)境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指生物散落在環(huán)境中的DNA片段，通常來源于生物的皮膚碎屑、配子、黏液及糞便等（Bohmann et al.，2014）。Ogram等（1987）利用eDNA研究土壤沉積物中的微生物，并首次提出eDNA的概念。eDNA宏條形碼技術(shù)是利用環(huán)境中的DNA結(jié)合高通量測序技術(shù)完成對(duì)環(huán)境樣本總DNA測序，通過生物信息學(xué)分析，以及與公開物種序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，最終得到環(huán)境樣本中物種組成的技術(shù)（Shu et al.，2020；楊海樂等，2021）。目前，eDNA宏條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于監(jiān)測魚類空間結(jié)構(gòu)（Zhang et al.，2020）、魚類物種組成與種群豐度（王夢等，2022）及魚類生物入侵現(xiàn)狀（Zhang et al.，2022）等領(lǐng)域。eDNA宏條形碼技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：（1）不受科研人員的主觀判斷影響；（2）避免了長期的魚類樣本采集，極大提高了物種監(jiān)測效率；（3）eDNA宏條形碼技術(shù)不入侵環(huán)境，對(duì)監(jiān)測物種及其棲息地幾乎不產(chǎn)生影響（Antognazza et al.，2019；Aglieri et al.，2021）。【本研究切入點(diǎn)】隨著國際動(dòng)物保護(hù)公約、動(dòng)物福利及生態(tài)生物多樣性保護(hù)等法規(guī)措施的執(zhí)行，eDNA宏條形碼技術(shù)無疑更符合當(dāng)下生物多樣性監(jiān)測的需求。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用eDNA宏條形碼技術(shù)探究喀斯特高原人工湖泊魚類多樣性，綜合評(píng)估紅楓湖和阿哈湖魚類群落結(jié)構(gòu)及環(huán)境因子對(duì)喀斯特高原人工湖泊魚類分布的影響，以期為喀斯特地區(qū)水域魚類多樣性評(píng)估提供新方法、新思路，也為紅楓湖和阿哈湖魚類保護(hù)管理措施的制定積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣點(diǎn)設(shè)置及樣品采集

紅楓湖和阿哈湖樣品采集時(shí)間為2021年11月25日，采樣點(diǎn)設(shè)置參考SC/T 9402—2010《淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范》，具體如下：紅楓湖分為南湖和北湖，在南、北湖湖心處、湖泊入水口、出水口設(shè)置采樣點(diǎn)，結(jié)合紅楓湖水域特點(diǎn)，環(huán)湖布置采樣點(diǎn)，南、北湖各設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，共計(jì)10個(gè)采樣點(diǎn)；在阿哈湖湖心處、湖泊入水口、出水口設(shè)置采樣點(diǎn)，結(jié)合阿哈湖水域特點(diǎn)，環(huán)湖布置采樣點(diǎn)，共計(jì)7個(gè)采樣點(diǎn)（圖1）。樣品采集全部在船上完成，使用采水器分水體上（1 m）、中（5 m）、下層（10 m）采樣混合后，每個(gè)采樣點(diǎn)留取2 L水樣低溫避光保存，送回實(shí)驗(yàn)室立即抽濾，實(shí)驗(yàn)人員操作時(shí)每個(gè)采樣點(diǎn)更換1次手套。采樣過程記錄采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度，使用黑白盤測定水體透明度（Transparency，Tra），并以YSI便攜式水質(zhì)儀測定水溫（Water temperature，WT）、總?cè)芙夤腆w（Total dissolved solids，TDS）、鹽度（Salinity，Sal）、pH、溶解氧（Dissolved oxygen，DO）、離子氨（Ionic ammonia，NH4+）等環(huán)境因子（表1）。

表1 eDNA樣品采集點(diǎn)地理位置及其環(huán)境因子Table 1 Geographic locations and environmental factors of eDNA sampling sites

圖1 紅楓湖和阿哈湖采樣點(diǎn)設(shè)置分布情況Fig.1 Sampling site distribution of Hongfeng Lake and Aha Lake

1.2 eDNA提取及擴(kuò)增

使用隔膜真空泵和砂芯玻璃過濾裝置抽濾水樣，選用0.45 μm孔徑的玻璃纖維濾膜。抽濾時(shí)操作環(huán)境充分通風(fēng)，每過濾1份樣品均用1%次氯酸溶液處理實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面及過濾裝置，實(shí)驗(yàn)人員更換1次手套。設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，使用同樣濾膜抽濾2 L的ddH2O檢測有無環(huán)境污染。抽濾完成后將濾膜置于1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肙MEGA公司的Water DNA Kit D5525試劑盒提取水體eDNA，選用Tele 02硬骨魚類通用引物（Tele 02-F：5'-AAA CTCGTGCCAGCCACC-3'；Tele 02-R：5'-GGGTATC TAATCCCAGT TTG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Taberlet et al.，2018）。對(duì)提取的eDNA進(jìn)行凝膠電泳檢測，質(zhì)檢合格的樣本上機(jī)測序，測序平臺(tái)為Illumina NovaSeq 6000。

1.3 測序及生物信息學(xué)分析

設(shè)10 bp的窗口，若窗口內(nèi)平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的序列（Trimmomatic v0.3），根據(jù)雙端測序的overlap關(guān)系，將成對(duì)序列拼接成1條序列，最小overlap長度為10 bp，overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩除不符合序列（FLASH v1.2.7），按照標(biāo)簽和引物序列進(jìn)行拆分并調(diào)整序列方向，得到每個(gè)樣本的優(yōu)質(zhì)序列。對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按照98%相似性進(jìn)行OTU聚類（Zhang et al.，2020），在聚類過程中去除嵌合體，生成OTUs表格（perl v5.18.2，Usearch v10，qiime v1.9.1）。將生成的OTUs表格在基于NCBI網(wǎng)站nt數(shù)據(jù)庫自建的淡水魚類數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行物種基因注釋（建庫時(shí)間2021年10月），得到魚類物種信息，魚類分類依據(jù)參考Fishbase數(shù)據(jù)庫。

1.4 魚類多樣性數(shù)據(jù)處理分析

為確保鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行如下校正：（1）將低豐度序列（序列樣本平均讀數(shù)低于1）訂正為未識(shí)別；（2）將鑒定到的雜交種進(jìn)行校正，若雜交種父母本隸屬于同屬魚類A屬，則將該雜交種訂正為Asp.，否則將該雜交種序列訂正為未識(shí)別。使用Excle 2020分析含魚類物種信息注釋的OTUs表格，并繪制物種組成餅圖；基于魚類代表OTUs序列讀數(shù)，繪制屬分類水平魚類分布熱圖，為消除數(shù)據(jù)差異過大對(duì)熱圖的影響，先將序列讀數(shù)進(jìn)行均一化處理，再使用R語言繪制熱圖。同時(shí)，使用R語言進(jìn)行PerMANOVA分析，明確紅楓湖南、北湖魚類群落結(jié)構(gòu)差異性；利用R語言vegan包進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），將魚類代表OTUs序列讀數(shù)進(jìn)行Hellinger轉(zhuǎn)化，環(huán)境因子數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化以消除量綱影響，RDA分析前需對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行共線性分析，剔除方差膨脹因子過大的環(huán)境因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量檢測結(jié)果

紅楓湖10個(gè)eDNA樣本和阿哈湖7個(gè)eDNA樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量檢測目的條帶大小正確，均滿足測序條件，而空白對(duì)照組無任何條帶，說明試驗(yàn)過程中無污染。

2.2 高通量測序結(jié)果

紅楓湖10個(gè)eDNA樣本的物種累積曲線如圖2-A所示，隨著測序深度的增加，觀測到的OTUs數(shù)量趨于穩(wěn)定，說明eDNA樣本數(shù)量足以代表紅楓湖魚類多樣性。阿哈湖7個(gè)eDNA樣本的物種累積曲線如圖2-B所示，隨著樣本數(shù)量的增加，觀測到的OTUs數(shù)量趨于穩(wěn)定，也說明eDNA樣本數(shù)量足以反映阿哈湖魚類多樣性。

圖2 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）的eDNA樣本物種累積曲線Fig.2 Cumulative curve of species of eDNA samples from Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

2.3 魚類基因注釋結(jié)果

經(jīng)人工校正后，在紅楓湖鑒定出魚類32種，隸屬于5目11科27屬，有2種 魚 類 鑒 定 到 屬［鱖 屬（Siniperca）］，有11種魚類在歷史數(shù)據(jù)庫中得到匹配（表2）。其中，鯉形目（Cypriniformes）魚類18種，鲇形目（Siluriformes）魚類5種，日鱸目（Centrarchiformes）魚類5種，胡瓜魚目（Osmeriformes）魚類2種，鰕虎魚目（Gobiiformes）魚類2種（圖3-A）。在阿哈湖鑒定到魚類33種，隸屬于6目12科28屬，有3種魚類鑒定到屬（表2）。其中，鯉形目魚類18種，鲇形目魚類5種，日鱸目魚類5種，胡瓜魚目魚類2種，鰕虎魚目魚類2種，攀鱸目（Anabantiformes）魚類1種（圖3-B）。

圖3 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）的魚類物種組成結(jié)構(gòu)Fig.3 Fish species composition of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

表2 基于eDNA宏條形碼技術(shù)在紅楓湖和阿哈湖各采樣點(diǎn)的魚類檢出情況Table 2 Detection of fish from each sampling site in Hongfeng Lake and Aha Lake based on eDNA metabarcoding technology

在屬分類水平上，紅楓湖魚類在各采樣點(diǎn)的分布情況如圖4顯示。紅楓湖魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名前10的分別是鱯屬（Hemibagrus）、鯉屬（Cyprinus）、鱖屬、黃顙魚屬（Tachysurus）、鰱屬（Hypophthalmichthys）、屬（Hemiculter）、新銀魚屬（Neosalanx）、草魚屬（Ctenopharyngodon）、青魚屬（Mylopharyngodon）和特鯰屬（Tatia）。阿哈湖屬分類水平魚類在各采樣點(diǎn)的分布情況如圖5所示，阿哈湖魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名前10的分別是鰱屬、鱯屬、鱖屬、鯉屬、黃顙魚屬、屬、新銀魚屬、草魚屬、吻鰕虎魚屬（Rhinogobius）和鳑鲏屬（Rhodeus）。

圖4 基于紅楓湖各采樣點(diǎn)魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)的魚類分布熱圖Fig.4 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Hongfeng Lake

圖5 基于阿哈湖各采樣點(diǎn)魚類代表OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)的魚類分布熱圖Fig.5 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Aha Lake

2.4 紅楓湖和阿哈湖魚類多樣性

紅楓湖各采樣點(diǎn)魚類的Chao1指數(shù)顯示，在H6采樣點(diǎn)觀察到的OTUs數(shù)量最低（1205.08），在H10采樣點(diǎn)觀察到的OTUs數(shù)量最高（1434.26）；在Shannon指數(shù)方面，H7采樣點(diǎn)群落多樣性最高，H9采樣點(diǎn)群落多樣性最低；Simpson指數(shù)的變化趨勢與Shannon指數(shù)一致（表3）。在監(jiān)測到的32種魚類中，有27種魚類在所有采樣點(diǎn)均能監(jiān)測到，紅楓湖全部采樣點(diǎn)均無特有魚類，各采樣點(diǎn)檢出魚類總數(shù)差異不明顯，保持在28~30種。紅楓湖南湖監(jiān)測到32種魚類，其中2種為南湖獨(dú)有魚類；北湖監(jiān)測到30種魚類，無北湖獨(dú)有魚類（表2）。PerMANOVA分析結(jié)果顯示，紅楓湖南、北湖魚類群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（R2=0.08，P=0.562＞0.05）。

表3 紅楓湖魚類α多樣性指數(shù)Table 3 α diversity index of fish in Hongfeng Lake

阿哈湖各采樣點(diǎn)魚類的Chao1指數(shù)顯示，在A7采樣點(diǎn)觀察到的OTUs數(shù)量最低（1051.95），在A5采樣點(diǎn)觀察到的OTUs數(shù)量最高（1435.24）；在Shannon指數(shù)方面，A5采樣點(diǎn)群落多樣性最高，A3采樣點(diǎn)群落多樣性最低；Simpson指數(shù)則顯示以A6采樣點(diǎn)群落多樣性最高、A3采樣點(diǎn)群落多樣性最低（表4）。在監(jiān)測到的33種魚類，有26種魚類在所有采樣點(diǎn)中均能監(jiān)測到，阿哈湖全部采樣點(diǎn)均無獨(dú)有魚類，各采樣點(diǎn)檢出魚類總數(shù)差異不明顯，保持在28~32種（表2）。

表4 阿哈湖魚類α多樣性指數(shù)Table 4 α diversity index of fish in Aha Lake

2.5 魚類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性

對(duì)紅楓湖魚類多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析前，在共線性分析中剔除了Tra和Sal 2個(gè)環(huán)境因子，剩余5個(gè)環(huán)境因子（表5）對(duì)引起紅楓湖各采樣點(diǎn)魚類群落結(jié)構(gòu)差異的解釋度為69.38%。RDA分析結(jié)果（圖6-A）顯示，紅楓湖各采樣點(diǎn)分布較散，無聚集趨勢。在RDA1軸上，WT呈正相關(guān)，其余環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)；在RDA2軸上，pH、DO和NH4+呈正相關(guān)，其余環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。對(duì)阿哈湖魚類多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析前，在共線性分析中剔除了Sal和pH 2個(gè)環(huán)境因子，剩余5個(gè)環(huán)境因子（表5）對(duì)引起阿哈湖各采樣點(diǎn)魚類群落結(jié)構(gòu)差異的解釋度為68.74%。RDA分析結(jié)果（圖6-B）顯示，阿哈湖各采樣點(diǎn)分布較散，也無聚集趨勢，其中A3、A5采樣點(diǎn)與其余采樣點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，說明這2個(gè)采樣點(diǎn)與其余采樣點(diǎn)魚類群落相似度更低。在RDA1軸上，NH4+、DO和WT呈正相關(guān)，其余環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)；在RDA2軸上，5個(gè)環(huán)境因子均呈正相關(guān)。

圖6 紅楓湖（A）和阿哈湖（B）魚類多樣性與環(huán)境因子的RDA分析結(jié)果Fig.6 RDA results of fish diversity and environmental factors of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）

表5 RDA分析中各環(huán)境因子的決定系數(shù)及其相關(guān)性Table 5 Determination coefficients and correlation of each environmental factor in RDA

3 討論

3.1 紅楓湖和阿哈湖魚類組成

本研究在紅楓湖設(shè)10個(gè)采樣點(diǎn)，通過eDNA宏條形碼技術(shù)共監(jiān)測到32種魚類，其中有11種魚類在歷史數(shù)據(jù)庫（牟洪民等，2012）中得到驗(yàn)證。紅楓湖有21種魚類沒有在歷史數(shù)據(jù)庫中得到驗(yàn)證，主要是由于歷史數(shù)據(jù)庫為2010—2011年采集樣本，對(duì)于目前紅楓湖現(xiàn)有魚類群落組成尚不清楚，說明選取的歷史數(shù)據(jù)庫不能完全代表紅楓湖現(xiàn)階段魚類群落結(jié)構(gòu)。此外，利用公用魚類線粒體12S序列文庫進(jìn)行物種信息注釋可能會(huì)對(duì)個(gè)別親緣近的物種出現(xiàn)偏差（Lamy et al.，2021；de Santana et al.，2021）。本研究監(jiān)測到鰱（H.molitrix）、鳙（H.nobilis）（H.leucisculus）、南方馬口魚（O.uncirostris）、棒花魚（A.rivularis）、鯉（C.carpio）、草魚（C.idella）等紅楓湖歷史優(yōu)勢魚類，但1982和2010年2次紅楓湖魚類資源調(diào)查中監(jiān)測到的紅鰭鲌（Culter erythropterus）、長春鳊（Parabramis pekinensis）、三 角 魴（Magalobrama tarminalis）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、黃鱔（Monopterus albus）等魚類（牟洪民等，2012）在本研究中均未監(jiān)測到，說明這些魚類種群極度萎縮或已消失。本研究在紅楓湖監(jiān)測到鯉形目魚類18種（占56.25%），還包括日鱸目大口黑鱸（M.salmoides）、中國少鱗鱖（C.whiteheadi）、鱖（S.chuatsi）及鱖屬（Sinipercasp.）未定種魚類2種，胡瓜魚目太湖新銀魚（N.taihuensis）、中國大銀魚（P.chinensis），鲇形目斑鱯（H.guttatus）、南方鯰（S.meridionalis）等常見非紅楓湖土著經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。阿哈湖并無傳統(tǒng)的魚類資源調(diào)查數(shù)據(jù)作為歷史數(shù)據(jù)庫，本研究在阿哈湖監(jiān)測到鯉形目魚類18種（占54.55%），另有鱧屬未定種魚類1種，日鱸目大口黑鱸、中國少鱗鱖、鱖及鱖屬未定種魚類2種，胡瓜魚目太湖新銀魚、中國大銀魚，鲇形目斑鱯、南方鯰等常見經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。可見，現(xiàn)階段的紅楓湖和阿哈湖魚類組成以鯉形目魚類為主，但存在以日鱸目為主的養(yǎng)殖魚類生態(tài)入侵。

3.2 高通量測序序列讀數(shù)與魚類種群豐度的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，在OTUs（屬分類水平）序列讀數(shù)排名中，紅楓湖魚類以鱯屬排名第一、特鯰屬排名第十，阿哈湖魚類以鱯屬排名第一、黃顙魚屬排名第五、特鯰屬排名第十三。鱯屬僅監(jiān)測到斑鱯1種魚類，斑鱯隸屬于鲇形目鲿科（Bagridae），俗稱芝麻劍，是我國傳統(tǒng)的名貴養(yǎng)殖魚類，主要分布在錢塘江、九龍江和珠江等水系（劉偉，2016），而紅楓湖和阿哈湖屬于長江水系。在紅楓湖監(jiān)測到斑鱯eDNA信號(hào)可能是由于2021年更新的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》將斑鱯野生種群列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物（養(yǎng)殖群體除外），貴州多地開展斑鱯人工繁育及養(yǎng)殖所造成，但斑鱯是否成為紅楓湖和阿哈湖魚類的優(yōu)勢種尚有待進(jìn)一步考證。黃顙魚隸屬于鲇形目鲿科，在我國長江、黃河及珠江等各大水系均有分布，是常見的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類（王凌宇等，2020）。有研究表明，大壩的建成通常導(dǎo)致原有江段魚類多樣性下降，繁殖魚類群落結(jié)構(gòu)趨于單一，其中條等小型魚類等易成為優(yōu)勢種（李世健等，2011；常濤等，2021），但鮮見黃顙魚成為優(yōu)勢種的報(bào)道。特鯰屬魚類監(jiān)測到中間特鯰（T.intermedia），中間特鯰隸屬于鲇形目頸鰭鯰科（Auchenipteridae），俗名為銀河豹鯨，在南美洲廣泛分布（Pereira et al.，2017），F(xiàn)ishbase數(shù)據(jù)庫標(biāo)記我國無分布，但在公開網(wǎng)絡(luò)上可檢索到國內(nèi)已將其作為觀賞魚進(jìn)行人工繁育的記錄。故推測中間特鯰是因遺棄、放生等方式進(jìn)入我國自然水域，但其為熱帶魚類，紅楓湖和阿哈湖的環(huán)境并不利于中間特鯰發(fā)展成為優(yōu)勢種。

既往研究顯示，序列豐度讀數(shù)和生物量存在一定的相關(guān)性（Kelly et al.，2014；Evans et al.，2016）。陳世靜（2020）研究表明，在魚類組成相對(duì)簡單的水族箱中，魚類生物量與序列讀數(shù)呈正相關(guān)。在PCR擴(kuò)增過程中，通用引物對(duì)水環(huán)境中不同物種的擴(kuò)增效率也不同，是由于通用引物對(duì)個(gè)別物種存在擴(kuò)增偏好性，而導(dǎo)致個(gè)別物種序列讀數(shù)產(chǎn)生數(shù)量級(jí)差異（Elbrecht and Leese，2015；Pi?ol et al.，2015）。因此，黃顙魚屬、鱯屬、特鯰屬魚類代表OTUs序列讀數(shù)較高，也有可能是通用引物的擴(kuò)增偏好性所造成。

3.3 紅楓湖和阿哈湖魚類多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系

紅楓湖環(huán)境因子與魚類群落結(jié)構(gòu)差異的決定系數(shù)（R2）排序?yàn)镈O＞TDS=WT＞pH＞NH4+。DO（P=0.034）是引起紅楓湖各采樣點(diǎn)魚類群落結(jié)構(gòu)差異的主要環(huán)境因子。DO是影響魚類生存最重要的環(huán)境因子，當(dāng)水體DO在2.0~3.0 mg/L時(shí)會(huì)影響魚類攝食等生命活動(dòng)，而DO高于5.0 mg/L時(shí)魚類攝食生長完全正常（申玉春，2008）。本研究的采樣均在日出時(shí)間，紅楓湖各采樣點(diǎn)水體DO在6.3~10.5 mg/L，可能是由于日出時(shí)間湖中生產(chǎn)者正在進(jìn)行光合作用，因此水體DO均高于5.0 mg/L；在日落時(shí)間因光合作用停止，紅楓湖部分區(qū)域水體DO降至5.0 mg/L以下，致使DO成為紅楓湖魚類群落分布的主要制約因子。阿哈湖環(huán)境因子與魚類群落結(jié)構(gòu)差異的決定系數(shù)（R2）排序?yàn)門DS＞W(wǎng)T＞Tra＞NH4+＞DO。TDS（P=0.005）是引起阿哈湖各采樣點(diǎn)魚類群落結(jié)構(gòu)差異的主要環(huán)境因子。據(jù)李美霞（2021）的研究顯示，TDS和浮游植物群落呈顯著正相關(guān)。本研究中，阿哈湖以鰱和鳙的OTUs序列豐度最高，且二者都是以浮游生物為主要食物來源的濾食性魚類。這可能也是TDS成為引起阿哈湖各樣點(diǎn)魚類群落結(jié)構(gòu)差異主要環(huán)境因子的原因。

4 結(jié)論

現(xiàn)階段的紅楓湖和阿哈湖魚類組成以鯉形目魚類為主，但存在以日鱸目為主的養(yǎng)殖魚類生態(tài)入侵。eDNA宏條形碼技術(shù)在喀斯特高原水域魚類多樣性評(píng)估方面具有較好的適應(yīng)性，可快速監(jiān)測到魚類群落結(jié)構(gòu)和空間分布情況，但通用引物可能對(duì)某些魚類存在擴(kuò)增偏好性；此外，不同人工湖泊水質(zhì)理化因子特異性較強(qiáng)，研究環(huán)境因子與湖泊魚類群落的關(guān)系時(shí)應(yīng)對(duì)每個(gè)湖泊單獨(dú)進(jìn)行評(píng)估。