植煙生態區、品種及其互作對烤煙多酚含量及品質的影響

陳燕 陳強 何軼 喻會平 郜軍藝 趙二衛 陸引罡

（1貴州大學農學院，550025，貴州花溪；2貴州大學煙草學院，550025，貴州花溪；3貴州省煙草公司畢節市公司，551700，貴州畢節）

多酚（polyphenols）是一類獨特的植物化學物質，是煙草重要的次生代謝產物和香氣前體物質[1]。煙草中多酚類物質主要有咖啡單寧類（綠原酸）、香豆素類（莨菪亭、莨菪靈）和黃酮醇類（蕓香苷、山奈酚糖苷）等，其中綠原酸和蕓香苷是煙葉中主要的多酚類物質，占90%左右[2]。這些致香前體物質的合成和積累受光照[3]、溫度[4]、品種[5]、施氮量[6]和栽培措施[7]等條件的影響。品種是決定煙葉風格和質量的內在因素，品種內含基因的表達方式和水平受環境影響，在煙草的生長過程中，生態條件和栽培措施通過影響煙葉化學成分和主要次生代謝產物的含量及比例，對煙葉品質產生重要影響[8]。

煙草品種是煙葉生產的物質基礎，是提高煙葉質量的內因[9]。然而我國煙葉生產中依舊面臨著品種種植單一的問題[10]。畢節煙區煙葉因具有獨特的清香型[11]深受卷煙工業企業的青睞，近年來，畢節市煙葉產量實現了突破，但煙葉質量還有待同步提升，優質適產的矛盾依然存在。因此亟需引進適合畢節生態環境的新品種。云煙105和云煙116均由云南省煙草農業科學研究院選育，通過云南省烤煙品種審定委員會審定并在多個煙區推廣種植[10-12]。本文以云煙105和云煙116為試驗材料，研究2個品種在畢節地區2個典型生態煙區的煙葉多酚類物質含量及化學品質指標的差異，為畢節市煙葉新品種的應用及推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云煙105和云煙116由畢節煙草公司提供?？緹煂Ｓ没蔥m(N):m(P2O5):m(K2O)=9:10:27]和專用追肥[m(N):m(P2O5):m(K2O)=13:0:26]的施用量分別為652和288.5kg/hm2。

貴州省畢節市大方縣六龍科技園（105°42′22″E，27°9′5″N）海拔1448m，屬北亞熱帶濕潤季風氣候，全年平均霧日為159.2d，占全年天數的43.6%，日照時數1311.2h，無霜期254～325d。土壤全氮1.31g/kg、堿解氮92.42mg/kg、有效磷22.14mg/kg、速效鉀121.37mg/kg、有機質22.71g/kg、pH 6.53。貴州省畢節市威寧彝族回族苗族自治縣黑石科技園（26°45′56″E，105°58′45″N）海拔 2220m，為高原氣候，年均日照時數1800.0h，無霜期180d。土壤全氮1.07g/kg、堿解氮62.37mg/kg、有效磷11.85mg/kg、速效鉀 77.71mg/kg、有機質 16.81g/kg、pH 6.12。貴州畢節大方和威寧的降雨、氣溫情況見表1。

表1 貴州省畢節市大方和威寧的降雨、氣溫Table 1 The rainfall,temperature of Dafang and Weining of Bijie city,Guizhou province

1.2 試驗設計

采用二因素隨機區組試驗，設置4個處理，分別為大方生態區，云煙105（DF-105）；大方生態區，云煙116（DF-116）；威寧生態區，云煙105（WN-105）；威寧生態區，云煙116（WN-116）。3次重復，每小區面積為67m2，行株距為110cm×55cm，種植密度為16 500株/hm2，純N施用量為93.75kg/hm2，基追比為6:4，基肥于移栽前一天起壟時施入，追肥于移栽15d后隨水施入煙株根部。同一區組內隨機排列，小區及區組間設置保護行和走道，試驗期間，各處理小區煙苗移栽、灌溉、中耕除草及病蟲害防治措施管理均按照當地優質煙葉生產管理方式進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 多酚 各處理選取外觀質量均勻一致的初烤煙葉（C3F），去梗切絲后在40℃下干燥12h，研磨過40目篩，密封置于冰箱中（-10℃）。參照煙草行業標準YC/T 202-2006[13]測定多酚類化合物含量。高效液相色譜（美國Agilent公司，Agilent 1260）分析，流動相 A：V水:V甲醇:V乙酸=88:10:2；流動相 B：V水:V甲醇:V乙酸=10:88:2，流動相 C：100%甲醇。 柱溫30℃，柱流量1mL/min，進樣體積10μL。梯度：0min，100%A；16.5min，80%A+20%B；30min，20%A+80%B；34min，100%C。檢測波長340nm，參比波長480nm，分析時間約為40min。用新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭和蕓香苷標準品制作標準曲線，外標法計算樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭、蕓香苷和總酚（以樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量的總和計為總酚）含量。

1.3.2 常規化學品質指標 各處理選取外觀質量均勻一致的初烤煙葉（C3F），在55℃烘至恒重，研磨過40目篩，裝入自封袋備用。用H2SO4-H2O2消化法測定煙葉氮、磷和鉀含量，用3，5-二硝基水楊酸比色法測定煙葉還原性糖和總糖含量，用紫外分光光度法測定煙葉煙堿含量。

1.4 數據處理

采用 Office Excel 2016、DPS 7.05及 Origin 2018進行統計分析與圖形制作，采用Duncan法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同生態區煙葉多酚含量的差異分析

如圖1所示，5種多酚物質峰形和分離效果均較好。對2個生態區烤后煙葉的多酚類物質含量進行方差分析，結果（表2）表明，植煙生態區之間烤煙多酚類物質含量差異較大，除隱綠原酸和蕓香苷未達顯著差異水平外，新綠原酸、綠原酸、莨菪亭及總酚含量均達到顯著差異水平。其中大方地區新綠原酸（2.26mg/g）、綠原酸（13.37mg/g）和總酚（24.93mg/g）含量均顯著高于威寧地區；而莨菪亭含量與之相反。

圖1 多酚標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of polyphenol standard

表2 不同生態區間多酚類物質含量Table 2 The contents of polyphenols in different ecological intervals mg/g

2.2 不同品種間煙葉多酚含量的差異分析

對2個品種烤后煙葉的多酚類物質含量進行方差分析，結果（表3）表明，不同品種間烤煙多酚類物質含量差異較大。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蕓香苷及總酚含量均以云煙105更高，分別為2.36、14.49、2.95、7.10和27.21mg/g，顯著高于云煙116，2個煙草品種莨菪亭的含量均為0.30mg/g。

表3 不同品種間多酚類物質含量Table 3 The content of polyphenols among different varieties mg/g

2.3 不同處理間煙葉多酚含量的差異分析

對不同處理間烤后煙葉的多酚物質含量進行方差分析（圖2），植煙生態區與品種各組合間多酚類物質含量差異顯著，其中以大方地區與云煙105組合的新綠原酸（2.58mg/g）、綠原酸（16.35mg/g）、隱綠原酸（3.19mg/g）和總酚（29.64mg/g）的含量均顯著高于其他組合；新綠原酸和隱綠原酸含量均表現為DF-105＞WN-105＞DF-116、WN-116，綠原酸和總酚含量均表現為DF-105＞WN-105＞WN-116＞DF-116，差異顯著。而莨菪亭含量以WN-116處理最大，為0.35mg/g，其次為WN-105處理，DF-116處理最低，僅為0.24mg/g。DF-105處理的蕓香苷的含量最大，為7.26mg/g，DF-116處理的蕓香苷含量最低，僅為5.40mg/g，顯著低于其他組合。

圖2 不同處理間煙葉多酚含量差異分析Fig.2 Difference analysis of polyphenol contents in tobacco leaves among different treatments

2.4 不同生態區及品種對煙葉多酚類物質含量貢獻率的分析

對不同植煙生態區與品種及其互作對烤煙多酚類物質含量的方差分析（表4）表明，煙葉多酚類物質含量顯著受植煙生態區、烤煙品種及生態區與品種間交互作用的影響。品種對新綠原酸的含量貢獻率最大，占總變異的68.53%，其次為生態區的貢獻率，為22.68%，生態區與品種的交互最低，僅為8.79%。品種對綠原酸的含量貢獻率最大，占總變異的60.91%，生態區與品種的交互次之，占總變異的31.41%，生態區影響最小，僅為7.68%。品種對隱綠原酸含量的貢獻率最大，為82.39%，其次為生態區，占總變異的9.67%，生態區與品種的交互最低，僅為7.94%。生態區對莨菪亭含量的貢獻率最大，占總變異的的94.40%，而品種及品種與生態區的交互對莨菪亭的影響未達到顯著差異水平。品種對蕓香苷含量的貢獻率最大，占總變異率的63.10%，生態區與品種的交互次之，占總變異的27.42%，生態區影響最小，僅為9.48%。品種對總酚的含量貢獻率最大，占總變異率的69.34%，生態區與品種的交互次之，占總變異的27.52%，生態區影響最小，僅為3.14%。

表4 生態區與品種對烤煙多酚類物質影響的雙因素方差分析Table 4 Two-factor analysis of variance for the effects of interaction between ecoregions and varieties on polyphenols in flue-cured tobacco

2.5 不同生態區及不同品種烤煙多酚類物質主成分分析

基于多酚類物質含量的煙葉樣品進行主成分分析，前2個主成分（品種和地區因素）分別為69.7%和25.7%，取第1、2個主成分得分作圖來表征不同處理煙葉多酚含量（圖3）。4個組合烤煙分布在不同的區域，處理間樣品離散型較大。品種間多酚類物質含量主要表現在PC1上，即云煙105與PC1呈正相關，而云煙116與PC1呈負相關。不同植煙生態區多酚類物質含量主要表現在PC2上，即大方地區與PC2呈負相關，而威寧地區則與PC2呈正相關。

圖3 不同生態區及不同品種烤煙多酚類物質主成分分析Fig.3 Principal component analysis of polyphenols in different varieties of flue-cured tobacco in different ecological regions

2.6 不同生態區及不同品種烤后煙葉常規化學品質分析

由表5可知，各組合烤煙常規化學品質指標處于優質煙葉范圍，威寧地區煙葉含氮量顯著高于大方地區，2個品種間無顯著差異。磷含量以DF-105處理最高，為0.22%，煙葉鉀、還原糖和總糖含量整體表現為云煙105＞云煙116，大方地區＞威寧地區，均以DF-105處理最高。云煙116煙堿含量顯著高于云煙105，以DF-116含量最高，為2.51%，DF-105煙堿含量最低，僅為1.81%，顯著低于其他處理。

表5 各處理煙株烤后煙葉常規化學品質Table 5 Conventional chemical quality of flue-cured tobacco leaves in different treatments %

2.7 不同生態區及不同品種烤煙煙葉各品質指標間的相關性分析

對不同生態區和不同品種烤煙葉片多酚類物質含量及常規化學品質指標進行相關性分析（圖4）可知，新綠原酸、總酚、鉀、綠原酸、隱綠原酸、總糖、還原糖和蕓香苷的含量呈顯著正相關關系；煙葉磷含量僅與鉀、總糖含量呈顯著正相關，與莨菪亭呈顯著負相關關系；煙葉氮含量則與莨菪亭含量呈顯著正相關關系；煙堿含量與磷、莨菪亭和氮含量相關性未達顯著水平，與其余各指標間均呈顯著負相關關系。

圖4 各處理煙株煙葉各品質指標間相關性分析Fig.4 Correlation analysis among various quality indexes of tobacco leaves in different treatments

3 討論

綠原酸是煙草中含量最高的多酚化合物，也是僅有的單寧類物質[14]。綠原酸不僅影響煙草的生長發育，對煙葉香吃味、調制特性及色澤等也有重要影響[15]，提高煙草中新綠原酸和綠原酸含量可顯著提高煙葉整體的感官質量[16]。生態因子及烤煙品種均是影響煙葉中3種綠原酸異構體含量的重要影響因素。本研究表明，大方植煙生態區中部煙葉綠原酸含量顯著高于威寧地區，威寧處于高海拔地區，UV-B（中波紫外線輻射，波長為280～320nm）更多，UV-B輻射上升造成多酚氧化酶和過氧化物酶含量升高，使中部煙葉多酚氧化分解[17-18]；品種對3種綠原酸異構體的貢獻率均在60%以上，這與孫志浩等[19]的研究結果一致。可見，品種的遺傳特性是決定煙葉綠原酸含量的主導因素。

莨菪亭是煙草多酚類物質的重要組成因素之一，本研究表明，云煙105和云煙116間莨菪亭含量無顯著差異，植煙區生態環境的差異是造成2個品種莨菪亭含量變化的主導因素，因此選擇適宜的生長環境更有利于調控莨菪亭含量。

蕓香苷屬于類黃酮，具有由苯甲酰共軛體系和肉桂酰共軛體系組成的交叉共軛體系，其越大，紫外吸收能力越強，對紫外光的吸收范圍較寬[20-21]。Bilger等[22]研究表明，溫度是植物表皮紫外線透過率的決定因素，低溫有利于多酚（特別是蕓香苷）的生物合成，紫外輻射和低溫均會引起植物蕓香苷含量的增加[23]。因此威寧生態區的生態特點更有利于促進蕓香苷的合成和積累。本研究表明，云煙116的蕓香苷含量表現為威寧地區高于大方地區，但2個生態區間云煙105蕓香苷的含量無顯著差異。而王育軍等[24]在對NC102和NC297的研究中表明，在1700～2200m內，隨海拔升高，蕓香苷含量逐漸下降?？梢?，不同品種對不同植煙生態區的適應情況不同。

本研究對煙葉常規化學指標及多酚類物質含量的相關性分析表明，煙葉常規化學指標與多酚類物質關系密不可分，其中煙葉還原糖和水溶性總糖與多酚類物質呈顯著正相關關系，這與姜慧娟等[25]的研究結果一致，可能與煙草中多酚通常以糖苷或酯形式存在有關[26]。研究[27]表明，多酚類物質在高糖類群煙葉內表現較為穩定，而在低糖類群煙葉內穩定性較差。畢淑峰等[28]對云南烤煙評吸質量與化學成分的關系研究認為，煙堿與香氣質、余味、雜氣和刺激性分值呈顯著或極顯著負相關，與濃度分值呈顯著正相關。李文卿等[29]研究表明，在一定范圍內隨煙堿含量的增加，多酚含量呈逐漸降低趨勢，本試驗也得出相似的結論。

4 結論

本研究結果表明，煙葉中多酚類物質含量在不同植煙生態區和品種間的差距均達到顯著差異水平，其中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量主要受品種影響最大，而莨菪亭則受植煙生態區的影響更大，其中云煙105在大方生態煙區的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和蕓香苷含量更高，而云煙116在威寧生態煙區的莨菪亭含量更高；煙葉磷、鉀、還原糖及總糖含量與多酚類物質含量呈顯著正相關關系，煙堿含量則與多酚類物質含量呈顯著負相關關系。綜合煙葉多酚及化學成分來看，畢節新引品種云煙105和云煙116更適宜種植在大方地區，且云煙105表現優于云煙116。