超級增強子區域遺傳變異與乙型肝炎病毒相關肝細胞癌術后總生存期的關聯分析

韋雪艷 林秋伶 邱模勤 陳佩琴 周子寒 劉穎春梁偉康 張若昕 余紅平

1廣西醫科大學公共衛生學院（南寧 530021）；2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院（南寧 530021）；3復旦大學公共衛生學院流行病學教研室（上海 200032）

原發性肝癌（簡稱肝癌）發病率和死亡率分別居于惡性腫瘤第6位和第3位[1]。廣西的肝癌死亡率居廣西腫瘤死因譜首位[2]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要臨床病理類型[1]，且HCC的5年總生存率仍低于 15%[3]。研究表明，單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與個體疾病進展以及預后密切相關[4-5]。超級增強子（super-enhancers，SEs）是基因組中大量增強子富集的轉錄調控區域，能夠結合轉錄因子，促進癌基因表達[6-7]。SEs主要負責調控決定細胞身份的基因表達，如決定癌細胞身份的致癌基因[8-9]。多項研究發現，SE區域的SNPs可通過調控致癌SEs的活性促進或抑制靶基因的表達，在腫瘤的發生發展中起重要作用[10-12]。然而，目前尚無SEs區域SNPs與HCC患者預后的研究報道。本研究探討SEs區域SNPs與HCC患者預后之間的關系，以識別新的預后標志物，為尋找HCC的治療靶點和個體化防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及一般資料基于本課題組全基因組芯片分析數據庫中來源于2007年7月至2017年12月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院首次確診并行肝癌切除術的866例HBV相關HCC患者，均為HBsAg血清陽性及經病理檢查或AFP等確診為HCC。排除丙肝抗體陽性患者，遠處轉移或晚期患者，合并嚴重心臟、肺臟、腎臟及腦血管疾病和術前接受化療和（或）放療的患者。調查員通過查閱病歷和電話隨訪等方式收集患者的一般情況以及隨訪情況，如年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染狀況等。統計分析時，將866例的總人群使用隨機數按1∶1比例分為發現集和驗證集，各433例。本研究獲得廣西醫科大學腫瘤醫院倫理委員會批準并經患者知情同意（批準號：LW2022076）。

1.2 隨訪按照HCC患者出院后前兩年每3個月隨訪一次、之后每6個月隨訪一次的隨訪周期，以電話隨訪患者本人或其家屬。以死亡為研究終點，總生存期（overall survival，OS）作為研究變量，OS定義為手術日期至死亡或末次隨訪日期（2020年3月）。失訪或末次隨訪未死亡的病例作為截尾事件。

1.3 DNA提取、基因分型和質量控制本研究術前對研究對象抽取5 mL外周血，采用血液DNA提取試劑盒（愷碩生物科技（廈門）有限公司）從外周血中提取DNA。全基因組分型使用Illumina Infinium? Global Screening Assay芯片。用PLINK（v1.9）軟件進行質量控制處理。SNP排除標準：（1）位于性染色體上；（2）檢出率＜ 95%；（3）次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＜ 0.1%；（4）哈迪溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）P＜1×10-6。

1.4 候選SNPs篩選本研究通過檢索人類超級增強子SEdb數據庫中肝癌細胞系HepG2和HuH7的H3K27ac數據，鑒定了956個HCC的特異性SEs。隨后，使用PLINK1.90軟件提取SEs區域上的SNPs位點。SNPs篩選標準：（1）MAF ≥ 0.05；（2）基因分型成功率≥95%；（3）HWE P≥1.0×10-6。最終，基于RegulomeDB和HaploReg v4.2等網站進行功能預測分析，篩選具有潛在功能性SNPs位點。

1.5 統計學方法利用R4.1.0的survival和survminer包，采用Log-Rank檢驗和Cox比例風險模型評估患者基本特征以及不同遺傳模型中SNPs與HCC患者術后OS的關系，計算風險比（hazard ratio，HR）及其 95%置信區間（confidence interval，CI），并繪制風險基因型Kaplan Meier生存曲線。利用HaploView軟件進行連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析，并繪制LD圖。

2 結果

2.1 研究人群基本特征及其與HCC術后OS關系本研究共納入866例HCC患者，截止到2020年3月，共419例（48.4%）患者發生死亡，中位生存時間（median survival time，MST）為39.05個月。Log-Rank檢驗發現，年齡、AFP、癌栓和BCLC分期均與HCC患者OS相關（P＜0.05）。見表1。

表1 866例HBV相關HCC患者的一般臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of 866 patients with HBV-related HCC 例（%）

2.2 超級增強子區域SNPs與HBV相關HCC患者術后OS的關系在加性模型下，利用多因素Cox比例風險回歸分析并校正年齡、性別、吸煙、飲酒、AFP、肝硬化、有無癌栓、BCLC分期和主成分分析中具有統計學差異的成分等因素，并采用假陽性報告率（false positive report probability，FPRP）進行多重假設檢驗。在發現集篩選出與HCC患者OS相關的1 272個SNPs（P＜0.05，FPRP＜ 0.2）；接著，在驗證集中驗證這1 272個SNPs位點，結果發現位于3個基因的7個SNPs位點與HBV相關HCC患者術后OS仍存在關聯。見表2。

表2 與HBV相關HCC患者術后OS相關的7個SNPSTab.2 Associations between seven validated significant SNPs and postoperative OS of HBV-related HCC

2.3 篩選具有潛在功能性SNPs位點本研究對與HCC患者術后OS相關的谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）上的5個SNPs進行連鎖不平衡分析，結果發現這5個SNPs高度連鎖（r2＞0.9），見圖1。隨后，采用生物信息學工具對上述7個SNPs的進行功能注釋，見表3。結果顯示，軸抑制蛋白 2（axis inhibition protein 2，AXIN2）和Bcl2修飾因子（bcl2 modifying factor，BMF）rs546220預測都位于增強子區組蛋白標記處，且可能會對基序有影響；GLUL rs61805159預測得分最高為2a，位于增強子區組蛋白標記處且可能會對9個基序有影響。最終，根據連鎖不平衡分析和功能注釋結果選擇3個具有潛在功能性SNPs（GLUL rs61805159，BMF rs546220，AXIN2 rs4791170）進行進一步分析。

表3 7個與HBV相關HCC OS相關SNPs的功能預測Tab.3 Functional prediction of seven significant SNPs

圖1 GLUL基因SNPs的連鎖不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium of GLUL gene SNPs

2.4 SNPs與HBV相關HCC患者術后OS的關系在不同遺傳模型下（加性、顯性模型）對上述3個SNPs進行多因素Cox回歸分析，評估其與HBV相關HCC患者術后OS的影響。顯性模型下，攜帶GLUL rs61805159位點GA/AA基因型的HCC患者比攜帶GG基因型的患者術后死亡風險增加45%（HR=1.45，95%CI：1.17 ～ 1.79，P＜ 0.001）；攜帶BMF rs546220 AA/AC基因型患者較攜帶CC基因型HCC患者術后死亡風險降低35%（HR=0.65，95%CI：0.52～ 0.81，P＜0.001）；與攜帶GG基因型的患者相比，攜帶AXIN2 rs4791170位點GA/AA基因型的患者術后死亡風險增加43%（HR=1.43，95%CI：1.17～ 1.74，P＜ 0.001）。見表4。

表4 3個相關的SNPs的遺傳模型分析Tab.4 Different genetic model analyses of three SNPs

2.5 SNP-SNP聯合作用對HBV相關HCC患者術后OS影響考慮到各SNP之間在HCC發生發展中可能存在潛在聯合作用，本研究將rs61805159位點GA/AA基因型、rs546220位點CC基因型、rs4791170位點GA/AA基因型定義為假設危險基因型（簡稱危險基因型），進一步分析SNPs聯合作用對HBV相關HCC患者術后OS的影響。多因素Cox回歸分析結果顯示，相比于攜帶0個風險基因型的患者，攜帶1、2或3個風險基因型的患者術后死亡風險更高，預后更差，且死亡風險隨著風險基因型的個數增加而增加（Ptrend＜0.001），見表5。同時，Kaplan-Meier分析發現與攜帶0個風險基因型的患者相比，攜帶1、2或3個風險基因型的患者MST更短（MST分別為 103.8、74.5、51.3、24.4個月），且MST隨著風險基因型的個數增加而縮短，P＜ 0.001（圖2）。

圖2 聯合風險基因型與HCC患者OS關系的KM曲線Fig.2 Kaplan-Meier curves of combined risk genotypes and OS of HCC

表5 聯合風險基因型與HBV相關HCC患者術后OS的相關性Tab.5 Correlation analysis of combined risk genotypes with postoperative OS of HBV-related HCC

3 討論

本研究探討超級增強子區域SNPs與HBV相關HCC患者術后OS關系。單位點分析中，GLUL rs61805159和AXIN2 rs4791170的A等位基因均可增加患者術后的死亡風險，BMF rs546220 A等位基因降低患者術后的死亡風險；SNPs聯合作用分析發現，這3個SNPs的聯合作用影響HCC患者術后的OS，攜帶風險基因型的個數越多，其OS越短，存在明顯的劑量反應關系。以上結果提示超級增強子區域SNPs與HBV相關HCC患者術后預后有關。

研究發現，單個SNP位點對肝癌發生發展作用微小，而多位點的聯合作用往往在腫瘤的發生發展過程中發揮更大的作用[13-14]。WANG等[15]對rs567403和rs7969508的風險基因型聯合分析發現，與攜帶0-1個不利風險基因型相比，攜帶2個不利風險基因型的皮膚黑色素瘤患者發生死亡的風險增加了2.17倍。本研究發現與攜帶0個風險基因型患者相比，攜帶多個風險基因型的患者發生死亡的風險增加，提示rs61805159 GA/AA、rs546220 CC和rs4791170 GA/AA位點的聯合作用可協同增加HBV相關HCC術后患者的死亡風險，且HCC術后患者OS明顯縮短，提示其不利風險基因型對HCC患者預后存在顯著的累加效應。

GLUL具有催化谷氨酰胺的功能，在維持細胞酸堿穩態以及氨解毒，細胞信號傳導和增殖過程也發揮重要的作用[16]。據報道，體外敲低GLUL可有效抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[17]，上調GLUL能促進乳腺癌細胞增殖[18]，還是多形性膠質母細胞瘤患者的不良預后標志物[19]。上述研究提示，GLUL可能參與HCC發生發展，進而影響HCC患者的預后。本研究發現攜帶rs61805159 AA和GA基因型的HBV相關HCC患者比攜帶GG基因型的患者有較短的OS。功能注釋分析發現rs61805159 G＞A位于超級增強子區域，可能會引起基序改變。因此，筆者推測rs61805159 A等位基因可能通過提高增強子活性來促進GLUL表達，從而增加HCC患者死亡風險。

BMF屬于Bcl2家族的成員，其形成的異質或同源二聚體，可以作為參與各種細胞活動的抗凋亡或促凋亡調節劑[20]。KANDASWAMY等[21]發現在慢性淋巴細胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）中，rs539846（C ＞A）A等位基因能夠降低BMF的表達，減少腫瘤細胞凋亡，從而增加CLL易感性。JIANG等[22]發現上調miR-640可以通過靶向抑制BMF基因促進膠質母細胞瘤細胞增殖。在本研究中，BMF rs546220位點A等位基因可降低HBV相關HCC患者術后的死亡風險，延長患者的生存時間。功能預測分析表明，BMF rs546220位于超級增強子區域，可能對基序改變發揮作用，提示rs546220 A等位基因可能發揮促進增強子的作用來上調BMF mRNA表達，進而調控HCC的生物學過程，并改善HCC患者的術后生存情況。

AXIN2是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵調節因子，在細胞生長、許多惡性腫瘤的發生、腫瘤進展等方面起著重要作用。研究發現，AXIN2是一個促癌啟動子，它可以上調轉錄抑制因子Snail的活性誘導上皮間質轉化，從而促使腫癌細胞發生轉移，導致腫瘤不良預后[23-24]。ROSALESREYNOSO 等[25]研究發現，攜帶 AXIN2 rs2240308（C＞T）T等位基因個體罹患乳腺癌的風險顯著增加。在本研究中，AXIN2 rs4791170 A等位基因與HBV相關HCC患者預后較差相關，這可能與激活Wnt/β-catenin信號通路，上調AXIN2表達，進而促進腫瘤細胞轉移與侵襲相關。

綜上，本研究發現攜帶GLUL rs61805159 GA/AA、BMFrs546220CC和AXIN2rs4791170GA/AA風險基因型的HBV相關HCC患者術后OS更差。然而，對于這些SNPs的作用機制尚未能完全闡明，需要今后進一步深入開展SNP功能學研究進行解析。本研究的局限性是樣本量相對較小，在一定程度上可能影響了檢驗效能；其次未能收集患者術后治療信息，可能對結果產生一定的影響。因此，本研究需要更大樣本量的研究進一步驗證。