線粒體基于HUR/PIM1信號通路在高血壓血管內皮細胞損傷中的機制

尹磊 蔣志明 楊慧瓊 劉燕飛 鄭學斌

長沙市第四醫院心血管二科（長沙 410000）

高血壓是常見的慢性疾病，調查顯示歐洲和美國等發達國家的高血壓發病率高達20%，臨床特征血壓升高和心腦血管疾病[1-2]。而其作用的分子機制尚未明確。血液循環和免疫系統的重要組成部分，血管內皮細胞廣泛涉及生物過程，包括調節血壓，血管形成，纖溶和炎癥[3-4]。研究[5]表明血管內皮細胞功能障礙在高血壓的發生發展中起重要作用。內皮細胞不僅充當物理屏障，還分泌多種影響血管舒張和收縮功能的物質，高血壓期間，內皮細胞受損增加[6]。因此，研究血管內皮細胞在高血壓發生發展中的分子機制有助于提高高血壓的診治水平。

線粒體是高度動態的，多任務的細胞器，不斷地延長（融合）和分裂（裂變），動力蛋白相關蛋白1（Drp1）是線粒體裂變的主要調控因子[7]。與動力蛋白相關的GTPase經歷了許多步驟來介導線粒體裂變，裂變/融合平衡的中斷（主要是向裂變的轉變）擾亂了細胞生理學，并與多種疾病有關，包括心血管系統中的疾病[8]。各種壓力因素如高糖、缺氧和氧化應激已被證明可誘導內皮細胞中依賴Drp1的線粒體裂變并介導內皮病變，包括內皮依賴性松弛受損、微血管減少以及傷口愈合和血管生成缺陷[9]。Mdivi-1是Drp1的選擇性抑制劑，可在GTPase結構域外結合到參與寡聚物組裝的表面上，從而抑制Drp1 GTPase激活[10]。Drp1以及線粒體裂變在內皮炎癥中的機制貢獻尚未明確。

血管生成是由HuR調控的癌癥發展的重要方面之一，參與血管生成相關基因的調控。絲氨酸/蘇氨酸激酶（PIM1）在細胞存活、增殖和分化中具有多種生物學作用[11]。PIM激酶在多種類型的腫瘤細胞中增強細胞存活并抑制細胞凋亡。研究表明PIM1可促進內皮遷移和血管生成，并抑制細胞毒性[12]。在本研究基于HUR/PIM1信號通路研究線粒體在高血壓血管內皮細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系培養人臍血管內皮細胞（HUVECs）購自ATCC，細胞在M199培養基中生長，培養基有20%胎牛血清、50 μg/mL重組人內皮細胞生長因子、25 U/mL肝素、100 U/mL青霉素和0.1 U/mL鏈霉素在37℃，5% CO2中。第3～6代的HUVEC用于所有實驗。將靜止HUVECs隨機分為3組：control組；AngⅡ組（1 mmol/L）；Mdivi-1（25 μmol/L Mdivi-1+1 mmol/L AngII）組。

1.2 細胞活力測定使用細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測細胞活力。將HUVEC以2×103個細胞/孔的密度接種在96孔板中。24 h以下以不同濃度的 0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ（Sigma）的處理，10 μL CCK-8加入到孔中，溫育在37℃下3 h。Spectra Max 190酶標儀（Sunnyvale，USA）進行比色分析，并在450 nm波長處測量吸光度。

1.3 線粒體形態染色采用線粒體選擇性探針，檢測線粒體形態。藥物處理24 h后，將活細胞與50 nmol/L絲粒體追蹤器在37℃下孵育30 min。孵育后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞3次。使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察波長為590/516 nm時的熒光。

1.4 線粒體膜電位通過JC-1染料用于測量線粒體膜電位。JC-1是一種陽離子染料，在線粒體中表現出電位依賴性積累，在活細胞中由紅色熒光表示。在細胞凋亡過程中，JC-1作為單體存在于細胞質中，由綠色熒光表示。因此，紅色/綠色熒光強度比表明線粒體膜電位的變化。

1.5 流式細胞術將HUVEC用胰蛋白酶消化、收集并用預冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次，使用FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences）通過流式細胞術測量細胞凋亡。早期凋亡細胞通過Annexin V單陽性染色鑒定，壞死細胞通過碘化丙啶單陽性染色鑒定，晚期凋亡細胞通過碘化丙啶和Annexin V雙陽性染色鑒定。使用流式細胞儀進行檢測，結果使用ModFit v3.2軟件進行分析

1.6 內皮細胞的遷移Tinza對HUVEC細胞遷移的使用transwell室進行評估，將懸浮有無血清ECM的HUVEC細胞以2×104的密度接種在板中，底部腔室充滿0.6 mL新鮮ECM。HUVEC細胞在37℃培養24 h。用棉簽除去膜表面的非遷移細胞后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色遷移至下膜表面的HUVEC細胞。圖像通過EVOS XL Core拍，使用Image-Pro-Plus 6.0分析遷移細胞。

1.7 體外血管形成試驗體外血管生成研究中，體外試管形成試驗使用ibidi載玻片進行。將200 000個HUVEC懸浮在1 mL M199培養基。細胞培養基中補充有指定濃度的Tinza。將細胞懸液（50 μL）施加到每個載玻片孔中，并在37℃的加濕室中孵育。在細胞接種后0、0.5、3、6、9 h，以10倍放大率對管形成進行成像。9 h后用Image J軟件定量總管長。

1.8 實時定量熒光PCR使用RNAiso Plus試劑提取HUVEC中的總RNA，通過PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉錄為cDNA，GAPDH作為內參，每個樣本3個復孔。引物通過生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據制造商的說明，數據處理根據公式2-ΔΔCT計算兩組間目的基因相對表達含量的變化。

1.9 蛋白質印跡分析使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（Sigma Chemical Co）的RIPA裂解緩沖液（Beyotime Biotech）中裂解HUVEC細胞。細胞裂解物通過8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，后轉移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。膜在室溫下在5%脫脂牛奶中封閉1 h，與以下一抗一起孵育Drp-1、ROS、HUR（1∶500）和 PIM1均來自 Cell Signaling Technology（CST）；β-actin（Santa）。洗滌后，將二抗即HRP偶聯的抗兔或抗小鼠（CST），在室溫下孵育1 h，將膜使用化學發光試劑盒（Thermo Fisher Scientific）進行可視化。

1.10 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，所有資料以（）表示，多組間差異通過單因素方差分析，數據表示為來自三個獨立實驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AngII和Mdivi-1對HUVEC細胞活力的影響CCK-8測定測量AngⅡ對細胞活力的影響，選擇了0.01、0.1、1、10 mmol/L AngⅡ對內皮細胞增殖的抑制作用。結果表明，AngⅡ（1 mmol/L）以劑量依賴性方式降低HUVEC細胞活力，Mdivi-1升高了HUVEC細胞活力，見圖1A-B。蛋白質印跡分析顯示，在用0.1、1、10 mmol/L AngⅡ處理24 h后，Drp-1蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1C-D。

圖1 AngⅡ和Mdivi-1對HUVEC細胞活力的影響Fig.1 Effects of AngⅡand Mdivi-1 on the viability of HUVEC cells

2.2 Mdivi-1對AngⅡ誘導的HUVEC線粒體形態和膜電位的影響免疫熒光結果，與control組相比，AngⅡ組導致線粒體形態從細長的細胞器改變為均勻的點狀細胞器，Mdivi-1組線粒體再次被拉長，見圖2A。JC-1的結果顯示AngⅡ組線粒體膜電位降低，Mdivi-1組線粒體膜電位升高，見圖2B。AngⅡ組Drp1蛋白表達增加，提示線粒體發生了裂變，Mdivi-1組HUVECs時，Drp1的表達被抑制。裂變介導的碎片與細胞中ROS的產生有關，與control組相比，AngⅡ處理24 h的ROS水平有統計學意義，Mdivi-1抑制Drp1顯著降低了AngⅡ誘導的ROS的產生，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2C-E。

圖2 Mdivi-1對AngII誘導的HUVEC線粒體形態和膜電位的影響Fig.2 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC mitochondrial morphology and membrane potential

2.3 Mdivi-1對AngⅡ誘導的HUVEC凋亡、遷移及血管生成的影響流式細胞術分析細胞凋亡，數據顯示AngⅡ組HUVEC的凋亡率增加。Mdivi-1降低細胞凋亡，見圖3A-B。Transwell試驗數據表明，AngⅡ組通過腔室膜的HUVECs數顯著高于control組，Mdivi-1組與control組HUVECs數量無顯著差異，見圖3C-D。在網絡形成試驗中，結果表明Mdivi-1抑制了AngⅡ誘導的HUVEC細胞的管形成，管狀結構的數量減少并且管狀結構不穩定，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3E。

圖3 Mdivi-1對AngII誘導的HUVEC凋亡、遷移及血管生成的影響Fig.3 Effects of Mdivi-1 on AngII-induced HUVEC apoptosis，migration and angiogenesis

2.4 Mdivi-1對AngⅡ誘導的HUVEC細胞HUR/PIM1的影響qPCR、Western blot檢測發現在HUVEC細胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量，AngⅡ組HUVEC的HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量升高，Mdivi-1組細胞HUR和PIM1 mRNA和蛋白含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4A-E。

圖4 Mdivi-1對AngII誘導的HUVEC細胞HUR/PIM1的影響Fig.4 The effect of Mdivi-1 on AngII-induced HUR/PIM1 in HUVEC cells

3 討論

高血壓是由環境和遺傳因素相互作用引起的復雜疾病[13]。研究[14]表明線粒體與高血壓的發生發展密切相關，其在血管組織中的表達顯著增加。此外，血管內皮細胞損傷和功能障礙是高血壓的重要跡象，線粒體在內皮細胞損傷和功能障礙中起重要作用[15]。本研究實驗表明Mdivi-1抑制AngⅡ誘導的HUVECs的HUR/PIM1信號通路及其凋亡、遷移和血管生成，減少ROS產生。

本研究顯示AngⅡ處理上調了HUVEC中Drp1的蛋白質水平。Drp1蛋白表達的增加表明線粒體經歷了裂變事件，Drp1的增加與線粒體碎片增加相一致[16]。與對照相比組，用AngⅡ處理導致線粒體形態從細長到均勻碎片細胞器的變化。最近研究顯示Mdivi-1治療抑制Drp1從而降低了AngⅡ誘導的內皮功能障礙，通過減少ROS的產生，抑制凋亡和遷移能力，改善線粒體形態，細胞凋亡是通過線粒體內在途徑進行的，如線粒體膜電位的喪失，促凋亡[17]。本研究顯示AngⅡ和Mdivi-1孵育HUVECs時，Drp1的表達顯著降低，這與最近的研究結果一致[18]。大量研究[19]表明，AngⅡ可以通過增加ROS的產生來誘導細胞功能障礙，ROS與線粒體功能障礙密切相關。本研究表明與control組相比，AngⅡ治療顯著提高了HUVECs的ROS水平。AngⅡ促進血管系統中氧化應激的產生，是內皮細胞的關鍵介質功能障礙和凋亡[20]。此外，AngⅡ誘導的線粒體膜電位降低是細胞凋亡的標志，細胞凋亡是因形態學和生化變化而致細胞死亡的主要模式[21]。研究[22]表明細胞凋亡是以細胞收縮、膜起泡和染色質凝結為特征的細胞死亡類型。當線粒體功能減弱或細胞內ATP耗盡時，AngⅡ誘導的內皮細胞過度凋亡導致內皮單層的剝除。本研究結果顯示AngⅡ處理誘導HUVECs線粒體形態及膜電位降低，細胞凋亡和遷移能力增加，血管形成升高。而Mdivi-1可以保護AngⅡ處理誘導HUVECs細胞功能障礙，其線粒體形態改善及線粒體膜電位升高，HUVEC細胞的凋亡、遷移和血管形成能力降低。

研究[23]顯示HuR在巨噬細胞中的促血管生成作用已在巨噬細胞Hur敲除小鼠中得到證實，微血管生成顯著減弱。PIM蛋白家族是原癌基因家族，在多種惡性腫瘤中表現出增加的表達水平。PIM激酶在多種類型的腫瘤細胞中增強細胞存活并抑制細胞凋亡[24]。研究[25]表明 PIM1可促進內皮遷移和血管生成，并抑制細胞毒性。此外，研究[26]顯示HuR-PIM1軸對維持血管生成轉換非常重要。本研究顯示AngⅡ處理誘導HUVECs細胞HUR/PIM1信號通路顯著升高，而Mdivi-1可以降低了AngⅡ處理誘導HUVECs細胞HUR/PIM1信號通路的表達。此外，本研究存在一定的局限性，只有通過一種細胞進行驗證，并還需要后續動物實驗進行補充。

綜上所述，本研究結果顯示線粒體抑制劑Mdivi-1降低了AngⅡ誘導HUVECs細胞HUR/PIM1信號通路，Mdivi-1減少了高血壓血管內皮細胞凋亡、遷移及血管生成，這表明抑制了線粒體及相關途徑，可為預防心血管疾?。ㄈ绺哐獕海┲械膬绕すδ苷系K提供新策略。