雞Wnt3a的SNPs篩選及其與皮膚毛囊密度性狀關聯分析

屠云潔，姬改革，章明，劉一帆，巨曉軍，單艷菊，鄒劍敏，李華，陳智武，束婧婷

雞的SNPs篩選及其與皮膚毛囊密度性狀關聯分析

屠云潔1，姬改革1，章明1，劉一帆1，巨曉軍1，單艷菊1，鄒劍敏1，李華2，陳智武3，束婧婷1

1江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇省家禽科學研究所，江蘇揚州 225125；2佛山科技學院，廣東佛山 528225；3廣西金陵農牧集團有限公司，南寧 530000

【目的】Wnt信號通路在動物皮膚毛囊的發生發育中具有重要作用，前期研究結果表明可能是影響雞皮膚毛囊密度性狀的重要候選基因。為進一步驗證在皮膚毛囊生長發育中的作用，研究以金陵花雞為研究對象，篩選SNPs，并分析其與毛囊密度性狀的相關性，以期找到對皮膚毛囊密度有顯著影響的分子標記，為培育屠體美觀的屠宰型肉雞的“分子編寫育種”提供參考。【方法】采用PCR擴增直接測序法對的SNPs位點進行篩查，分析單個SNP標記與皮膚毛囊密度性狀的相關性。采用Haploview軟件分析這些SNP位點的連鎖不平衡（LD）程度，并分析不同單倍型組合與毛囊密度性狀的相關性?！窘Y果】共發現14個SNP位點，在第2外顯子發現1個SNP位點（SNP1），為同義突變；第2內含子發現4個突變位點（ SNP2—SNP5），在第3內含子發現9個SNP位點（SNP6—SNP14）。卡方檢驗表明，第2外顯子的1個突變位點（SNP1）和第2內含子的3個突變位點（SNP3—SNP5）的3個位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態（＞0.05），第3內含子的9個SNPs（SNP6-SNP14）偏離哈代-溫伯格平衡（＜0.05）。SNP1—SNP5的均小于0.50，均小于0.25，這5個SNP位點遺傳多樣性較低。第3內含子的9個突變位點，SNP6、SNP7、SNP9位點＜0.25，其他6個突變位點 0.25＜＜0.5，為中度多態。單標記關聯分析表明，公、母雞SNP2位點的AG基因型的毛囊密度顯著高于GG基因型（＜0.05）；母雞SNP8位點的AA與GG基因型的毛囊密度顯著高于AG基因型（＜0.05），在公雞中3種基因型的毛囊密度差異不顯著。14個SNPs連鎖不平衡分析表明，SNP3、SNP4和SNP5的強連鎖產生了2種單倍型，H1（GAT）頻率為0.882和H2（TCC）頻率為0.118；SNP6—SNP13之間的強連鎖產生了5種單倍型，其中H1（ACATTATC）和H2（ACGTCCCA），H3（ACGTTCCA），H4（GTGCTATA），H5（ACGTCCCC），單倍型頻率分別為0.469、0.275、0.123、0.113、0.014。SNP3、SNP4和SNP5連鎖產生的2 種單倍型組合后產生了3種單倍型組合，關聯分析發現在公、母雞中3種單倍型組合的毛囊密度均差異不顯著；將SNP6—SNP13連鎖產生的5種主要單倍型組合后，公雞有7種組合單倍型組合，毛孔數量差異不顯著；母雞有8種主要單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）毛囊密度最大。SNP2和SNP8位點與皮膚毛囊密度顯著相關，單倍型組合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為母雞優勢單倍型?！窘Y論】篩選到的14個SNPs位點，其中，SNP2（rs2587721 G＞A）和SNP8（rs2555967G＞A）位點與毛囊密度顯著相關，8個SNPs（SNP6—SNP13）位點處于強連鎖不平衡，母雞H1H1單倍型毛囊密度最大。的SNP2和SNP8位點的單倍型組合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）和SNP6—SNP13連鎖產生的H1H1（AACCAATTTTAATTCC）單倍型組合與母雞毛囊密度顯著相關，可以為雞毛囊密度“分子編寫育種”提供重要遺傳信息。

雞；；皮膚毛囊；SNP位點；連鎖不平衡

0 引言

【研究意義】近年來，隨著禽流感事件和新冠疫情對家禽行業負面影響的加重和大眾對食品安全的重視，家禽行業進入重要變革時期?；铍u市場的逐步關閉、屠宰后冷鮮上市已經成為不可逆轉的趨勢[1-2]。雞屠體外觀逐漸成為消費者的關注重點，其中皮膚毛孔更是屠體外觀關注的重點，受到育種工作者越來越多的重視[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】冰鮮雞具有毛孔細密、皮膚緊實度好的特征，更受到消費者的青睞。毛囊密度直接影響雞的屠體外觀[5-7]。毛囊密度發育受Wnt、Edar 等信號通路和、、、等基因調控[5-10]，其中Wnt信號通路在雞、鵝等家禽的毛囊密度發育過程中發揮重要作用[11-16]。Wnt家族成員3a（）是Wnt信號通路中的重要成員，在毛囊的生長發育中具有重要作用[17-18]。對雞毛囊的大小起到重要作用[6,15-16]，能夠增加真皮厚度，擴大了脊髓束大小，減少了芽間域間距，同時影響鳥類羽毛類型[19]，對黃羽肉雞胚胎期羽囊形態發生起到重要調控作用[20]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期研究發現，表達和SNPs在雞不同部位皮膚毛囊密度差異的皮膚組織中具有顯著差異，推測可能是影響雞皮膚毛囊密度性狀的重要候選基因[15-16]。【擬解決的關鍵問題】為進一步驗證在皮膚毛囊生長發育中的作用，篩選的SNPs位點，分析多態位點與雞毛囊密度的關聯性，找出對毛囊密度有顯著效應的SNP標記，以期為進一步深入研究在皮膚毛囊生長發育中的作用機制提供基礎資料，為培育屠體美觀的屠宰型肉雞的“分子編寫育種”研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

2021年1—2月在廣西金陵農牧集團有限公司飼養金陵花雞、翅靜脈采血、屠宰和毛囊密度測定統計。2021年3—5月由江蘇省家禽科學研究所家禽遺傳育種重點實驗室科研人員開展金陵花雞PCR擴增試驗。

1.2 試驗動物及樣品采集

金陵花雞來自廣西金陵農牧集團有限公司培育的優質肉雞配套系，選取1 000個種蛋入孵，飼養至上市日齡（7周齡），隨機選擇金陵麻雞382只（公162只，母220只），記錄腳號，并進行翅下靜脈采血1 mL，ACD抗凝，混勻后放入-20℃冰箱保存備用。

1.3 毛囊密度數據的測定

毛囊密度統計方法：7周齡382只金陵花雞屠宰拔毛后，以背中線為軸，統計左側背部皮膚2 cm×2 cm=4 cm2面積內毛囊的數目，所有毛囊密度均由同一人測量，所測部位基本一致[15]。公、母雞背部毛囊密度測定方法見圖1。

圖1 公、母雞背部毛囊密度測定方法

1.4 主要試劑和儀器

DYY-6D型電泳儀，離心機，渦旋振蕩器，梯度 PCR 儀，凝膠成像系統（Tanon 2500）、紫外分光光度計（NanoDrop One）。Loadingbuffer，1.5%的瓊脂糖凝膠，TBE電泳液，PCR八連管，無菌超純水。

1.5 引物設計與合成

根據GenBank登錄號：NC_006089DNA序列，設計部分外顯子和內含子序列PCR引物，-1（F：CACGGAGGAACTGAAGATGC，R：TGAAATTCAGTCCTGTCTCCAC）、-2（F：GTCCATGCCATCGCCTCTG，R：TCCTACACCCA GG TACACATAGG），PCR產物長度分別為480、593 bp，引物由生工生物工程（上海)股份有限公司合成。

1.6 Wnt3a PCR擴增與測序

采用全血基因組DNA提取試劑盒（DP348），提取的DNA溶于超純水中。PCR擴增反應。PCR總反應體系50 μL：DNA模板2 μL，dNTP（2 mmol/L）4 μL，Mg2+（3 mmol·L-1）0.6 μL，1×PCR反應緩沖液5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，聚合酶（1U·μL-1）2.5 μL，補超純水至50 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸5 min。PCR擴增目的片段用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.7 SNP位點確定、基因分型和遺傳多態性分析

通過DNAMan6.0進行比對，并用Chromas軟件（Ver.1.6.0）篩查SNP位點。針對SNP位點測序峰圖，對382個個體基因分型。利用PopGene（version 1.31）統計各個SNP位點基因型頻率、基因頻率、雜合度（）和多態信息含量（）。對所有SNP位點利用Hapoview4.1進行連鎖不平衡分析，利用卡方檢驗（c2）檢測SNP位點是否處Hardy-Weinberg（H-W）平衡狀態。

1.8 Wnt3a SNP位點與毛囊密度相關性分析

以SPSS 16.0軟件的一般線性模型中單變量方差分析進行位點3種基因型與雞毛囊密度性狀關聯分析，結果用平均值±標準誤表示。固定因子：SNP標記的不同基因型，因變量：毛囊密度，采用LSD法多重比較不同標記基因型之間毛囊密度的差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。SNP位點兩種基因型與雞毛囊密度性狀關聯分析采用獨立樣本T檢驗法，比較不同基因型之間毛囊密度的差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 金陵花雞公母雞毛囊密度統計

金陵花雞公母雞毛囊密度統計結果見表1。可見，金陵花雞母雞毛囊密度顯著高于公雞。

2.2 Wnt3a SNP位點的測序峰圖和突變類型

SNP位點的相應位置通過“http://asia. ensembl.org/index.html?redirect=no”查找。14個SNP位點不同基因型的測序峰圖見圖2。在第2外顯子發現1個SNP位點SNP1（rs2587569 G＞A），為同義突變；第2內含子發現4個突變位點，分別為SNP2（rs2587721G＞A）, SNP3（rs2587832G＞T）, SNP4（rs2587845 位點A＞C）, SNP5（rs2587849T＞C）。在第3內含子發現9個SNP位點,分別為SNP6（rs2555891 G＞A），SNP7（rs2555961 T＞C），SNP8（rs2555967G＞A），SNP9（rs2556041 C＞T），SNP10（rs2556078 T＞C），SNP11（rs2556088A＞C），SNP12（rs2556093T＞C），SNP13（rs2556109 A＞C），SNP14（rs2556178 G＞T）。

表1 金陵花雞公、母雞毛囊密度比較

同列不同小寫字母表示毛囊密度差異顯著(＜0.05)

Different lowercase letters in the same column indicate that the skin feather follicle density is significantly different (＜0.05)

2.3 Wnt3a SNP位點的遺傳多態性分析

由表2可知，14個SNP位點中，除了SNP2位點在金陵花雞群體中有2種基因型，其他13個SNP位點均有3種基因型。每個SNP位點不同基因型頻率不同。

經H-W平衡檢測，SNP1位點（在第2外顯子）和SNP3、SNP4和SNP5（在第2內含子）均處于H-W平衡狀態（＞0.05），SNP6—SNP14（在第3內含子）偏離H-W平衡（＜0.05）。SNP1—SNP5這5個SNP位點遺傳多樣性較低，因為＜0.50，＜0.25。第3內含子的9個突變位點，除了SNP6、SNP7、SNP9位點＜0.25，其他6個突變位點 0.25＜＜0.5，為中度多態。

2.4 單標記與皮膚毛囊密度性狀的關聯分析

的14個SNPs位點與背部皮膚毛囊密度的關聯性分析結果表明，除了SNP2和SNP8，其他12個SNP位點的毛囊密度無顯著差異。SNP2（rs2587721）位點在公、母雞中均是AG基因型的毛囊密度顯著高于GG基因型（＜0.05）；SNP8（rs2555967）位點在母雞中AA與GG基因型的毛囊密度顯著高于AG基因型（＜0.05），在公雞中3種基因型的毛囊密度差異不顯著。

2.5 連鎖不平衡分析

連鎖不平衡分析結果見圖3。圖3-A方框中的數值為D’值乘以100后得到?？梢?，金陵花雞的14個SNP位點構建了2個連鎖不平衡（LD）Block（單倍型區塊）。Block1由8個SNP位點（SNP6—SNP13）構成，D’值處于0.88—1之間，Block2由3個SNPs位點（SNP3-SNP5）構成，D’值均為1。根據文獻報道，當D’值＞0.8 和2＞0.33時表示SNPs位點間存在強連鎖不平衡[21-22]，本研究兩個單倍區塊型兩兩SNP之間的2值在0.944—1.0之間，表明SNP6—SNP13之間存在強連鎖不平衡，SNP3—SNP5存在強連鎖不平衡。由圖3-B可知，SNP3、SNP4和SNP5的強連鎖產生了2種單倍型，H1（GAT）頻率為0.882和H2（TCC）頻率為0.118；SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14之間的連鎖產生了5種單倍型，其中H1（ACATTATC）、H2（ACGTCCCA）、H3（ACGTTCCA）、H4（GTGCTATA）、H5（ACGTCCCC）單倍型頻率分別為0.469、0.275、0.123、0.113、0.014。

圖2 Wnt3a 14個突變位點測序峰圖

表2 Wnt3a的14個位點遺傳多態性與哈代-溫伯格平衡檢驗

表3 Wnt3a位點與皮膚毛囊密度性狀的關聯分析（平均值±標準誤）

同一位點中同列不同小寫字母表示同一性別不同基因型毛囊密度差異顯著(＜0.05)。下同

Different lowercase letters in the same column in the same site indicate that the skin feather follicle density of different genotypes in the same sex is significantly different (＜0.05). The same as below

A：連鎖圖。方塊顏色由淺至深表示連鎖程度由低到高；數值代表位點間連鎖不平衡的強弱（數值=D’值×100）；B：單倍型分析。線越粗表示相鄰單倍型結合可能性大

2.6 Wnt3a單倍型與毛囊密度性狀關聯分析

SNP3、SNP4和SNP5連鎖產生的2 種單倍型組合后產生了3種單倍型，結果見表4?？梢?，關聯分析發現在公、母雞中3種單倍型組合的毛囊密度均差異不顯著；從表5結果可見，將 SNP6—SNP13處的5種單倍型組合后，個體數小于3的單倍型組合不參與統計與比較，所以公雞有7種單倍型組合，毛孔數量差異不顯著；母雞有8種單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）毛囊密度最大，毛孔數量顯著高于H1H5、H1H4、H2H2和H4H4。由表6結果可見，SNP2和SNP8位點單倍型組合后，公雞有6種單倍型組合，毛孔數量差異不顯著，母雞H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）單倍型組合的毛孔數量顯著高于H2H2（GGAG）和H2H3（GGGG）。

表4 Wnt3a SNP3-SNP5位點單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關聯分析（平均值±標準誤）

表5 Wnt3a SNP6-SNP13位點單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關聯分析（平均值±標準誤）

3 討論

3.1 Wnt3a群體遺傳特征分析

本研究對第2、3外顯子、第2、3內含子進行測序，分析發現14個SNP位點，除了SNP2（rs2587721）位點存在2種基因型GG、AG，其他SNP位點存在3種基因型。H-W平衡檢驗結果顯示，4個SNP位點處 H-W平衡狀態。試驗選擇的金陵花雞是2015年12月20通過的國家畜禽遺傳資源委員會審定的肉雞配套系[23]，沒有對試驗群體進行長期的高強度的人工選擇，因而有些位點表現出在基因組上分布均勻，處于H-W平衡狀態。第3內含子的9個SNP位點偏離H-W平衡（＜0.05），可能是因為試驗群體是人工選種選配，而非自然交配，組成配套系的3個專門化品系經過較長期的選育，導致部分基因型的個體數量偏少所致；另外也可能是試驗群體數目較少造成，下一步將擴大樣本量進行進一步驗證。群體遺傳多樣性的大小代表著群體遺傳豐富度的高低，多樣性越高，則遺傳豐富度也越高，通常用和用衡量這一指標[24-25]。第2外顯子、第2內含子的5個突變位點和均小于0.25，說明這5個SNP位點遺傳多樣性較低。第3內含子的9個突變位點，除了SNP6、SNP7、SNP9位點＜0.25，其他6個突變位點 0.25＜＜0.5，為中度多態?？傮w遺傳變異程度低，這可能是由于參與金陵花雞配套系培育的3個品系經過較長期的人工定向選擇，特別是終端父系的皮膚毛孔密度進行了較高強度的選育，所以導致遺傳多態性較低。

表6 Wnt3a SNP2，SNP8位點單倍型組合與皮膚毛囊密度性狀關聯分析（平均值±標準誤）

3.2 Wnt3a多態性與毛囊密度的關聯性分析

研究發現，Wnt信號通路中的多個SNPs位點與雞屠體性狀相關，其中與胸肌率顯著相關[26]。目前，關于在禽類毛囊生長發育方面的研究相對較少。作者前期對花山麻雞第2、3外顯子、第2、3內含子進行測序，只發現3個SNP位點，其中第3內含子g.2555377 T＞C位點與皮膚毛囊密度顯著相關[16]。本研究用相同的引物對金陵花雞進行PCR擴增與測序，發現14個SNP位點，其中2個SNP位點，SNP2（rs2587721A＞G）和SNP8（rs2555967G＞A）與皮膚毛囊密度顯著相關。品種不同，SNP位點差異顯著，只在第2外顯子發現一個相同的SNP位點（rs2587569 G＞A），其他SNP位點不同；與毛囊密度顯著相關的SNP標記也不同。同時，在第二外顯子存在相同突變位點的基因型不同，在金陵花雞中存在3種基因型（GG、AG、AA），而在花山麻雞中只存在2種基因型（GG、AA）。這可能與2個品種毛囊密度不同有關，花山麻雞公母雞平均毛囊密度為20左右，公母雞毛囊密度差異不顯著；金陵花雞母雞毛囊密度（15.71）顯著高于公雞（14.25），進一步推測是毛囊密度的關鍵候選基因，下一步將在相同品種和不同品種擴大數量進行驗證SNP標記。

基因組中的突變位點絕大多數位于內含子區域，而外顯子相對較保守，本研究在雞中發現的14個突變位點中就有13個位于內含子，可能是因為內含子比外顯子選擇壓力較小，更容易積累變異[27]。與毛囊密度顯著相關的SNP2和SNP8兩個位點突變雖然均在內含子，但也可能影響mRNA翻譯，從而使蛋白質的功能發生變化，進而影響到表型變化[28-29]。

表型的變化可能是單個突變位點引起的，也可能是多個SNPs間的連鎖作用造成的[30]。對突變位點之間進行連鎖不平衡分析能夠鑒別連鎖的位點，連鎖分析后可看出非等位基因間更多位點的相互作用，可更好地綜合分析表型變化原因[31]。本研究連鎖不平衡分析發現：SNP3—SNP5的3個位點，SNP6—SNP13的8個SNP位點間均存在強連鎖，而且連鎖水平很高（2值在0.944—1.0）。諸多因素都會導致群體內的SNP位點間出現連鎖不平衡狀態，如交配模式、群體混合和選擇都將影響群體的連鎖不平衡水平[32]。本研究的試驗材料金陵花雞是三系雜交組合的肉雞配套系，是3個品系的群體混合，3個品系又經過8個世代以上的選育，這可能是多個SNP位點間存在強連鎖水平的重要原因。

經過連鎖產生的單倍型組合與毛囊密度的相關性分析，發現 SNP6—SNP13的強連鎖對雞毛囊密度產生重要影響。 SNP6—SNP13連鎖產生5種單倍型，其中H1單倍型（ACATTATC）頻率最高，為0.469，推斷H1單倍型可能是雞最早出現在祖先中的單倍型[27]。 SNP6—SNP13連鎖產生5種單倍型組合后，對公雞毛囊密度無顯著影響效應，對母雞有顯著影響效應，其中H1H1單倍型（AACCAATTTTAATTCC）在群體中出現頻率最高。雖然SNP2和SNP8不存在強連鎖關系，但將2個位點與雞毛囊密度顯著相關，SNP2和SNP8位點單倍型組合后，對公雞毛囊密度無顯著影響效應，母雞H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為優勢單倍型組合。研究發現SNP6—SNP13聯鎖后產生的單倍型以及SNP2和SNP8位點單倍型組合后，對公雞不存在顯著影響效應，對母雞皮膚毛囊密度產生顯著的遺傳學效應。表型測定結果表明，母雞的平均毛囊密度顯著高于公雞毛囊密度。對雞毛囊密度的影響效應是否有性別效應，需要進一步擴大群體數量，在不同品種中進行驗證。

本研究對與雞毛囊密度顯著相關多個SNP標記進行連鎖分析與單倍型組合分析，除去個體數小于3的單倍型組合，共獲得8種組合類型，其中SNP6— SNP13強連鎖后單倍型組合H1H1單倍型樣本量最多，占群體頻率37.33%，毛囊密度最大。SNP2和SNP8單標記與毛囊密度顯著相關，SNP2和SNP8組合單倍型母雞H1H1、H1H2單倍型組合為優勢單倍型。鑒于多個SNP位點和單倍型組合對雞皮膚毛囊密度產生顯著的遺傳效應，可以考慮將SNP2和SNP8位點母雞組合單倍型H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）以及SNP6—SNP13處的強連鎖產生的H1H1單倍型組合（AACCAATTTTAATTCC）作為選育毛囊密度的重要分子標記，以推動屠宰型肉雞的“分子編寫育種”進展[33]，為加快分子水平的編寫并定向培養屠宰型肉雞新品種，獲得分子雜種優勢，提高育種效率奠定基礎。

4 結論

在第2外顯子、第2、第3內含子共發現14個SNPs。第2外顯子的1個突變位點（SNP1）和第2內含子的3個突變位點（SNP3—SNP5）的3個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態，第3內含子的9個突變位點（SNP6—SNP14）偏離Hardy-Weinberg平衡。SNP2和SNP8位點與皮膚毛囊密度顯著相關，母雞組合單倍型H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）為優勢單倍型。SNP6—SNP13之間存在強連鎖不平衡，H1（ACATTATC）為優勢單倍型，母雞有8種單倍型組合，其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）個體數量最多，占群體頻率37.33%，毛囊密度最大。的SNP2和SNP8位點的H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）和SNP6—SNP13連鎖產生的H1H1（AACCAATTTTAATTCC）單倍型組合可以為母雞皮膚毛囊密度“分子編寫育種”提供遺傳信息。

[1] 文杰. 中國肉雞產業技術創新與發展趨勢. 獸醫導刊, 2020(3): 4-5.

WEN J. Technological innovation and development trend of broiler industry in China. Veterinary Orientation, 2020(3): 4-5. (in Chinese)

[2] 辛翔飛, 鄭麥青, 文杰, 王濟民. 2019年肉雞產業形勢分析、未來展望與對策建議. 中國畜牧雜志, 2020, 56(3): 155-159. doi:10.19556/j.0258-7033.20200217-07.

XIN X F, ZHENG M Q, WEN J, WANG J M. Situation analysis, future prospect and countermeasures of broiler industry in 2019. Chinese Journal of Animal Science, 2020, 56(3): 155-159. doi:10. 19556/j.0258-7033.20200217-07. (in Chinese)

[3] 陳寬維. 黃羽肉雞冰鮮市場展望. 科學種養, 2015(2): 64.

CHEN K W. Prospects for the yellow feather broiler chilled fresh market. Ke Xue Zhong Yang, 2015(2): 64. (in Chinese)

[4] 趙華, 范梅華. 活雞向冰鮮雞消費轉型亟需解決的六大問題. 中國畜牧雜志, 2015, 51(16): 8-10, 14.

ZHAO H, FAN M H. Six problems need to solve during the consumption of chilled chicken replacing live chicken. Chinese Journal of Animal Science, 2015, 51(16): 8-10, 14. (in Chinese)

[5] CHI W, WU E, MORGAN B A. Dermal papilla cell number specifies hair size, shape and cycling and its reduction causes follicular decline. Development, 2013, 140(8): 1676-1683. doi:10.1242/dev.090662.

[6] CHANG C H, JIANG T X, LIN C M, BURRUS L W, CHUONG C M, WIDELITZ R. Distinct Wnt members regulate the hierarchical morphogenesis of skin regions (spinal tract) and individual feathers. Mechanisms of Development, 2004, 121(2): 157-171. doi:10.1016/j. mod.2003.12.004.

[7] FESSING M Y, SHAROVA T Y, SHAROV A A, ATOYAN R, BOTCHKAREV V A. Involvement of the edar signaling in the control of hair follicle involution (catagen). The American Journal of Pathology, 2006, 169(6): 2075-2084. doi:10.2353/ajpath.2006.060227.

[8] YU M, YUE Z, WU P, WU D Y, MAYER J A, MEDINA M, WIDELITZ R B, JIANG T X, CHUONG C M. The biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology, 2004, 48(2/3): 181-191. doi:10.1387/ijdb.031776my.

[9] 陶林, 杜炳旺, 張麗. 卷羽雞毛囊發育規律及卷羽候選基因KRT75遺傳特征分析. 中國農業科學, 2015, 48(4): 821-830.

TAO L, DU B W, ZHANG L. The development of frizzled follicle and genetic characteristics of candidate gene

[10] 蘇蕊, 李金泉, 張文廣, 尹俊, 趙珺, 常子麗. 骨形態發生蛋白2(BMP2)基因在內蒙古絨山羊不同時期皮膚毛囊中的表達. 中國農業科學, 2008, 41(2): 559-563.

SU R, LI J Q, ZHANG W G, YIN J, ZHAO J, CHANG Z L. Expression of BMP2 in the skin and hair follicle from different stage in Inner Mongolia cashmere goat. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(2): 559-563. (in Chinese)

[11] ELLIOTT K, STEPHENSON T J, MESSENGER A G. Differences in hair follicle dermal papilla volume are due to extracellular matrix volume and cell number: implications for the control of hair follicle size and androgen responses. The Journal of Investigative Dermatology, 1999, 113(6): 873-877. doi:10.1046/j.1523-1747.1999. 00797.x.

[12] 姬改革, 束婧婷, 單艷菊, 章明, 屠云潔, 劉一帆, 巨曉軍, 鄒劍敏. 雞皮膚毛囊性狀研究進展. 中國家禽, 2019, 41(10): 46-49. doi:10.16372/j.issn.1004-6364.2019.10.009.

JI G G, SHU J T, SHAN Y J, ZHANG M, TU Y J, LIU Y F, JU X J, ZOU J M. Research progress of skin hair follicle traits in chicken. China Poultry, 2019, 41(10): 46-49. doi:10.16372/j.issn.1004-6364. 2019.10.009. (in Chinese)

[13] JAMORA C, LEE P, KOCIENIEWSKI P, AZHAR M, HOSOKAWA R, CHAI Y, FUCHS E. A signaling pathway involving TGF-beta2 and snail in hair follicle morphogenesis. Journal of Cheminformatics, 2005, 3(1): e11. doi:10.1371/journal.pbio.0030011.

[14] 張小康. Wnt信號通路在鵝皮膚及羽囊早期發育中的功能研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2018.

ZHANG X K. Study on the function of Wnt signaling pathway in the early development of goose skin and feather follicles[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[15] 姬改革, 束婧婷, 單艷菊, 章明, 屠云潔, 劉一帆, 巨曉軍, 鄒劍敏. 基于表達譜芯片篩選雞不同部位皮膚組織差異表達基因. 畜牧獸醫學報, 2018, 49(1): 36-45.

JI G G, SHU J T, SHAN Y J, ZHANG M, TU Y J, LIU Y F, JU X J, ZOU J M. Identification of differentially expressed genes between different positions of chicken skin based on gene expression microarray. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2018, 49(1): 36-45. (in Chinese)

[16] 束婧婷, 姬改革, 屠云潔, 章明, 巨曉軍, 單艷菊, 劉一帆, 鄒劍敏. 雞Wnt3a基因組織表達差異與SNPs對雞毛囊密度性狀的遺傳效應. 中國畜牧獸醫, 2021, 48(5): 1672-1680. doi:10.16431/j.cnki. 1671-7236.2021.05.018.

SHU J T, JI G G, TU Y J, ZHANG M, JU X J, SHAN Y J, LIU Y F, ZOU J M. Tissue expression analysis of Wnt3a gene and genetic effects of SNPs on feather follicle density in chicken. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2021, 48(5): 1672-1680. doi:10. 16431/j.cnki.1671-7236.2021.05.018. (in Chinese)

[17] NEMOTO E, SAKISAKA Y, TSUCHIYA M, TAMURA M, NAKAMURA T, KANAYA S, SHIMONISHI M, SHIMAUCHI H. Wnt3a signaling induces murine dental follicle cells to differentiate into cementoblastic/osteoblastic cells via an osterix-dependent pathway. Journal of Periodontal Research, 2016, 51(2): 164-174. doi:10.1111/jre.12294.

[18] PARK K C, CHOI H R, NA J I, CHO H J, NAM K M, CHOI J W, NA S Y, HUH C H. Effects of murine dermal cells on the regulation of hair growth is dependent on the cell number and post-natal age of newborn mice. Annals of Dermatology, 2012, 24(1): 94-98. doi:10. 5021/ad.2012.24.1.94.

[19] YUE Z, JIANG T X, WIDELITZ R B, CHUONG C M. Wnt3a gradient converts radial to bilateral feather symmetry via topological arrangement of epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(4): 951-955. doi:10.1073/pnas.0506894103.

[20] XIE W Y, CHEN M J, JIANG S G, YAN H C, WANG X Q, GAO C Q. Investigation of feather follicle morphogenesis and the expression of the Wnt/β-catenin signaling pathway in yellow-feathered broiler chick embryos. British Poultry Science, 2020, 61(5): 557-565.

[21] ARDLIE K G, KRUGLYAK L, SEIELSTAD M. Patterns of linkage disequilibrium in the human genome. Nature Reviews Genetics, 2002, 3(4): 299-309. doi:10.1038/nrg777.

[22] MUELLER J C. Linkage disequilibrium for different scales and applications. Briefings in Bioinformatics, 2004, 5(4): 355-364. doi: 10.1093/bib/5.4.355.

[23] 金陵. 金陵花雞配套系. 農村百事通, 2016(17): 33. doi:10.19433/ j.cnki.1006-9119.2016.17.014.

JIN L. Jin Ling Hua chicken cross strain. Nongcun Baishi Tong, 2016(17): 33. doi:10.19433/j.cnki.1006-9119.2016.17.014. (in Chinese)

[24] TU Y J, CHEN K W, ZHANG S J, TANG Q P, GAO Y S, YANG N. Genetic diversity of 14 indigenous grey goose breeds in China based on microsatellite markers. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2006, 19(1): 1-6. doi:10.5713/ajas.2006.1.

[25] ZANETTI E, DE MARCHI M, ABBADI M, CASSANDRO M. Variation of genetic diversity over time in local Italian chicken breeds undergoingconservation. Poultry Science, 2011, 90(10): 2195-2201. doi:10.3382/ps.2011-01527.

[26] LU Y, CHEN S R, LIU W B, HOU Z C, XU G Y, YANG N. Polymorphisms in Wnt signaling pathway genes are significantly associated with chicken carcass traits. Poultry Science, 2012, 91(6): 1299-1307. doi:10.3382/ps.2012-02157.

[27] 孫雪, 李勝杰, 杜金星, 姜鵬, 周家輝, 白俊杰. 草魚GHRH基因SNPs的篩選及其與生長性狀的關聯分析. 農業生物技術學報, 2021, 29(5): 963-972.

SUN X, LI S J, DU J X, JIANG P, ZHOU J H, BAI J J. Screening of SNPs in GHRH and association analysis with growth traits in grass carp(). Journal of Agricultural Biotechnology, 2021, 29(5): 963-972. (in Chinese)

[28] CARTEGNI L, CHEW S L, KRAINER A R. Listening to silence and understanding nonsense: Exonic mutations that affect splicing. Nature Reviews Genetics, 2002, 3(4): 285-298. doi:10.1038/nrg775.

[29] 岳武成, 楊鶴, 侯鑫, 王靜安, 陳曉雯, 王軍, 王成輝. 中華絨螯蟹肌肉抑制素基因()同義突變對基因轉錄和翻譯效率的影響. 水產學報, 2021, 45(4): 497-504.

YUE W C, YANG H, HOU X, WANG J G, CHEN X W, WANG J, WANG C H. Effects of synonymous mutation on transcription and translation efficiency of Es-gene in Chinese mitten crab (). Journal of Fisheries of China, 2021, 45(4): 497-504. (in Chinese)

[30] OROZCO G, HINKS A, EYRE S, KE X, GIBBONS L J, BOWES J, FLYNN E, MARTIN P, WELLCOME TRUST CASE CONTROL CONSORTIUM, YEAR CONSORTIUM, WILSON A G, BAX D E, MORGAN A W, EMERY P, STEER S, HOCKING L, REID D M, WORDSWORTH P, HARRISON P, THOMSON W, BARTON A, WORTHINGTON J. Combined effects of three independent SNPs greatly increase the risk estimate for RA at 6q23. Human Molecular Genetics, 2009, 18(14): 2693-2699. doi:10.1093/hmg/ddp193.

[31] HORNE B D, CAMP N J. Principal component analysis for selection of optimal SNP-sets that capture intragenic genetic variation. Genetic Epidemiology, 2004, 26(1): 11-21. doi:10.1002/gepi.10292.

[32] AKEY J, JIN L, XIONG M M. Haplotypes vs single marker linkage disequilibrium tests: What do we gain? European Journal of Human Genetics, 2001, 9(4): 291-300. doi:10.1038/sj.ejhg.5200619.

[33] 劉志國, 王冰源, 牟玉蓮, 魏泓, 陳俊海, 李奎. 分子編寫育種: 動物育種的發展方向. 中國農業科學, 2018, 51(12): 2398-2409.

LIU Z G, WANG B Y, MU Y L, WEI H, CHEN J H, LI K. Breeding by molecular writing(BMW): The future development of animal breeding. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(12): 2398-2409. (in Chinese)

Screening ofSNPs and Its Association Analysis with Skin Feather Follicle Density Traits in Chicken

TU YunJie1, JI GaiGe1, ZHANG Ming1, LIU YiFan1, JU XiaoJun1, SHAN YanJu1, ZOU JianMin1, LI Hua2, CHEN ZhiWu3, SHU JingTing1

1Key Laboratory of Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Jiangsu Institute of Poultry Sciences, Yangzhou 225125, Jiangsu;2Foshan University, Foshan 528225, Guangdong;3Guangxi Jinling Agriculture and Animal Husbandry Group Co., Ltd., Nanning 530000

【Objective】The Wnt signaling pathway plays an important role in the development of animal skin feather follicles. The results of previous studies indicated that themight be an important candidate gene that had effects on the chicken feather follicle density. In order to further verify the role ofin the growth and development of skin feather follicle density,SNPs were screened and their association with feather follicle density would be analyzed in Jinling Hua chicken. The study could provide a reference for “breeding by molecular writing” of slaughter-type broilers with beautiful carcasses.【Method】The SNPs ofgene were screened by PCR amplification and direct sequencing, and the correlation between a single SNP marker and skin feather follicle density traits was analyzed. Haploview software was used to analyze the degree of linkage disequilibrium (LD) of these SNP loci, and the correlation between different haplotype combinations and feather follicle density traits was also analyzed. 【Result】A total of 14 SNP sites were found, and one SNP site (SNP1) was found in the second exon, which was a synonymous mutation. Four mutation sites (SNP2-SNP5) were found in the second intron, and 9 SNP sites (SNP6-SNP14) were found in the third intron. The chi-square test showed that one mutation site (SNP1) in the second exon and three mutation sites (SNP3-SNP5) in the second intron were all in the Hardy-Weinberg equilibrium (＞0.05), 9 mutation sites (SNP6-SNP14) of the third intron deviated from Hardy-Weinberg equilibrium (＜0.05). The expected heterozygosity () of SNP1-SNP5 was less than 0.50, and the polymorphic information content () was less than 0.25. The genetic polymorphisms of these 5 SNP loci were low. The third intron had 9 mutation sites,of SNP6, SNP7, SNP9 sites was less than 0.25, and the other 6 mutation sites were 0.25＜＜0.5, which were moderately polymorphic. Single-marker association analysis showed that the number of skin feather follicle with SNP2 locus of AG genotype in males and females was significantly higher than that of GG genotype (＜0.05). The number of skin feather follicles with SNP8 locus of AA and GG genotypes in females was significantly higher than that of the AG genotype (＜0.05). The skin feather follicles density in the three genotypes in males was not significantly different. The linkage disequilibrium analysis of 14 SNPs showed that SNP6-SNP13 and SNP3-SNP5 had a strong linkage disequilibrium, respectively. SNP3, SNP4, and SNP5 produced three haplotype combinations after the combination of the two haplotypes linked by SNP3- SNP5. Association analysis found that the skin feather follicle density of the three haplotype combinations in males and females were not significantly different. After the combination of 5 main haplotypes at SNP6-SNP13 locus, the males had 7 haplotype combinations, and the skin feather follicles density was not significant. Females had 8 haplotype combinations, of which H1H1 (AACCAATTTTAATTCC) had the highest skin feather follicles density. SNP2 and SNP8 were significantly correlated with skin feather follicle density, and the haplotype combination H1H1(AGAA) and H1H2 (AGAG) were the dominant haplotypes in hens.【Conclusion】Fourteen SNPs ofwere screened. Among them, individuals with different genotypes at rs2587721 G＞A (SNP2) and rs2555967G＞A (SNP8) locus had significant differences in feather follicle density. Eight SNPs (SNP6-SNP13) loci were in strong linkage disequilibrium, and the combination of H1H1 had the highest feather follicles density in females. The haplotype combination of SNP2 and SNP8 ofH1H (AGAA), H1H2 (AGAG) and SNP6-SNP13 linked to produce the H1H1 (AACCAATTTTAATTCC) haplotype combination were significantly correlated with feather follicle density in females, which provided important genetic information for “breeding by molecular writing” on chicken skin feather follicle density.

chicken;; skin feather follicle; SNP sites; linkage disequilibrium

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.016

2021-09-13；

2022-05-27

江蘇省農業重大新品種創制項目（PZCZ201728）、揚州市現代農業項目（YZ2021029）、江蘇現代農業（肉雞）產業技術體系（JATS[2020]357）、現代農業產業技術體系建設專項（CARS-41）、江蘇省農業自主創新基金（CX(21)2011-1）、江蘇省自然科學基金（BK20210955）、江蘇省種業振興揭榜掛帥項目（JBGS（2021）107）

屠云潔，E-mail：tyj3030@126.com。通信作者束婧婷，E-mail：shujingting@163.com

（責任編輯 林鑒非）