基于常壓室溫等離子體誘變提高馬克斯克魯維酵母的乙醇耐受性

＊洪霞 茍敏 湯岳琴*

（1.中石化上海工程有限公司 上海 200120 2.四川大學建筑與環境學院 四川 610207 3.四川省環境保護有機廢棄物資源化利用重點實驗室 四川 610207）

燃料乙醇是燃燒清潔的高辛烷值燃料，有辛烷值高、抗爆性能好等優點，是一種可再生能源。但因其生產成本較高，相對汽油無明顯價格優勢，因此，目前還缺乏市場競爭力。高溫高濃度乙醇發酵技術可降低乙醇生產中冷卻、精餾等過程的投入和能耗，同時減少廢液的排放，降低污水處理成本，是目前燃料乙醇生產技術領域最具發展潛力的技術之一[1]。

耐高乙醇、耐高溫菌株是實現高溫高濃度乙醇發酵的基礎。利用生物質生產燃料乙醇的研究主要以釀酒酵母為主，雖然其能耐受較高的乙醇濃度，但其發酵溫度一般在30～35℃。與釀酒酵母相比，馬克斯克魯維酵母具有耐高溫（45～48℃）、可利用多種六碳糖和五碳糖等特點，近年來逐漸被燃料乙醇的研究者們所關注[2]。但馬克斯克魯維酵母的耐乙醇能力相對較差，有采用自然選育、基因工程、馴化等手段提高克魯維酵母的乙醇發酵能力的報道[3-4]，但目前對馬克斯克魯維酵母乙醇耐受性提高的研究還很有限[5-6]。乙醇耐受分子機制復雜，改變一個或少數幾個基因的表達，難以達到目的，對細胞進行全局優化和調控才有可能獲得目標表型的菌株。Mo等[5]通過在乙醇脅迫條件下的100天的反復傳代培養，獲得了乙醇耐受能力得到提高的馬克斯克魯維酵母菌群KM-100d，該菌群在30℃發酵時，耐受6%和8%初始乙醇濃度的能力有明顯提升。但是利用馬克斯克魯維酵母進行乙醇發酵是基于高溫條件才能發揮其優勢，因此提升其在高溫發酵條件下乙醇的耐受是實現其工程應用的基礎。高溫和乙醇對酵母都會產生脅迫，當兩者同時存在時會產生協同抑制作用，因此提升酵母在高溫條件下乙醇的耐受能力比較困難。Li等[6]通過建立TATA-結合蛋白Spt15的突變庫并轉化馬克斯克魯維酵母，篩選獲得一株在45℃條件下耐受乙醇能力得到提升的菌株M2，其發酵停止的乙醇濃度為57g/L，而出發菌株的發酵停止乙醇濃度為47g/L。由于相關研究非常有限，針對如何能成功地提升馬克斯克魯維酵母在高溫發酵條件下的乙醇耐受能力尚沒有很好的對策，需要更多的技術嘗試和探索。

紫外照射等物理誘變或甲基磺酸乙酯處理等化學誘變是獲取突變菌株的重要途徑，特別是當目標表型的分子機制不清的情況下，具有重要意義。相比傳統的物理或化學誘變方法，常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術作為一種新型的生物誘變技術，具有突變頻率高、遺傳穩定性好、快速安全等特點，已應用于多種生物的誘變選育[7]，在產油酵母、釀酒酵母誘變方面已有成功案例[8-10]。金麗華等[8]使用ARTP技術誘變產油酵母，在致死率為99%的情況下，通過比較突變菌株和出發菌株的生長速度，發現酵母細胞的正突變率為27.2%，突變菌株的產脂率可提高118%。Liu等[9]結合ARTP誘變和高通量篩選，獲得了一株積累乙醛能力較低的突變釀酒酵母LAL-8a。與野生型相比，突變菌株的乙醇脫氫酶活性降低54%，醛脫氫酶活性提高64%，乙醛積累量減少88.2%。Wang等[10]利用ARTP誘變結合基因組重排獲得了耐乙醇、耐高溫、耐高糖和耐高鹽的多重耐受釀酒酵母菌株。但到目前為止，ARTP誘變技術在馬克斯克魯維酵母的應用尚未有報道。

本研究前期工作中對多株馬克斯克魯維酵母進行了高溫耐受性、乙醇耐受性、利用各種糖能力的評價，篩選出了一株各方面性能均較好的菌株。本文以該菌株為出發菌株，對其進行了ARTP誘變，通過平板培養初篩、液體培養復篩、搖瓶發酵等對突變菌株進行了篩選，獲得了乙醇耐受得到提升的突變菌株，為后續的進一步性能優化提供了菌株來源。

1.材料與方法

(1)培養基

2% YPD平板培養基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂。用于酵母的活化。

5% YPD液體培養基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，5%葡萄糖。用于酵母的預培養。

含乙醇選擇培養基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂。培養基滅菌后加入用0.22μm濾膜過濾的無水乙醇，制成含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V）、7%（V/V）、8%（V/V）乙醇的平板培養基。

復篩培養基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。培養基滅菌后加入用0.22μm濾膜過濾的無菌無水乙醇制成含4%（V/V）乙醇的液體培養基。

發酵培養基：2%酵母粉，4%蛋白胨，15%葡萄糖。培養基滅菌后加入用0.22μm濾膜過濾的無水乙醇制成含3%（V/V）乙醇的液體培養基。

上述所有培養基的滅菌條件為121℃，15min。

(2)菌株及評價方法

①菌株

實驗室保藏的馬克斯克魯維酵母菌株KM1。

②菌株KM1生長曲線的測定

將保存的酵母菌株接種于2% YPD平板培養基，45℃恒溫培養箱活化培養24h，挑選活化的細胞接種至2% YPD液體培養基中，置于160rpm的45℃恒溫搖床中進行預培養16h。收集細胞，轉接至5% YPD液體培養基中（初始OD660為0.05），置于45℃、180rpm恒溫搖床培養，定時采樣，在660nm波長下測定吸光度（OD660）值。以時間為橫坐標、OD660值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

③ARTP誘變處理

利用ARTP等離子體誘變儀（ARTP-M）對酵母細胞進行誘變，誘變時工作氣體為氦氣，產生的等離子體溫度在25～ 35℃之間。將菌株在2% YPD平板，45℃恒溫培養箱活化16h，取細胞接種于5% YPD液體培養基中，放入45℃、180rpm恒溫搖床中，預培養12h。取1mL菌懸液于無菌離心管中，離心10min，菌體用無菌生理鹽水洗滌兩遍，取10μ L菌懸液至照射玻片上涂勻，設置處理時間分別為0s、30s、60s、90s、120s、150s，對其進行誘變處理。將處理后的玻片放入1mL的生理鹽水中保存，每個處理時間均有三組平行樣，最后進行混合。取0.1mL混合后的菌懸液稀釋10-1和10-2兩個梯度，均勻涂布于2% YPD固體培養基上，放入45℃培養箱中培養24h，對菌落進行計數。與出發菌株進行對比，計算出經ARTP誘變后酵母細胞的存活率。以處理時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制致死率曲線。在適宜誘變處理時間下，建立菌株的等離子體誘變突變庫，將誘變后的菌液制作成菌保，于-80℃冷凍保存，備初篩、復篩用。

④突變菌株平板生長初篩

取誘變后的細胞液0.2mL接種于5% YPD液體培養基中，45℃、180rpm恒溫搖床培養24h，取對數期的1mL菌懸液分別稀釋10-2、10-3，各取0.1mL涂布于含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V），7%（V/V）、8%（V/V）乙醇的2% YPD平板培養基（每組5個平行），放入45℃培養箱中培養48h。挑選出86個比出發菌株生長情況好的菌落，轉移至2% YPD平板培養基中培養。

⑤突變菌株液體生長復篩

將挑選的突變菌株和原菌株進行預培養，收集細胞，接種于5mL含4%（V/V）乙醇的5% YPD液體培養基中（初始OD660約0.05），在45℃，30rpm條件下，于小型恒溫振蕩儀培養36h，測量其OD660值。選取OD660值大于出發菌株的5株突變菌株進行后續搖瓶發酵。

⑥突變菌株的搖瓶發酵

將各菌株接種于2% YPD平板培養基中45℃恒溫培養箱活化24h。挑取細胞接種于5% YPD液體培養基，45℃、160rpm預培養12h。取10mL預培養液，5000rpm離心去上清液，稱菌體重量。稱取0.25g（濕重）細胞接種到裝有100mL含3%（V/V）乙醇的15% YPD液體培養基的300mL三角瓶中，置于45℃、200rpm水浴鍋發酵，24h后分析細胞量、殘糖和乙醇濃度。

(3)分析方法

①細胞濃度測定

取2mL菌懸液于2ml離心管，稀釋一定倍數使得吸光度值小于1，用UV-VIS分光光度計（JASCO，Japan）在660nm波長下測定吸光度值OD660。

②還原糖和乙醇質量濃度分析

發酵液離心后分別收集上清液，用0.22μ m的濾膜過濾后用于乙醇和殘糖質量濃度分析。葡萄糖質量濃度利用高效液相色譜儀（LC-10AD VP，島津，日本）進行分析，檢測器為熒光檢測器RF-10AXL，流動相為硼酸緩沖液，反應液是硼酸和精氨酸的混合液。檢測條件：爐溫為150℃，柱溫為65℃。用1g/L葡萄糖標樣，外標法計算葡萄糖含量。

乙醇質量濃度利用氣相色譜儀（GC353B，GL sciences，日本）進行分析，用異丙醇作為內標。檢測條件：氦氣作為載氣，氫氣作為燃氣，爐溫為50℃，注射器為180℃，檢測器溫度為180℃。

根據所測葡萄糖和乙醇的質量濃度，按以下公式計算乙醇收率：

2.結果和討論

(1)馬克斯克魯維酵母菌株KM1的生長曲線和ARTP處理時間對菌株存活率的影響

菌株KM1的生長曲線如圖1（a）所示。在5% YPD中，培養12h后該菌株處于對數生長期后期。此時細胞生長繁殖旺盛，對外界環境的影響相對比較敏感，在此階段對細胞進行等離子體誘變處理，可以增加基因突變與穩定遺傳的幾率。將未經等離子體輻照和經等離子體輻照30s、60s、90s、120s、150s的菌懸液涂布于2% YPD固體培養基中，培養48h，計算菌落的個數，得到不同等離子體輻照時間下細胞的存活率，如圖1（b）所示。可以看出，當處理時間為60s時，細胞存活率為2%，60s的處理時間可以用于突變細胞庫的構建。相比釀酒酵母[10]，菌株KM1對常溫等離子體輻射相對更敏感。

圖1 菌株KM1的生長曲線（a）和ARTP處理時間對菌株存活率的影響（b）Fig.1 Growth curve of strain KM1 (a) and the effect of ARTP treatment time on cell viability (b)

(2)馬克斯克魯維酵母突變菌株的乙醇平板初篩

選取60s的照射時間進行細胞誘變處理。取誘變后的細胞懸液0.2mL接種于5% YPD液體培養基中，45℃、180rpm恒溫搖床培養24h，細胞濃度達到17（OD660）。取1mL菌懸液稀釋102和103倍，取0.1mL涂布于含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V），7%（V/V），8%（V/V）乙醇的2% YPD平板培養基。置于45℃培養箱中培養48h。

當2% YPD固體培養基中乙醇體積分數小于6%時，細胞的生長幾乎沒有受到影響，菌落生長密集。乙醇體積分數為8%時，細胞生長受到強烈抑制，無菌落生長。因此，從乙醇體積分數為7%（v/v）的YPD平板上將生長明顯優于出發菌株的86株突變菌株挑出，進行下一步的復篩研究。

(3)馬克斯克魯維酵母突變菌株的液體生長復篩

對從乙醇平板上初篩得到的突變菌株，在45℃，含4%（V/V）乙醇的5% YPD液體培養基中進行培養，比較它們的生長情況。圖2為出發菌株和所有突變菌株在36h的細胞濃度（OD660）數據。

圖2 出發菌株和突變菌株在含4%（V/V）乙醇的5% YPD培養基中培養36h后的細胞濃度Fig.2 Cell density of original and mutant strains cultivated for 36 h in 5% YPD medium containing 4% (V/V) ethanol

在含4%（V/V）乙醇的抑制條件下，生長至36h后，初篩得到的86株突變菌株中有57株的OD值大于出發菌株（OD660=3.31）。其中M02、M16、M32、M40和M48的OD660超過了4.0，針對這5株突變菌株，進行了下一步的搖瓶發酵評價。乙醇平板初篩和液體生長復篩的結果表明，ARTP誘變可產生有利于馬克斯克魯維酵母在乙醇脅迫下生長的突變，對于提升菌株的乙醇耐受能力是有效的。當然，從生長結果也可看出，ARTP誘變并未獲得在4%（V/V）乙醇脅迫條件下細胞生長得到非常明顯提升的突變子。這點和釀酒酵母的ARTP誘變結果類似，一次ARTP誘變在提高釀酒酵母的乙醇耐受性方面提高幅度也是比較有限的[10]。

(4)馬克斯克魯維酵母突變菌株的搖瓶發酵

在45℃，出發菌株和突變菌株利用含3%（V/V）初始乙醇的15% YPD液體培養基發酵24h后的結果，如表1所示。可以看出，除M02外，其他四株突變菌株的生長情況略優于出發菌株，OD660的提升率為6.9%～15.8%。糖消耗速率方面，有三株明顯優于出發菌株，提高6.30%～15.7%，有兩株低于出發菌株，特別是M48，比出發菌株低了15.7%。但是糖消耗速率和細胞濃度之前不存在相關性。在乙醇收率方面，所有突變菌株的乙醇收率均高于出發菌株，但提升幅度不一，19.1%～58.0%，糖消耗速率較慢的兩株突變菌株的乙醇收率相對更高。從以上結果可以看出，ARTP誘變對細胞代謝的影響，在細胞生長、糖的利用、乙醇積累三個方面均有表現。突變菌株在表型上具有多樣性，可能是不同突變菌株可具有不同突變位點所導致的。五株突變菌株表型各有優勢，M02和M48在乙醇收率上有顯著優勢，而M16、M32和M40在糖的消耗速率上有顯著優勢。后續可以以這5株突變菌株為出發菌株，通過其他技術手段如基因組重排等獲得更優的高乙醇耐受馬克思克魯維酵母菌株。

表1 出發菌株和突變菌株利用含3%（V/V）初始乙醇的15% YPD培養基發酵24h后的結果Tab.1 Fermentation results of original and mutant strains when using 15% YPD medium containing 3% (V/V) ethanol

目前尚未有通過物理或化學誘變提升馬克斯克魯維酵母乙醇耐受能力的研究報道。相比乙醇脅迫條件下的馬克斯克魯維酵母的自然馴化突變或基于全局轉錄調控因子的隨機突變改造[5-6]，本研究利用ARTP誘變技術，可以獲得表型多樣的耐乙醇馬克斯克魯維酵母突變菌株，為整合有益突變獲得更優秀菌株提供了可能，也為進一步改造提供了性能多樣的出發菌株資源。

3.結論

高溫高濃度乙醇發酵對于降低燃料乙醇生產成本提高其生產經濟效益具有重要意義。為滿足高溫高濃度乙醇發酵對發酵菌株耐高乙醇濃度、耐高溫的要求，本文以前期篩選出的耐高溫馬克斯克魯維酵母菌株KM1為出發菌株，探討了常溫等離子體（ARTP）誘變提升其乙醇耐受性的可行性。結果表明，菌株KM1對ARTP誘變敏感，60s的處理條件下，存活率僅為2%。誘變后獲得了大量在4%（V/V）乙醇脅迫條件下生長優于出發菌株的突變菌株，但最高提升率僅約20%，未發現生長顯著提高的突變菌株。乙醇脅迫條件下的發酵評價結果表明，突變菌株表現均優于出發菌株，24h內的乙醇積累量高出出發菌株37.9%～47.5%。但突變菌株間表型差異明顯，特別在糖利用速率以及乙醇收率上差異顯著，各有優勢。本研究所獲得的突變菌株為后續通過其他技術手段如基因組重排等獲得更優的高乙醇耐受馬克斯克魯維酵母菌株提供了基礎。