豬肌肉干細胞在三維水凝膠中的分化研究

陳彧，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，郭赟，丁世杰，周光宏

豬肌肉干細胞在三維水凝膠中的分化研究

陳彧，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，郭赟，丁世杰，周光宏

南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院/國家肉品質量安全控制工程技術研究中心/教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，南京 210095

【目的】探究豬肌肉干細胞在三維水凝膠中的分化效果，為體外誘導肌肉干細胞分化成為肌肉組織提供方法指導。【方法】將一定數(shù)目的豬肌肉干細胞分別在二維和三維條件下誘導分化（二維條件指在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，三維條件指在水凝膠中培養(yǎng)細胞），分別收取增殖階段、預分化階段、分化初期、分化成熟、分化末期的二維培養(yǎng)細胞的RNA和蛋白樣品，以及分化7和14 d的三維培養(yǎng)細胞的RNA和蛋白樣品。利用RT-qPCR技術檢測細胞在兩種條件下分化至不同階段時成肌相關基因、、、的表達水平；利用Western Blot技術檢測細胞在兩種條件下分化至不同階段時MYOG、MyHC蛋白的表達水平；利用免疫熒光染色技術觀察豬肌肉干細胞在二維和三維條件下融合形成的肌管；使用氨基酸自動分析儀檢測分化14 d培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸含量及組成。【結果】二維培養(yǎng)的豬肌肉干細胞在分化第3天時開始發(fā)生肌融合，在分化第7天形成成熟肌管，隨后進入分化末期，肌管開始脫落。三維培養(yǎng)的豬肌肉干細胞在分化第7天時還未完全伸展，細胞的和表達水平低；分化第14天時水凝膠內(nèi)已形成多核肌管，和表達達到二維分化水平。三維分化有利于終末分化基因和的表達，分化14 d時的表達量是二維分化7 d的12倍，的表達量是二維分化7 d的4倍，但是MyHC蛋白的表達量僅為二維分化7 d時的1/6。氨基酸分析結果表明體外培養(yǎng)肌肉組織中17種水解氨基酸含量均低于豬肉，且必需氨基酸在總氨基酸的占比也低于豬肉，但是呈味氨基酸的占比相較豬肉更高。【結論】豬肌肉干細胞可以在三維膠原水凝膠中分化形成肌管，且三維條件有利于成肌分化相關基因表達，但要實現(xiàn)MyHC蛋白的高表達還需進一步研究，按此方法體外培養(yǎng)的肌肉組織有較高的呈味氨基酸含量，可能會有較好的風味。

豬肌肉干細胞；分化；水凝膠；肌管；細胞培養(yǎng)肉

0 引言

【研究意義】細胞培養(yǎng)肉是根據(jù)肌肉自我修復機理，通過動物上提取的干細胞在體外進行擴增培養(yǎng)和誘導分化形成肌纖維而生產(chǎn)的肉類，其無需通過動物養(yǎng)殖，具有環(huán)保、節(jié)能、高效、安全等諸多潛在優(yōu)點[1]。肌肉干細胞是一種需要錨點的細胞，必須附著在一定基質或者附著在支架上才能增殖分化[2]。因此，要實現(xiàn)肌肉干細胞在體外分化形成肌肉組織，需要選用合適的支架對肌肉干細胞進行三維培養(yǎng)。【前人研究進展】細胞培養(yǎng)中常用天然水凝膠作為支架[3]，如膠原蛋白、血纖蛋白等，這樣的體系有利于肌細胞分化的融合和收縮[4]。早在1988年就有研究通過使用膠原對二維培養(yǎng)的禽類骨骼肌細胞分化形成的肌管進行包被，將肌管的培養(yǎng)時間從5—6 d延長至2—3周，實現(xiàn)了類似于三維培養(yǎng)的效果[5]。OKANO等[6]將C2C12小鼠成肌細胞和I型膠原混合注入毛細管模具中，構建了一種桿狀的水凝膠體，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，得到了可觀察到多核肌管的肌肉組織。還有研究通過將多層三維水凝膠中培養(yǎng)的牛肌肉組織進行堆疊，制作出了具有一定厚度的培養(yǎng)肉牛排[7]。除了水凝膠支架外，常見的可用于肌肉干細胞培養(yǎng)的支架還有明膠纖維支架[8]、植物蛋白支架[9]等，相關研究還報道了在脫去細胞的植物組織上進行肌細胞的三維培養(yǎng)[10-12]。【本研究切入點】目前的研究較多通過組織染色或免疫熒光染色觀察肌細胞融合后形成的肌管來表征肌肉干細胞在三維條件下的分化效果，但是這種方法不能較為準確地評價肌細胞的分化程度，且大部分關于肌細胞三維培養(yǎng)研究使用的細胞為小鼠成肌細胞C2C12，而生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉需要培養(yǎng)更符合人類食用習慣的物種的肌肉干細胞，如、雞、鴨、豬、牛、羊等畜禽類和魚類。【擬解決的關鍵問題】本研究利用一種基于膠原水凝膠用于豬肌肉干細胞的體外三維培養(yǎng)體系，通過RT-qPCR、Western blot、免疫熒光染色的方法來表征豬肌肉干細胞在水凝膠中的分化水平，并與二維分化的細胞進行對比以評價三維條件下的分化效果，為將來實現(xiàn)肌肉干細胞體外大規(guī)模分化生產(chǎn)細胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品提供方法指導。

1 材料與方法

試驗于2021年在南京農(nóng)業(yè)大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心進行。

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 七日齡幼豬，幼豬品種為約克夏豬，由蘇食集團生豬養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、F10培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、100×雙抗（PS）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），購于美國GIBCO公司；鼠尾I型膠原、Matrigel，購于美國CORNING公司；膠原酶D、消散酶II，購于美國Roche公司；濃鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、曲拉通X-100，購于國藥集團化學試劑有限公司；脫脂奶粉、Trizol、DMSO（細胞培養(yǎng)級），購于索萊寶公司；牛血清白蛋白（BSA）購于美國SIGMA公司；RIPA裂解液（強）、PMSF，購于上海碧云天生物技術有限公司；培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒、SuperSignal? West Pico PLUS 化學發(fā)光底物，購于美國Thermo公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（貨號Q311-02）、HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（貨號R323-01），購于Vazyme公司；Loading buffer、彩虹預染蛋白Marker（10—250 kD）、Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、4%—20% SurePAGE?蛋白預制膠、免疫印跡PVDF膜、平衡液、轉膜液、TBST，購于南京金斯瑞生物科技有限公司；MyHC一抗（貨號：ab37484）、MYOG一抗（貨號：ab238027）購于Abcam公司；GAPDH一抗（貨號：MAB374）購于Millipore公司；鼠二抗（貨號：CW2333S）購于Cwbiotech公司；免疫熒光鼠二抗（貨號：A11005），購于美國Thermo公司；Antifade Mounting Medium with DAPI，購于Vector公司；鬼筆環(huán)肽購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬肌肉干細胞的分離與分選 將剛屠宰幼豬在75%乙醇中浸泡消毒后轉移至超凈臺中，切取幼豬前后腿部的肌肉組織，并將其置于裝有DMEM的離心管中漂洗2—3 min。將漂洗后的肌肉組織轉移至盛有DMEM的培養(yǎng)皿中，用滅菌的手術剪將肌肉組織剪碎，并將剪碎后的肌肉組織收集至裝有DMEM的離心管中。向離心管中加入1/6體積的膠原酶D和消散酶II溶液（濃度均為10 mg?mL-1），混勻后反復抽吸肌肉組織，然后將離心管轉移至37℃培養(yǎng)箱中孵育，每孵育15 min反復抽吸一次，直至溶液可順利通過30 mL帶針頭的注射器。加入5 mL基礎培養(yǎng)基（15% FBS+84% F10+1% PS）和適量PBS稀釋酶解后的肌肉組織，并使用100 μm細胞濾器過濾溶液，濾液經(jīng)過800×離心5 min后吸除上清液取沉淀。向離心管中加入5 mL紅細胞裂解液重懸沉淀，裂解5 min后經(jīng)800×離心5 min后吸除上清液取沉淀，用PBS清洗沉淀1—2次。使用40 μm細胞濾器過濾，使用血球計數(shù)板對濾液中細胞進行計數(shù)，按照計數(shù)結果將單細胞以1×107的接種量接種至預裝有8 mL基礎培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中用于流式分選，剩余細胞經(jīng)過800×離心5 min后取細胞沉淀，按照1×106/mL凍存細胞。單細胞在培養(yǎng)的第2進行流式分選，首先用0.25%的胰蛋白酶消化細胞并用基礎培養(yǎng)基終止消化反應，300×離心5 min后收集細胞沉淀。用含1% BSA的PBS溶液稀釋的CD56-PE、CD29-488、CD31-APC、CD45-647熒光抗體1 mL重懸細胞，在冰上孵育30 min，300×離心5 min后用PBS溶液清洗2次，清洗后用300 μL含3%雙抗的基礎培養(yǎng)基重懸細胞并上機檢測（Aria II SORP 流式細胞儀，美國BD公司），分選出CD56+、CD29-、CD31-、CD45-的豬肌肉干細胞為P0代細胞。

1.2.2 豬肌肉干細胞的體外增殖培養(yǎng) 復蘇P2代豬肌肉干細胞，以1.5×105的接種量接種細胞到預鋪了0.05%鼠尾I型膠原的10 cm培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿中預先加入8 mL增殖培養(yǎng)基（15% FBS+84% F10+1% PS，bFGF濃度5 ng?mL-1）。然后將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d對細胞進行換液，當細胞匯合度達到約40%時對細胞進行傳代。傳代時先使用0.25%胰蛋白酶將細胞從培養(yǎng)皿上消化下來，收集細胞并使用臺盼藍對細胞進行染色，用血球計數(shù)板計算活細胞數(shù)目，然后按照1.5×105的接種量接種到新的預鋪膠原培養(yǎng)皿中。將細胞傳代至P5代并增殖至足夠數(shù)量，以P5代細胞作為研究對象。

1.2.3 豬肌肉干細胞的體外二維分化 將3×105的P5代豬肌肉干細胞接種到預鋪了0.02% Matrigel的3.5 cm培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿中預先加入2 mL增殖培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d對細胞進行換液。當細胞匯合度達到約90%時更換為分化培養(yǎng)基（2% HS+97% DMEM+1% PS），每2 d進行一次半換液。

1.2.4 豬肌肉干細胞的體外三維分化 用DMEM培養(yǎng)基將鼠尾I型膠原濃度稀釋到2 mg?mL-1，并用1 mol?L-1NaOH溶液調節(jié)膠原pH至7.4。將9×106的P5代豬肌肉干細胞和1 800 μL膠原溶液，160 μL Matrigel混勻后接入定制的模具中，待其凝固后加入4 mL增殖培養(yǎng)基。然后將其放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后將增殖培養(yǎng)基吸出更換為分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d進行一次半換液。

1.2.5 RT-qPCR檢測相關基因的表達量 二維培養(yǎng)細胞直接使用Trizol裂解液裂解，三維培養(yǎng)細胞使用Trizol裂解液裂解，并用冷凍破碎儀破碎樣品。按照天根的培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒的操作流程提取樣品的總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度；使用Vazyme公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑，按照技術說明書對RNA進行逆轉錄，得到cDNA；使用Vazyme公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑，按照技術說明書進行qPCR反應，使用2-△△CT方法計算目的基因的相對表達量（基因及引物信息見表1）。

表1 RT-qPCR引物信息表

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白的表達 二維培養(yǎng)細胞直接用RIPA裂解液（使用時加入1% PMSF）裂解細胞，三維培養(yǎng)細胞使用PIRA裂解液（使用時加入1% PMSF）裂解并使用冷凍破碎儀破碎樣品。將裂解后的樣品在12 000 r/min轉速離心5 min后收集上清液，使用BCA試劑盒檢測樣品蛋白質濃度，并加入Loading buffer在95℃下加熱5 min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后通過快速濕轉移將蛋白轉印至PVDF膜上，切取對應蛋白分子量的條帶（MyHC：220 kD；MYOG：34 kD；GAPDH：36 kD）置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后4℃下孵育一抗14 h（一抗稀釋比例為1﹕1 000），室溫孵育二抗2 h（二抗稀釋比例為1﹕2 000），二抗孵育結束后顯影并拍照，使用Quantity one軟件進行蛋白條帶的灰度值分析。

1.2.7 免疫熒光染色觀察肌細胞的融合情況 二維培養(yǎng)樣品和三維培養(yǎng)樣品用PBS清洗干凈后均用4%多聚甲醛固定過夜，固定后的樣品用PBS清洗后，使用0.5% Triton X-100通透30 min，然后用5% BSA溶液封閉30 min，MyHC一抗孵育（一抗稀釋比例為1﹕800，4℃下孵育12 h）；二抗孵育（二抗稀釋比例為1﹕1 000，室溫避光孵育1 h）；F-actin染色（鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育20 min）；滴加含DAPI的防熒光猝滅劑，蓋上蓋玻片，在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.8 氨基酸組成分析 分別取適量的分化14 d三維培養(yǎng)肌肉和新鮮豬肉（取自豬背最長肌）于頂空瓶中，加入3 mL的6 mol?L-1HCl，抽真空并通入氮氣，在110℃水解23 h。將水解后的樣品稀釋到25 mL，取1 mL稀釋液進行氮吹，吹至干燥后用1 mL的0.02 mol?L-1HCl復溶。復溶后過0.22 μm水相濾膜，將濾液收集至液相小瓶中，使用HITACHI-L8900氨基酸自動分析儀對樣品的氨基酸組成和含量進行測定分析。

1.3 統(tǒng)計分析

使用SAS軟件，采用One-way ANOVA檢驗方法對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，使用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。每組試驗均設置3個生物學重復，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示；圖中不同字母表示兩組數(shù)據(jù)平均值間存在顯著性差異（＜0.05）。

2 結果

2.1 二維條件下豬肌肉干細胞不同分化階段的形態(tài)學觀察

在光學顯微鏡下觀察處于不同分化階段的豬肌肉干細胞，處于增殖期的豬肌肉干細胞，可觀察到其細胞形態(tài)主要為中間寬、兩端拉長的梭形或者紡錘形，為干細胞的正常形態(tài)（增殖階段，圖1-A）；當細胞匯合度達到90%以上時，細胞進行大規(guī)模接觸（預分化階段，圖1-B），此階段開始誘導分化；分化第3天可觀察到細胞伸展更具方向性，并開始發(fā)生肌融合，能觀察到較為細小的肌管形成（分化初期，圖1-C）；分化第4天已經(jīng)能觀察到大面積肌融合的發(fā)生，開始生成較粗較長的多核肌管（圖1-D）；分化第7天，肌細胞的融合程度達到最高，產(chǎn)生的肌管長度和直徑都達到較高水平（分化成熟，圖1-E）；分化第8天，可以觀察到肌管已經(jīng)開始大面積地脫落并聚成團狀漂浮在培養(yǎng)基中（分化末期，圖1-F）。

A：處于增殖期的豬肌肉干細胞（成肌細胞）；B：分化0 d（預分化）；C：分化3 d；D：分化4 d；E：分化7 d；F：分化8 d

2.2 三維培養(yǎng)肌肉組織在模具中的形態(tài)觀察

將豬肌肉干細胞和水凝膠預混后接入帶微柱的模具中培養(yǎng)，模具中的微柱會調控細胞定向排列，可以促進細胞分化，對比分化0 d和分化7 d（圖2），可以觀察到模具中的水凝膠發(fā)生了明顯的收縮，具體表現(xiàn)為水凝膠的面積變小，支柱周邊的網(wǎng)孔面積增大，分化7—13 d（圖3），水凝膠面積無顯著變化。

2.3 豬肌肉干細胞分化至各階段的免疫熒光染色

對二維和三維培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光染色，通過激光共聚焦顯微鏡來觀察其分化過程中肌管的成型。在二維培養(yǎng)中，可以觀察到處于增殖期的細胞多處于梭形或者紡錘形（圖4-A）；當細胞增殖達到預分化階段時，細胞數(shù)目多，細胞間相互接觸但是排布無序（圖4-B）；當?shù)竭_分化初期時，可觀察到肌細胞的排布具有一定的方向性，細胞形態(tài)細長，相鄰的細胞開始融合，出現(xiàn)多核細胞（圖4-C）；肌細胞分化進入成熟期后，可觀察到寬數(shù)十微米，可長達數(shù)百微米的明顯的多核肌管結構，多核肌管中的細胞核呈整齊的方向性排列，且MyHC蛋白信號強，其與肌管共定位（圖4-D）；這種多核肌管在分化末期仍能部分存在（圖4-E）。在三維培養(yǎng)至第7天時，可觀察到細胞大多為未伸展開的圓球形，無肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）表達（圖4-F），分化至第14天時大部分肌細胞形態(tài)變得細長，部分細胞發(fā)生融合形成較為細長的多核肌管，肌管直徑與二維培養(yǎng)下有較大差距，但是其中的細胞核和二維培養(yǎng)條件下一致呈方向性排列，MyHC蛋白有表達（圖4-G）。

A：分化0 d；B：分化7 d；C：分化13 d A: Differentiated for 0 day; B: Differentiated for 7 days; C: Differentiated for 13 days

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

以上結果表明，在膠原水凝膠中，豬肌肉干細胞可以分化并融合形成多核肌管，但是相比二維條件下細胞分化7 d就已產(chǎn)生成熟肌管，肌細胞在三維分化7 d時仍大部分呈球形，伸展程度較小，分化14 d時才可觀察到細胞融合產(chǎn)生的肌管，且肌管的直徑和長度及細胞的融合程度相比二維培養(yǎng)都有較大差距，肌細胞整體的分化進程較二維培養(yǎng)慢。

2.4 豬肌肉干細胞分化過程中各關鍵基因的表達變化

分別收取增殖期（Myoblast）、預分化期（pre-diff）、分化初期、分化成熟、分化末期的二維培養(yǎng)細胞RNA樣品以及分化7、14 d的三維培養(yǎng)細胞RNA樣品，通過RT-qPCR技術檢測其成肌過程中關鍵基因的表達情況。肌細胞生成素（Myogenin，MYOG）屬于MRFs家族，是成肌分化啟動的標志基因，對分化的進行及肌管的形成起決定性的作用[13]，微囊蛋白-3（caveolin-3，CAV-3）是細胞膜上微囊的主要組成成分，其特異地表達于肌細胞中[14]，在肌細胞分化融合形成肌管的過程中起重要的作用，MyHC是肌細胞分化成熟產(chǎn)生的重要蛋白，是構成肌原纖維的重要成分，MyHC-slow和MyHC-2a是其兩種亞型。結果顯示在二維培養(yǎng)過程中，的表達在細胞進入分化初期時顯著上調，并在到達分化成熟期前一直維持在較高的表達水平，在分化進入末期時表達顯著下調，在三維培養(yǎng)過程中，在分化7—14 d表達顯著上調，但在分化7 d時的表達相對較低，而分化14 d時表達量比二維分化初期更高。在二維分化的增殖期和預分化期基本不表達，在分化初期開始表達，并且在分化到末期表達開始下調，在三維分化7 d時已經(jīng)開始表達但表達量低于二維分化初期，分化14 d時的表達量與二維分化初期和成熟期水平相當。二維分化中和都是在進入分化初期后才開始表達，其中隨著分化的進行顯著上調，在分化末期表達量較成熟期仍有顯著的提升，而的表達在分化初期到分化末期無顯著變化，在三維分化中，分化7 d時的表達量與同期的二維分化相比更高，的表達量與同期的二維分化相比無顯著性差異，三維分化14 d時的表達量是二維分化7 d的12倍，的表達量是二維分化7 d的4倍。

A：增殖期的豬肌肉干細胞（成肌細胞）；B：二維分化0 d；C：二維分化3 d；D：二維分化7 d；E：二維分化8 d；F：三維分化7 d；G：三維分化14 d

以上結果表明在三維水凝膠中，豬肌肉干細胞的分化進程與二維分化培養(yǎng)存在一定的差異，其表現(xiàn)在和的上調較二維分化慢，但是和的表達量可以達到甚至高于同期的二維分化，且在進行更長時間（14 d）的分化后其表達仍能顯著提升，說明在基因水平上，豬肌肉干細胞在三維水凝膠體系中可以促進分化。

2.5 豬肌肉干細胞分化過程中各關鍵蛋白的表達變化

分別收取增殖期、預分化期、分化初期、分化成熟期、分化末期的二維培養(yǎng)細胞蛋白樣品以及分化7、14 d的三維培養(yǎng)細胞蛋白樣品，通過Western Blot技術檢測其成肌過程中MYOG和MyHC蛋白的表達變化。在二維分化進程中，MYOG蛋白在增殖期和預分化期基本不表達，在開始分化時表達量顯著提高，并隨著分化的進行，表達量逐漸降低，三維分化中，MYOG蛋白在分化7 d時基本未表達，分化14 d時表達顯著上調。MyHC蛋白在二維分化的增殖階段和預分化階段無表達，在分化后開始表達，且分化成熟時的表達量較分化初期有顯著提高。當二維分化進入末期時MyHC的表達量顯著降低，三維分化7 d時，MyHC蛋白基本無表達，分化14 d時有較少量的MyHC蛋白表達，但表達量與二維分化相比更低。

以上結果表明，在蛋白水平上，三維水凝膠中細胞的MYOG蛋白和MyHC蛋白的表達相比二維分化低，尤其是MyHC蛋白表達與二維分化相比差異較大。

2.6 三維培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸組成分析

由表2可知，培養(yǎng)肌肉中的氨基酸含量與豬肉仍有較大的差距，其各項氨基酸含量均低于豬肉。培養(yǎng)肌肉中的必需氨基酸占總氨基酸的比例為23.39%，低于豬肉的37.12%，但是培養(yǎng)肌肉中的呈味氨基酸占總氨基酸的比例為53.19%，高于豬肉的44.39%。

3 討論

3.1 豬肌肉干細胞的二維分化進程

肌肉干細胞也被稱為肌衛(wèi)星細胞[15]，位于肌纖維膜和基底膜之間[16]，正常條件下，肌衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)，表達和，和是肌衛(wèi)星細胞的標志基因，被認為是肌衛(wèi)星細胞命運的主要調控因子[17-18]，當肌肉受到機械損傷時，肌衛(wèi)星細胞被激活，分化為成肌細胞（Myoblast），會激活并上調的表達，促進細胞進入增殖階段，并抑制分化[19]。當肌衛(wèi)星細胞收到誘導分化的信號，退出細胞周期并結束增殖，成肌細胞進一步分化為肌細胞（Myocyte），開始表達，細胞進入分化進程，在分化早期就開始表達[20]，其對肌細胞融合形成多核肌管（Myotube）和肌纖維起著重要促進作用[21-22]。被證明與T小管的形成相關，其在肌細胞融合形成肌管時表達上調，并在分化成熟的過程中表達降低，在成人肌肉中幾乎不表達[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在二維培養(yǎng)的豬肌肉干細胞分化進程中，和在增殖階段和預分化階段基本不表達。當細胞進入分化初期，和的表達快速上調并隨著分化的進行而表達量逐漸降低，終末分化基因的表達水平隨著分化的進行不斷提高，這與Schmidt等[24]的研究結果類似。該結果揭示了豬肌肉干細胞在二維分化條件下的分化進程，其中和表達水平可以用來判斷豬肌肉干細胞在分化進程中所處的階段。

表2 豬肉和培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸含量

*為呈味氨基酸 *Refers to flavoring amino acids

Myoblast：增殖期的豬肌肉干細胞；pre-diff：二維分化0 d；2D-D3：二維分化3 d；2D-D7：二維分化7 d；2D-D8：二維分化8 d；3D-D7：三維分化7 d；3D-D14：三維分化14 d。下同

圖6 豬肌肉干細胞分化過程中各關鍵蛋白的表達變化

3.2 豬肌肉干細胞在三維水凝膠的分化

本研究發(fā)現(xiàn)三維分化第7天時和表達水平低，分化14 d時才達到二維分化第7天時的水平，表明水凝膠中肌細胞的分化受到抑制，這很可能是水凝膠三維環(huán)境的作用。三維培養(yǎng)相較于二維培養(yǎng)，細胞所處的環(huán)境更加復雜，環(huán)境對細胞的影響更大。研究表明，細胞剛接入水凝膠時都是未展開的球形，細胞膜的表面會有一些受體用于感知外界環(huán)境，這些信息會傳遞到細胞內(nèi)部并誘導細胞內(nèi)肌動蛋白骨架發(fā)生變化，從而改變細胞的形態(tài)來適應環(huán)境，這種變化最終會影響細胞的功能和命運[25]。在本研究中，豬肌肉干細胞在水凝膠中分化第7天時細胞的伸展程度較小，肌融合未發(fā)生，在分化第14天時可觀察到分化形成的多核肌管結構。肌細胞在水凝膠中的伸展較二維培養(yǎng)更緩慢，肌融合也隨之受阻。這種細胞在水凝膠中延遲伸展的現(xiàn)象在Scott等[26]的研究中也有類似的報道，血管外膜成纖維細胞在不同強度的聚乙二醇水凝膠中培養(yǎng)7 d仍均保持球形，直至第14天才發(fā)生不同程度的伸展，且強度較大的水凝膠中細胞伸展程度較小，說明水凝膠的網(wǎng)絡結構限制了細胞的形態(tài)變化。將肌肉干細胞接入強度適宜的膠原水凝膠中，細胞會逐漸結合膠原纖維上的錨點，纖維會給細胞牽引力誘導細胞形態(tài)發(fā)生變化，并使水凝膠發(fā)生收縮[27]。當水凝膠強度較大，即環(huán)境不適宜細胞伸展時，細胞會分泌一些基質降解酶來改變周圍的環(huán)境，這就可能造成細胞在水凝膠中伸展延遲[28]。Hogrebe等[29]研究了不同強度自組裝肽水凝膠中人間充質干細胞的伸展情況，在接種細胞1 d后，在強度為0.25 kP的水凝膠中，二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的細胞均仍呈球形；強度為1.25 kP和5 kP的水凝膠中分別二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的細胞均可以正常伸展；而在強度為10 kP的水凝膠中，二維培養(yǎng)的細胞可以正常伸展，三維培養(yǎng)的細胞卻不能伸展開；對其進行較長時間的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在0.25 kP的水凝膠中，二維和三維培養(yǎng)的細胞仍為球形，而在10 kP的水凝膠中三維培養(yǎng)26 d時可明顯觀察到細胞伸展。該結果說明細胞伸展需要環(huán)境提供一定的牽引力，如果牽引力過小，細胞可能不能正常伸展；而水凝膠強度太大，細胞會需要更長的時間才能伸展，因為細胞需要釋放一些基質降解酶來創(chuàng)造適宜自身的環(huán)境，故構成水凝膠的纖維的易降解程度也會是細胞伸展速度的影響因素。水凝膠除了通過影響細胞的伸展對細胞造成影響，構成水凝膠纖維的濃度、交聯(lián)程度及接種細胞的密度等也會決定水凝膠網(wǎng)絡的空隙大小，從而影響細胞與外界的物質交換和細胞間的信號傳遞[30]。在二維培養(yǎng)時，培養(yǎng)皿中的細胞可以通過流動的培養(yǎng)基快速地進行物質交換和信號傳遞，但是在三維培養(yǎng)中，水凝膠復雜的網(wǎng)絡結構使營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物的運輸路徑增加，細胞的物質交換受到抑制。因此，三維培養(yǎng)時需要一些類似于血管的結構輔助內(nèi)部的細胞進行物質交換，如Kolesky等[31]通過3D打印技術在明膠和纖維蛋白交聯(lián)形成的水凝膠中打印了類血管組織，實現(xiàn)了為厚組織灌輸培養(yǎng)基和生長因子。

3.3 三維培養(yǎng)有利于MyHC相關基因的表達

肌球蛋白（Myosin）是肌原纖維的重要組成成分，其高表達是肌管或肌纖維成熟的重要標志。肌球蛋白由肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈組成，其中根據(jù)肌纖維的代謝類型不同，可將MyHC分為幾種不同的亞型[32]，其中MyHC-slow和MyHC-2a分別對應慢速氧化型肌纖維和快速氧化型肌纖維[33]。在本研究中，三維分化條件相比于二維分化更有利于和的表達。這種三維培養(yǎng)促進相關基因表達的現(xiàn)象與Fujie等[34]的研究結果類似，其通過聚乳酸-羥基乙酸共聚物制作的納米帶片和纖維連接蛋白制作出具有兩層肌細胞的肌肉組織薄片來模擬細胞的三維培養(yǎng)狀態(tài)，結果表明雙層培養(yǎng)時肌細胞的、、和表達水平均高于單層培養(yǎng)，表明雙層培養(yǎng)有利于肌管的分化成熟。但是本研究中雖然三維培養(yǎng)促進了的相關基因表達，但是三維培養(yǎng)肌細胞的MyHC蛋白表達水平與二維培養(yǎng)有較大的差距。在Liu等[35]的研究中，二維培養(yǎng)和三維水凝膠培養(yǎng)7 d的C2C12細胞MyHC蛋白表達水平無顯著差異，與本研究的結果不同。本研究認為MyHC的低表達可能和肌細胞的融合程度較低有關，免疫熒光染色的結果顯示MyHC蛋白的染色和F-actin染色的肌管是共定位的，說明肌細胞融合成肌管的程度與MyHC蛋白的表達呈一定的正向關系，現(xiàn)有研究證明MyHC的產(chǎn)生與肌細胞的融合程度有關[36]。本研究中構建的水凝膠體系延緩了細胞的伸展，這可能也是肌細胞融合受阻的原因，將來的研究可以通過優(yōu)化水凝膠體系的配方，如改變膠原濃度及交聯(lián)程度等，構建更有利于肌細胞融合形成肌管的水凝膠體系。

3.4 培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸組成

本研究培養(yǎng)肌肉中的氨基酸含量與豬肉還有很大的差異，這可能與培養(yǎng)肌肉組織中的高水分含量有關，就氨基酸的組成來看，培養(yǎng)肌肉中的必需氨基酸在總氨基酸中的占比低于豬肉，但是呈味氨基酸的占比高于豬肉，可能會擁有更好的風味。培養(yǎng)肌肉中含量較高的氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸等，這些也是構成鼠尾膠原蛋白的主要氨基酸，鼠尾膠原中必需氨基酸占比約16%[37]，而培養(yǎng)肌肉中為23.39%，說明接入細胞后其必需氨基酸的占比明顯提升，未來可以通過優(yōu)化水凝膠的體系，提高細胞密度等方法，培養(yǎng)出營養(yǎng)成分與豬肉更加接近的肌肉組織。

4 結論

本研究構建了一種用于豬肌肉干細胞體外三維培養(yǎng)的水凝膠體系，實現(xiàn)了豬肌肉干細胞的體外三維分化。三維條件有利于豬肌肉干細胞的終末分化基因和的表達，由此方法體外培養(yǎng)的肌肉組織具有較高的呈味氨基酸含量。

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Differentiation of Porcine Muscle Stem Cells in Three-Dimensional Hydrogels

CHEN Yu, ZHU HaoZhe, CHEN YiChun, LIU Zheng, DING Xi, GUO Yun, DING ShiJie, ZHOU GuangHong

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/National Meat Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing 210095

【Objective】 The objective of this study was to explore the differentiation effect of porcine muscle stem cells in three-dimensional hydrogels, and to provide a guidance for inducing muscle stem cells to differentiate into muscle tissue in vitro.【Method】 Some porcine muscle stem cells were respectively induced to differentiate under the conditions of 2D and 3D (2D condition means culturing cells in culture dishes; 3D condition means culturing cells in hydrogels). The RNA and protein samples of porcine muscle stem cells cultured in 2D were collected at proliferation, pre-differentiation, early differentiation, mature differentiation, and late differentiation, respectively, and those in 3D were also collected at day 7 and day 14 of differentiation, respectively. Then, RT-qPCR was used to compare the expression levels of the myogenic-related genes, including the genes ofand,under 2D and 3D differentiation conditions. Correspondingly, the Western Blot was used to detect the expression levels of MyHC protein and MYOG protein in the two conditions. Moreover, the immunofluorescence staining was used to observe the myotubes formed in cell culture dishes and hydrogels. Further, the amino acid content and composition of the cultured muscle tissue were analyzed by an amino acid automatic analyzer at day 14 of differentiation. 【Result】 The porcine muscle stem cells started to fuse to form myotubes at day 3 of differentiation in 2D. The myotubes formed in 2D matured at day 7 and divorced from culture dish afterwards. The porcine muscle stem cells were still globe and had low expression ofandat day 7 of differentiation in 3D. Multinucleated myotubes formed at day 14 and the expression ofandreached levels of 2D differentiation. The cells in hydrogels had higher expression of terminal differentiation genesandthan the cells in culture dishes. The expression ofwas 12 times that at day 7 in 2D and the expression ofwas 4 times that at day7 in 2D, but the expression of MyHC protein was only 1/6 that at day 7 in 2D. Amino acid analysis results showed that the contents of 17 hydrolyzed amino acids in cultured muscle tissue were all lower than those in pork, and the ratio of essential amino acids was also lower in cultured muscle tissue, but the ratio of flavor amino acids was higher. 【Conclusion】 The porcine muscle stem cells could differentiate into myotubes in 3D collagen hydrogels, and the 3D condition was positive to the expression of myogenic differentiation related genes, but further research was needed to achieve high expression of MyHC protein. The flavor amino acid content of the muscle tissue cultured in this way was high, which might mean good flavor.

porcine muscle stem cells; differentiation; hydrogels; myotubes; cultured meat

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.014

2022-03-03；

2022-06-16

江蘇省青年科學家自然科學基金（BK20200537）、江蘇省重點研發(fā)計劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）（BE2020302）、國家重點研發(fā)計劃（2021YFC2101400）、國家自然科學基金青年基金（32101991）、江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心

陳彧，E-mail：2020808131@stu.njau.edu.cn。通信作者丁世杰，E-mail：shijieding@njau.edu.cn。通信作者周光宏，E-mail：guanghong. zhou@hotmail.com

（責任編輯 趙伶俐）