沼液中HCO3-對水稻生長的類CO2施肥效應(yīng)

萬華琴，辜旭，何紅梅，湯逸帆，申建華，韓建剛，朱詠莉

沼液中HCO3-對水稻生長的類CO2施肥效應(yīng)

萬華琴1,2，辜旭1，何紅梅3，湯逸帆1，申建華4，韓建剛1,2，朱詠莉1,2

1南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037；2南京林業(yè)大學(xué)江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；3東臺市黃海原種場，江蘇東臺 224200；4中糧家佳康（江蘇）有限公司，江蘇東臺 224200

【目的】沼液富含氮素是其農(nóng)田利用的基礎(chǔ)，但不可忽視的是，沼液中還含有大量的HCO3-。探討沼液還田過程中HCO3-的轉(zhuǎn)化及其對水稻生長的影響，以期為沼液替代化肥，實施化肥減量及沼液資源化利用提供新的理論依據(jù)?！痉椒ā吭O(shè)置沼液原液（BS）、去除HCO3-的沼液（BS?B）、去離子水加HCO3-（W+B）和去離子水（W）4個處理，采用13C標(biāo)記技術(shù)，通過水稻苗期盆栽試驗，觀測CO2釋放特征，同步分析水稻光合作用速率、胞間CO2濃度、干鮮重、株高，以及上覆水和土壤pH、HCO3-、NH4+含量等的變化。【結(jié)果】（1）BS處理下CO2釋放速率為9.55—38.07 mg·kg-1·h-1，凈累計釋放量為4 654.06 mg·kg-1；BS?B處理下CO2釋放速率為4.55—17.25 mg·kg-1·h-1，凈累計釋放量為780.68 mg·kg-1；W+B處理下CO2釋放速率為3.93—26.33 mg·kg-1·h-1，凈累計釋放量為1 274.07 mg·kg-1；W處理下CO2釋放速率為3.22—11.90 mg·kg-1·h-1，累計釋放量為2 265.20 mg·kg-1。BS處理下CO2平均釋放速率分別是BS?B和W+B的4.18倍和2.44倍，凈累計釋放量分別是BS?B和W+B的5.96倍和3.65倍，均顯著高于BS?B和W+B處理。同時，BS處理下的CO2凈累計釋放量大于BS?B與W+B兩個處理之和，因此HCO3-與沼液中其他組分在對CO2釋放影響方面存在協(xié)同效應(yīng)。（2）培養(yǎng)期內(nèi)BS處理下13CO2的凈累計釋放量為32.87 mg·kg-1，占土壤-水稻系統(tǒng)CO2凈累計釋放量的0.71%；W+B處理下13CO2的凈累計釋放量為13.18 mg·kg-1。相比較而言，BS處理下的13CO2凈累計釋放量顯著高于W+B（＜0.05），這表明沼液中的其他組分促進了HCO3-向CO2的轉(zhuǎn)化。（3）BS和BS?B處理在前12 h水稻的凈光合速率顯著高于W+B和W處理；添加培養(yǎng)液后2—7 d，BS處理下的凈光合速率值顯著高于BS?B，同時，整個培養(yǎng)期間均顯著高于W+B處理（＜0.05），沼液中的HCO3-顯著改善了水稻葉片的光合作用。相比較而言，BS處理前5 d胞間CO2濃度均顯著低于其他3個處理。BS和BS?B處理下水稻株高和水稻鮮重均顯著高于W+B和W處理（＜0.05），4個處理間水稻干重?zé)o顯著差異。（4）BS處理水稻幼苗固定的13CO2量為4.05 g·kg-1，標(biāo)記物H13CO3-利用率為18.54%；W+B處理的13CO2固定量為3.29 g·kg-1，H13CO3-利用率為14.20%。H13CO3-源的13CO2促進水稻光合作用，有利于水稻生長。（5）BS和W+B處理下CO2及13CO2釋放速率均與上覆水和土壤HCO3-含量、pH顯著相關(guān)；同時，BS和W+B處理下水稻光合速率均與土壤中HCO3-含量顯著正相關(guān)?！窘Y(jié)論】沼液還田，大量HCO3-轉(zhuǎn)化顯著促進了CO2的釋放，有利于水稻光合作用。土壤中的HCO3-含量和土壤pH是影響CO2釋放和水稻光合作用的重要因素。同時，水稻對沼液中的HCO3-具有更高的利用率，沼液中的HCO3-存在明顯的類CO2施肥效應(yīng)。

沼液；HCO3-；13C標(biāo)記；水稻；CO2施肥效應(yīng)；光合作用

0 引言

【研究意義】沼液是沼氣工程的副產(chǎn)物，一般指分離沼渣后的液體（NY/T2065—2011《沼渣、沼液施用技術(shù)規(guī)范》）。以往的研究表明，沼液富含氮素和作物生長所需的其他養(yǎng)分，施用于農(nóng)田可以顯著提高作物產(chǎn)量[1-3]。因此，長期以來，沼液一直作為我國農(nóng)田化肥減量增產(chǎn)增效行動的優(yōu)質(zhì)替代選項而被廣泛應(yīng)用。沼液富含NH4+是其長期以來農(nóng)田利用的基礎(chǔ)。然而，不應(yīng)忽視的是，沼液中還含有高于NH4+含量數(shù)倍的HCO3-。HCO3-大量形成于沼氣工程厭氧發(fā)酵產(chǎn)CH4階段[4]，其在沼液中的含量高達3—9 g?L-1。目前，有關(guān)沼液中HCO3-的認識主要是其與NH4+共存，維持著沼液pH的穩(wěn)定，對沼液中HCO3-在施入土壤后的賦存和轉(zhuǎn)化目前還未見報道。尤其是，HCO3-及其轉(zhuǎn)化對作物生長的影響尚未可知?！厩叭搜芯窟M展】WEST等[5]與HANNAM等[6]研究發(fā)現(xiàn)，無論土壤還是灌溉水中HCO3-含量的增加均會引起土壤CO2釋放增加，HCO3-對土壤CO2的釋放具有顯著的促進作用。沼液施入田間后將引起土壤中HCO3-濃度的顯著變化，HCO3-的轉(zhuǎn)化將釋放數(shù)量可觀的CO2。假定這部分CO2快速大量釋放，這可能使得沼液還田過程存在短暫但不容忽視的CO2排放源。如果CO2的釋放維持高量且持續(xù)較長時間，那么，這是否對作物生長產(chǎn)生助長——即CO2施肥效應(yīng)呢？周娟等[7]、袁嫚嫚等[8]和牛璽朝等[9]發(fā)現(xiàn)大氣CO2濃度升高200 μmol?mol-1時，水稻增產(chǎn)可達12.9%—24.17%；當(dāng)田間CO2濃度維持在800—1 000 μmol?mol-1時，施肥效應(yīng)更加顯著[10-11]。對CO2施肥效應(yīng)最敏感的指標(biāo)被認為是作物光合速率[12-13]，光合速率的提高可有效促進作物生長發(fā)育及增產(chǎn)，如高濃度CO2條件下水稻葉片、莖鞘和稻穗生物量增幅可達16%—29%[14]?！颈狙芯壳腥朦c】為了探討沼液中HCO3-在施入土壤后的轉(zhuǎn)化以及對作物生長的影響，本文以沼液用量較大的稻田為原型，設(shè)置沼液原液（BS）、去除HCO3-的沼液（BS?B）、去離子水加HCO3-（W+B）和去離子水（W）4個處理，采用13C標(biāo)記技術(shù)，通過水稻苗期盆栽試驗，觀測土壤CO2釋放特征，同步測定水稻光合作用速率、干鮮重、株高，以及上覆水和土壤pH、HCO3-含量、NH4+等。【擬解決的關(guān)鍵問題】以期揭示沼液中HCO3-對水稻生長潛在的類CO2施肥效應(yīng)，為沼液還田效應(yīng)的科學(xué)評估與調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤采自江蘇省東臺市黃海原種場（32°38′23′′N，120°53′59′′E）稻田。區(qū)域是暖溫帶和亞熱帶過渡帶，年均降水量1 061 mm，年均氣溫15.0℃。研究區(qū)毗海臨灘，土地成本低，分布著許多大型規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖企業(yè)。沼液還田在當(dāng)?shù)匾驯晦r(nóng)戶廣為接受。

水稻收獲后，按照S形布點法多點采集0—20 cm土層土壤制成混合土樣，風(fēng)干后過2 mm篩，備用。土壤為粉砂質(zhì)壤土，基本理化性質(zhì)如表1。參照土壤農(nóng)化分析與環(huán)境監(jiān)測[15]分別采用pH計（pHS-3C型）測定土壤pH，電導(dǎo)率儀（FE30 Plus）測定EC值，TOC儀（Multi N/C 3100）測定總有機碳（TOC），凱氏定氮法測定全氮（TN），鉬銻抗分光光度法測定全磷（TP），比重計法測定土壤顆粒組成。

表1 土壤理化性質(zhì)

1.2 供試沼液

沼液選自中糧肉食（江蘇）有限公司的沼氣發(fā)電站，該項目采用目前普遍應(yīng)用的大型水泡糞工藝清理并收集豬舍內(nèi)糞污，由勻漿池（固體濃度控制在2.0%—3.0%）混合升溫處理后進入發(fā)酵罐，36—38℃的全混合厭氧反應(yīng)器（CSTR）中發(fā)酵15—20 d。產(chǎn)生的沼氣并網(wǎng)發(fā)電，液體進入存貯池。存貯池中液體穩(wěn)定1—2個月后，底部為沼渣，中上部為沼液。在沼液池出口采集沼液，使用帶有刻度的塑料桶收集沼液。沼液基本理化性質(zhì)如表2。采用AA3流動分析儀測定NH4+-N濃度，雙指示劑中和滴定法測定HCO3-的濃度[16]。

表2 沼液理化性質(zhì)

1.3 培養(yǎng)液配置

設(shè)置沼液原液（BS）、去除HCO3-的沼液原液（BS?B）、去離子水加HCO3-（W+B）和去離子水（W）4種培養(yǎng)液。BS?B、W+B和W等3種培養(yǎng)液配置方法如下：

（1）BS?B：向沼液原液中加入5 mol?L-1的HCl攪拌3 min調(diào)節(jié)pH至6.7，觀察待溶液中無氣泡產(chǎn)生時加入2 mol?L-1的NaOH中和過量HCl并調(diào)節(jié)沼液pH同于沼液原液；

（2）W+B：向去離子水中加入NaHCO3，使其中HCO3-的濃度與沼液原液相同，調(diào)節(jié)溶液pH同于沼液原液；

（3）W：用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH同于沼液原液。

1.4 13C標(biāo)記

在上述培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，向BS和W+B兩種培養(yǎng)液中加入13C-NaHCO3（豐度99%），混合均勻后的BS和W+B培養(yǎng)液中13C豐度為15%。BS（13C-NaHCO3）、BS?B、W+B（13C-NaHCO3）和W等4種培養(yǎng)液用于盆栽水稻試驗。

1.5 盆栽試驗

在人工氣候箱（托普RTOP-1000YD）內(nèi)進行水稻育秧，培養(yǎng)箱溫度控制在20—28℃，濕度為70%，光照設(shè)置為白天光照等級為10級16 h·d-1，夜間0級8 h·d-1。育苗20 d后，選取長勢一致的秧苗進行移栽。供試水稻品種為淮稻5號。

取供試土壤2.0 kg加入盆缽中（上徑17 cm，底徑14 cm，高20 cm的塑料盆），加水至飽和，在人工氣候箱中25℃下預(yù)培養(yǎng)2—3 d，按照每盆3穴，每穴3株秧苗進行移栽，待水稻秧苗生長穩(wěn)定后（3 d），分別加入1.3中配置的4種培養(yǎng)液120 mL，液面高出土壤5 cm。于人工氣候箱中培養(yǎng)，每個處理3盆。水稻生長期間根據(jù)上覆水層標(biāo)記位置施用去離子水補充各處理蒸散損失的水分。

添加培養(yǎng)液第1天的2、6、12和18 h及之后第2、3、5、7、10和15天采集氣體樣品。使用透明取氣箱（長30 cm、寬20 cm、高40 cm）進行氣體樣品富集及采集，取氣箱頂部設(shè)置有氣孔樣品采集口，每次采集時間為上午9：00—11：00，富集前將透明取氣箱置于盆栽體系中，使用20 mL一次性注射器通過取氣孔進行氣體樣品采集，氣體樣品采集時間原則為直至檢測出氣體樣品CO2釋放速率無顯著差異時，即停止氣體樣品的采集。采集后立即封閉取氣孔，富集2 h，立即進行第二次氣體樣品采集，采集結(jié)束后即取下透明取氣箱。氣體樣品用于CO2濃度和δ13CO2豐度的測定。取樣期間，同步使用光合速率儀（LI-COR，Lincoln，NE,USA）測定水稻光合速率、胞間CO2濃度等光合數(shù)據(jù)。

氣樣采集完畢后，用20 mL注射器分6處小心抽取培養(yǎng)盆內(nèi)表面水（約2.5 cm水層處）20 mL于潔凈的塑料瓶中，用于測定上覆水NH4+-N濃度（（w）NH4+-N）、HCO3-濃度（（w）HCO3-）和pH（（w）pH），取水樣時注意不要干擾土層。隨后，用小型取土器多點小心采集30 g鮮土，用于測定土壤NH4+-N（（s）NH4+-N）、HCO3-含量（（s）HCO3-）和pH（（s）pH）。樣品放在4℃冰箱中保存待測。整個培養(yǎng)期間共取上覆水200 mL，鮮土300 g，均少于總量的10%。最后一次氣體樣品、水樣和土樣采集完畢后，進行植株的采集與測定。

1.6 土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放速率及累計釋放量計算

采用安捷倫7890A型氣相色譜儀（Agilent 7890A Series GC）測定氣樣中CO2的含量，測定CO2的檢測器為熱導(dǎo)檢測器（TCD）。標(biāo)準(zhǔn)氣由中國計量科學(xué)研究院提供（595669#），平衡氣體為N2，CO2濃度為712×10-6。通過標(biāo)準(zhǔn)氣體和待測氣體的峰面積比值計算樣品中CO2的濃度。土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放速率（）與累計釋放量（）計算如下：

=（1）

=×10-3（2）

式中，為CO2釋放速率（mg·kg-1·h-1）；2為富集2 h后CO2質(zhì)量濃度（mg·L-1）；1為富集前CO2質(zhì)量濃度（mg·L-1）；為取氣箱體積（L）；為塑料盆中土壤質(zhì)量（kg）；為富集時間（h）；'為測得的氣體體積分?jǐn)?shù)（10-6）；為氣體的分子量（g·mol-1）；為大氣壓，101 600 （Pa）；22.4為標(biāo)準(zhǔn)狀況下氣體常數(shù)（L·mol-1）；為環(huán)境溫度（℃）；10-3為單位換算系數(shù)。

=××24 （3）

式中，為培養(yǎng)期CO2累計釋放量（mg·kg-1）；F和F，分別為第次和第+1次測定的CO2釋放速率（mg·kg-1·h-1）；為相鄰兩次檢測間隔天數(shù)（d）；24為時間換算常數(shù)。

采用Delta V Advantage穩(wěn)定氣體同位素質(zhì)譜儀（ThermoFinnigan，German）檢測CO2的13C和12C比率，并與國際標(biāo)準(zhǔn)物（Pee Dee Belnite或PDB）對比后計算出樣品的δ13C值，即R。13CO2凈釋放速率和碳同位素計算如下：

13=(-1)×1000‰ （5）

式（4）中，為13CO2凈釋放速率（mg·kg-1·h-1）；2為富集后氣體的質(zhì)量濃度（mg·L-1）；1為富集前氣體的質(zhì)量濃度（mg·L-1）（1和2計算同式（2））；2為富集后δ13CO2（%）；1為富集前δ13CO2；ck為未添加標(biāo)記物的W處理δ13CO2的平均值，為1.10%；為氣體總體積（L）；為盆栽土壤質(zhì)量（kg）。式（5）中，δC為樣品中13C的豐度（%）；R為實測樣品中13C與12C的比值（%）；R為標(biāo)準(zhǔn)物中13C與12C的比值（%）。

13CO2凈累計釋放量計算同式（3）。

1.7 植株樣品采集與測定

培養(yǎng)結(jié)束后，將水稻整株取出，用去離子水洗凈水稻根部，放置試驗臺上晾干水稻表面水后測定水稻的株高，用電子天平（賽多利斯BSA124S，精確度0.001）測定水稻鮮重。將水稻裝于紙袋中，烘箱110℃殺青2 h后，80℃下恒溫烘干24 h，烘干后置于電子天平上測定水稻干重。

此后，去除水稻根部，莖葉經(jīng)研磨后過60目篩，保存待測。稱取0.2—0.3 mg研磨后的植株樣品置于錫紙中，樣品包裝完成后放置在Flash 2000EA元素分析儀（Thermo Electron，USA）中高溫燃燒后采用Delta V Advantage穩(wěn)定氣體同位素質(zhì)譜儀（ThermoFinnigan，German）測定δ13C。計算公式同式（5）。

稱取0.2—0.3 mg研磨后的樣品采用TOC固體模塊瓷舟固體燃燒法測樣品全碳（TC）含量，計算公式如下：

=（6）

式（6）中，為植株全碳含量（g·kg-1）；為水稻植株碳總量（g）；為水稻干重（kg）。

水稻植株中13CO2固定量計算如下：

13=××(13-13Cck) （7）

式（7）中，13為13CO2固定量（g）；為水稻全碳含量（g·kg-1）；為水稻干重（kg）；δC為樣品中13C的豐度（%）；δCck為未加標(biāo)記物的W處理水稻植株的13C豐度，為1.08%。

H13CO3-利用率計算如下：

式（8）中，為H13CO3-利用率（%）；T為水稻植株中13C固定量（g）；′為添加的13C-NaHCO3中13C的量（g）。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，差異顯著性用字母標(biāo)記法，不同小寫字母代表處理間差異顯著（＜0.05），Person相關(guān)系數(shù)分析CO2釋放速率、13CO2釋放速率和水稻光合作用性狀與影響因子之間的相關(guān)性，并用Origin 9.0進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 土壤-水稻系統(tǒng)CO2和13CO2釋放速率及累計釋放量

由圖1-A可以看出，BS處理下土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放速率從添加培養(yǎng)液后2 h時的38.07 mg·kg-1·h-1迅速下降至15 d時的9.55 mg·kg-1·h-1，BS?B處理下CO2釋放速率從最高的17.25 mg·kg-1·h-1下降至4.55 mg·kg-1·h-1。整體上，BS處理CO2平均釋放速率是BS?B的4.18倍。相比較而言，W+B處理CO2釋放速率在2 h時為最高（26.33 mg·kg-1·h-1），W處理下在12 h達到峰值（11.90 mg·kg-1·h-1）。此后，兩個處理CO2釋放速率降至15 d時的3.93和3.22 mg·kg-1·h-1。BS與W+B處理相比較而言，前者平均釋放速率是后者的2.44倍。同時，BS處理下CO2釋放速率是BS?B和W+B兩個處理之和的1.54倍。

圖1 土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放速率與累計釋放量

BS處理下CO2總釋放量與其他3個處理存在顯著差異（圖1-B），表現(xiàn)為BS>W+B>BS?B>W處理（＜0.05）。其中，BS處理的凈累計釋放量（以W為CK）為4654.06 mg·kg-1，BS?B和W+B分別為780.67和1274.07 mg·kg-1。BS處理CO2凈累計釋放量分別是BS?B和W+B的5.96和3.65倍。同時，BS凈累計釋放量顯著高于（BS?B）和（W+B）處理之和（2054.74 mg·kg-1）。

添加13C標(biāo)記處理的13CO2釋放速率見表3。BS和W+B處理下13CO2釋放速率隨時間變化均呈現(xiàn)下降趨勢。添加培養(yǎng)液18 h后BS處理下的13CO2凈釋放量顯著高于W+B處理（＜0.05）。培養(yǎng)期間，BS處理下13CO2凈累計釋放量顯著高于W+B處理（＜0.05）。

2.2 沼液施加對水稻光合性狀和生物量的影響

由圖2可見，BS和BS?B處理在前12 h水稻的凈光合速率顯著高于W+B和W處理（＜0.05）。2—7 d，BS處理凈光合速率顯著高于BS?B處理（＜0.05）。相比較而言，前5 d，BS處理下胞間CO2濃度顯著低于其他3個處理。

圖3可見，不同處理間水稻株高與單株鮮重的變化相似，均表現(xiàn)為BS與BS?B處理間無顯著差異，但二者均顯著高于W+B與W處理（＜0.05）。水稻干重在4個處理間無顯著差異。

表3 H13CO3-轉(zhuǎn)化的13CO2即時濃度、釋放速率及釋放量

“*”表示相同時間BS與W+B處理13CO2釋放量具有顯著差異（＜0.05）

“*” Indicates that there is significant difference in13CO2release quantity between BS and W+B treatment at the same time (＜0.05)

2.3 水稻對13CO2的固定量及對H13CO3-標(biāo)記物的利用率

以未添加13C標(biāo)記物的W處理所檢測出的水稻地上部分13C豐度為對照，分別計算添加13C標(biāo)記（13C -NaHCO3）的BS和W+B處理對13CO2的固定量。BS和W+B處理下水稻固定13CO2量的分別為4.05和3.29 g·kg-1，對H13CO3-的利用率分別為18.54%和14.20%（表4）。

2.4 土壤-水稻系統(tǒng)CO2和13CO2釋放的影響因素

相關(guān)性分析表明（表5），BS處理下CO2釋放速率與（w）HCO3-濃度、（w）NH4+-N濃度和（s）pH顯著正相關(guān)，與（w）pH和（s）HCO3-含量顯著負相關(guān)（＜0.01）。BS-B處理下CO2釋放速率與（w）NH4+-N濃度、（s）HCO3-濃度和（s）pH濃度顯著正相關(guān)，與（w）HCO3-濃度顯著負相關(guān)（＜0.01）。W+B處理下CO2釋放速率與（w）HCO3-濃度、（w）pH和（s）NH4+-N含量顯著正相關(guān)，與（s）HCO3-含量和（s）pH顯著負相關(guān)（＜0.01）。W處理下CO2釋放速率與（w）HCO3-濃度、（w）NH4+-N濃度顯著正相關(guān)（＜0.01）。

圖2 施加不同培養(yǎng)液對水稻光合性狀的影響

圖3 施加不同培養(yǎng)液水稻平均株高（a）、單株鮮重（b）和干重（c）

表4 水稻對H13CO3-轉(zhuǎn)化的13CO2的固定量與對H13CO3-的利用率

不同小寫英文字母代表BS與W+B處理間具有顯著差異（＜0.05）

Different lowercase letters represent significant difference between BS and W+B treatment (＜0.05)

BS處理下13CO2釋放速率與（w）HCO3-濃度、（w）NH4+-N濃度和（s）pH顯著正相關(guān)（＜0.01），與（w）pH、（s）HCO3-和（s）NH4+-N顯著負相關(guān)（＜0.01）（表6）。W+B處理下13CO2釋放速率與（w）HCO3-濃度顯著正相關(guān)（＜0.01），與（s）HCO3-和（s）pH顯著負相關(guān)（＜0.01）（表6）。

表5 CO2釋放速率與上覆水及土壤性狀因子的相關(guān)性

*:＜0.05；**:＜0.01. （w）HCO3-：上覆水HCO3-濃度；（w）NH4+-N：上覆水NH4+-N濃度；（w）pH：上覆水pH；（s）HCO3-：土壤HCO3-含量；（s）NH4+-N：土壤NH4+-N含量；（s）pH：土壤pH。下同

(w)HCO3-: HCO3-concentration of overlying water; (w)NH4+-N: NH4+-N concentration of overlying water; (w)pH: pH of overlying water; (s)HCO3-: HCO3-content of soil; (s)NH4+-N: NH4+-N content of soil; (s)pH: soil pH. The same as below

表6 BS和W+B處理下13CO2釋放速率與上覆水及土壤性狀因子的相關(guān)性

*:＜0.05；**:＜0.01

2.5 水稻光合性狀的影響因素

相關(guān)性分析表明（表7），BS處理下水稻的凈光合速率與（w）HCO3-濃度顯著正相關(guān)（＜0.05）。BS?B處理下水稻的凈光合速率與（w）NH4+-N濃度、（s）pH和CO2釋放速率顯著正相關(guān)（＜0.01），與（w）HCO3-濃度顯著負相關(guān)（＜0.05）。W+B處理下水稻的凈光合速率與（w）HCO3-濃度和13CO2釋放速率顯著正相關(guān)（＜0.01），與（s）pH顯著負相關(guān)（＜0.05）。W處理下水稻的凈光合速率與（w）HCO3-濃度、（s）pH和CO2顯著負相關(guān)（＜0.05）。4個處理下胞間CO2濃度與各環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性。

3 討論

3.1 沼液中HCO3-對土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放的影響

研究表明，土壤中HCO3-含量的增加會促進土壤CO2釋放[17]；并且當(dāng)土壤中HCO3-含量較高時會對CO2排放起主導(dǎo)作用[18]。由圖1可知，BS處理下土壤-水稻系統(tǒng)CO2釋放速率是BS?B的4.18倍，凈累計釋放量是BS?B的5.96倍。這表明，沼液中的HCO3-顯著提高了系統(tǒng)CO2的釋放。同時，BS處理的釋放速率與凈累計釋放量大于BS?B與W+B處理之和，這表明，HCO3-與沼液中其他組分在對CO2釋放影響方面存在協(xié)同效應(yīng)。相關(guān)分析表明（表5、表6、表7），土壤-水稻系統(tǒng)CO2和13CO2的釋放速率，以及水稻葉片光合速率的變化均與土壤pH密切相關(guān)。沼液施入稻田后，一部分NH4+被上覆水中的O2氧化[19]，釋放H+, HCO3-與H+反應(yīng)釋放CO2；與此同時，數(shù)量可觀的NH4+吸附于土壤，經(jīng)水稻根系吸收，釋放H+[20]（圖4）。這部分H+與遷移至土壤中的HCO3-反應(yīng)生成CO2。顯然，NH4+轉(zhuǎn)化（氧化、吸收）釋放H+，使體系pH下降，但與其同步發(fā)生的HCO3-對H+的消耗（釋放CO2）又會使體系pH升高。相比較而言，上覆水中CO2的釋放屬于“快反應(yīng)”，而土壤中CO2的釋放屬于“慢反應(yīng)”。最終，土壤pH的變化主導(dǎo)了CO2的排放（13CO2），與13CO2釋放速率成正比。即，13CO2排放量越高，H+消耗越多，pH升高。同時，水稻生長的加快，可能導(dǎo)致根系呼吸作用的增強使CO2釋放增加[21]。此外，沼液中含有的小分子有機酸的快速礦化也可能釋放CO2。另一方面，沼液由于HCO3-、NH4+和小分子物質(zhì)的共存使其中溶解的CO2相對獨立的存在，但當(dāng)施入稻田后，這部分CO2的釋放可能也不容忽視，成為土壤CO2釋放的重要組成部分。因此，土壤呼吸[22]、根系呼吸、沼液中小分子有機酸的礦化、溶解的CO2的釋放、以及碳酸鹽CO2的釋放可能是系統(tǒng)CO2釋放與pH正相關(guān)的主要原因。另一方面，H13CO3-轉(zhuǎn)化的13CO2（13C量）占其添加總量的64.36%。這表明，數(shù)量可觀的H13CO3-仍存留在土壤中。這部分HCO3-可能伴隨水稻根系對NH4+的吸收（H+的釋放）而釋放CO2。顯然，這部分HCO3-的轉(zhuǎn)化可能是一個長期的慢反應(yīng)過程，其可能參與到土壤有機-無機碳的周轉(zhuǎn)過程，特別是對這部分CO2釋放的忽略或考慮不足可能高估稻田土壤有機碳的礦化損失。綜上所述，水稻苗期利用沼液過程中，土壤pH的變化主導(dǎo)著HCO3-的轉(zhuǎn)化以及土壤CO2的釋放。水稻凈光合速率與土壤pH的正相關(guān)可能源于NH4+的轉(zhuǎn)化和利用。這也表明，沼液在酸性或堿性土壤中的應(yīng)用可能對土壤CO2的釋放及水稻生長產(chǎn)生更顯著的影響。

表7 盆栽試驗中水稻光合性狀與環(huán)境因子的相關(guān)性

*：＜0.05；**：＜0.01

圖4 BS處理土壤CO2釋放途徑及機理分析

3.2 沼液中HCO3-對水稻生長的影響

CO2施肥效應(yīng)是指CO2濃度升高增加了葉片的光合作用和生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)力的過程[23]。一般認為，施加沼液后作物產(chǎn)量增加的原因在于沼液改善了土壤性狀進而使作物增產(chǎn)[24]，或者沼液中豐富的營養(yǎng)成分優(yōu)于化學(xué)肥料而直接對作物生長有益[25]。由于HCO3-在沼液中的含量高達7 000 mg·L-1左右，其在土壤中潛在的重要轉(zhuǎn)化路徑之一即是CO2的生成。然而，目前對沼液中HCO3-轉(zhuǎn)化的相關(guān)過程以及其是否存在類CO2施肥效應(yīng)尚不清楚。研究表明，高濃度CO2顯著提高水稻幼苗凈光合速率和水稻生物量[26]。邵在勝等通過開放式大氣CO2濃度增加試驗發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高200 μmol?mol-1時對水稻拔節(jié)期和抽穗開花期的光合作用有顯著的促進作用[27-29]。本試驗中，添加培養(yǎng)液第2—7天，BS處理下凈光合速率顯著高于BS-B處理。并且，培養(yǎng)15 d時水稻植株中13CO2固定量達到了4.05 g·kg-1，H13CO3-利用率為18.54%。顯然，盡管在較短的培養(yǎng)時間（15 d）下，沼液中的H13CO3-通過轉(zhuǎn)化為13CO2且貢獻于水稻幼苗生物量的形成（表4）。結(jié)合凈光合速率與胞間CO2濃度的差異，可以認為，沼液中HCO3-對水稻生長具有類CO2施肥效應(yīng)。

本試驗僅模擬了一次沼液施用（苗期）的效應(yīng)，水稻凈光合速率，胞間CO2濃度率先在BS與BS?B處理表現(xiàn)出顯著差異（圖2），相比較而言，株高、鮮重和干重的差異尚未表現(xiàn)出來（圖3）。這一現(xiàn)象的原因可能在于一次施肥CO2的釋放主要在前2 d（圖1），且水稻處于幼苗期，生物量積累較少，且稻苗收獲時間的早或晚也可能會導(dǎo)致效應(yīng)不明顯或相關(guān)效應(yīng)隨時間延長又被“稀釋”。因此，苗期光合作用參數(shù)可能是最好反映這一效應(yīng)的指標(biāo)。要從生物量與產(chǎn)量指標(biāo)揭示這一施肥效應(yīng)，還需要開展全生育期的系統(tǒng)研究。

此外，BS處理水稻植株固定的13C占到H13CO3-（13C量）的18.54%（表4），這表明，除貢獻于水稻生物量形成之外，仍有數(shù)量可觀的HCO3-存留于土壤中。因此，沼液中的HCO3-并非在施入田間后快速轉(zhuǎn)化為CO2釋放至大氣，增加溫室效應(yīng)氣體的排放。存留于土壤中的這部分HCO3-是否、以及如何參與稻田土壤的碳循環(huán)，特別是對土壤有機碳礦化及作物生長的影響還需要進一步探索。值得進一步關(guān)注的是，添加13C標(biāo)記的BS處理13CO2凈累計釋放量占到土壤-水稻系統(tǒng)CO2凈累計釋放量的比例為0.71%（圖1、表3）。這說明，觀測到的土壤CO2的釋放并非全部源于土壤有機碳的礦化。以往在土壤CO2釋放及評估過程中對無機碳源CO2的忽略或研究不足可能會顯著高估土壤有機碳的損失。

綜上所述，沼液中的HCO3-通過類CO2施肥效應(yīng)貢獻于水稻生長，今后對其生物量與產(chǎn)量的增加幅度還需要在全生育期開展系統(tǒng)研究。目前，沼液保存與資源化利用實踐中，通過酸化、膜吸附等預(yù)先去除沼液中的CO2與HCO3-的做法[30]不僅需要額外的裝置與成本，增加了人為向大氣排放CO2的比例，而且很可能“關(guān)閉”了作物潛在的增產(chǎn)途徑。

本研究揭示了沼液促進作物生長及增產(chǎn)的潛在途徑及機理，這不僅對沼液替代化肥，實施化肥減量具有重要意義，而且有利于沼液中高量無機碳的固定，同時也為沼液究竟是資源化利用，還是視作“污水”進行處置這一長期以來的爭議的解決提供了新的事實與判據(jù)。

4 結(jié)論

4.1 沼液中的HCO3-可以顯著增加土壤CO2釋放速率與釋放量。水稻苗期利用沼液的過程中，土壤pH的變化主導(dǎo)著HCO3-的轉(zhuǎn)化以及土壤CO2的釋放。

4.2 沼液中的HCO3-及其轉(zhuǎn)化的CO2均對水稻生長和光合作用具有顯著的促進作用。且沼液施用條件下，水稻對HCO3-具有更高的利用率。沼液中的HCO3-具有顯著的類CO2施肥效應(yīng)。

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Effect of CO2Like Fertilization on Rice Growth by HCO3-in Biogas Slurry

WAN HuaQin1, 2, GU Xu1, HE HongMei3, TANG YiFan1, SHEN JianHua4, HAN JianGang1,2, ZHU YongLi1, 2

1College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037;2Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037;3Huanghai Seed Stock Farm, Dongtai 224200, Jiangsu;4COFCO Jiajiakang (Jiangsu) Co., Ltd., Dongtai 224200, Jiangsu

【Objective】Biogas slurry is rich in nitrogen (N), which is the basis of its farmland utilization. However, it also contains a large amount of HCO3-. In this study, the conversion of HCO3-in biogas slurry and its effect on rice growth were investigated, in order to provide a new theoretical basis for replacing chemical fertilizer with biogas slurry, reducing the amount of chemical fertilizer, and whether biogas slurry could be utilized as resources. 【Method】Four treatments, including biogas slurry (BS), biogas slurry (BS-B), deionized water plus HCO3-(W+B) and deionized water (W), were set up in this paper. Using13C labeling technology, the characteristics of CO2release were observed through pot experiment at Rice Seedling Stage, and the photosynthetic rate, intercellular CO2concentration, dry and fresh weight, plant height, overlying water and soil pH, and HCO3-and NH4+contents were analyzed. 【Result】(1) Under BS treatment, CO2release rates ranged from 9.55 to 38.07 mg·kg-1·h-1, with a net cumulative release of 4 654.06 mg·kg-1. Under BS-B treatment, the CO2release rates ranged from 4.55 to 17.25 mg·kg-1·h-1, and the net cumulative release was 780.68 mg·kg-1. Under W+B treatment, the CO2release rate was 3.93-26.33 mg·kg-1·h-1, and the net cumulative release was 1 274.07 mg·kg-1. Under W treatment, the CO2release rate was 3.22-11.90 mg·kg-1·h-1, and the cumulative release amount was 2 265.20 mg·kg-1. Under BS treatment, the average CO2release rate was 4.18 times and 2.44 times of BS?B and W+B, respectively, and the net cumulative CO2release was 5.96 times and 3.65 times of BS-B and W+B, respectively, which were significantly higher than those under BS?B and W+B treatments. At the same time, the net cumulative release under BS treatment was greater than the sum of the two treatments (BS-B) + (W+B), and HCO3-had a synergistic effect with other components in biogas slurry on CO2release. (2) The net cumulative release of13CO2under BS treatment was 32.87 mg·kg-1, accounted for 0.71% of the net cumulative release of CO2in soil-rice system. The net cumulative release of13CO2under W+B treatment was 13.18 mg·kg-1. In comparison, the net cumulative release amount of13CO2under BS treatment was significantly higher than that under W+B treatment (＜0.05), indicated that other components in biogas slurry promoted the conversion of HCO3-to CO2. (3) The net photosynthetic rate of BS and BS?B treatments in the first 12 h was significantly higher than that under W+B and W treatments. After the addition of culture medium, the net photosynthetic rate under BS treatment was significantly higher than that under BS?B treatment at 2-7 d, and was significantly higher than that under W+B treatment during the whole culture period (＜0.05). HCO3-in biogas slurry significantly improved the photosynthesis of rice leaves. In comparison, the intercellular CO2concentration was significantly lower than that of the other three treatments 5 days before BS treatment. Rice plant height and fresh weight under BS and BS-B treatments were significantly higher than those under W+B and W treatments (＜0.05), and there was no significant difference in dry weight among the four treatments. (4)The fixed13CO2content of rice seedlings treated by BS was 4.05 g·kg-1, and the utilization rate of marker HCO3-was 18.54%. The fixed amount of13CO2in W+B treatment was 3.29 g·kg-1and the H13CO3-utilization rate was 14.20%. The13CO2of H13CO3-promoted the photosynthesis of rice and was beneficial to the growth of rice. (5) The release rates of CO2and13CO2under BS and W+B treatments were significantly correlated with overlying water and soil HCO3-content and pH. At the same time, the photosynthetic rate of rice under BS and W+B treatments was significantly positively correlated with HCO3-content in soil. 【Conclusion】When biogas slurry was returned to the field, a large amount of HCO3-transformation significantly promoted the release of CO2, which was beneficial to rice photosynthesis. Soil HCO3-content and soil pH value were important factors for affecting CO2release and rice photosynthesis. At the same time, the rice had a higher utilization rate of HCO3-in biogas slurry, and HCO3-in biogas slurry had obvious CO2-like fertilization effect.

biogas slurry; HCO3-;13C marking; rice; CO2fertilization effect; photosynthesis

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.010

2021-09-22；

2021-12-16

國家重點研發(fā)計劃（2017YFC0505803）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（PAPD）

萬華琴，E-mail：wanhuaki@163.com。通信作者韓建剛，E-mail：hjg@njfu.edu.cn。通信作者朱詠莉，E-mail：lyly1262011@126.com

（責(zé)任編輯 李云霞）