花生高親和硝酸鹽轉運蛋白基因AhNRT2.7a響應低氮脅迫的功能研究

王娟，陳皓寧,2，石大川，于天一，閆彩霞，孫全喜，苑翠玲，趙小波，牟藝菲，王奇，李春娟，單世華

花生高親和硝酸鹽轉運蛋白基因響應低氮脅迫的功能研究

1山東省花生研究所，山東青島 266100；2中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000；3青島市農業(yè)科學研究院，山東青島 266100

【目的】氮素在作物生產中對生物量和產量起關鍵作用。高親和硝酸鹽轉運蛋白基因NRT2在植物響應低氮脅迫時被激活并具有維持氮吸收和轉運的作用。通過篩選花生低氮耐受相關的NRT2基因并解析其生物學功能，為培育高氮素利用率的花生新品種提供理論參考，最終有助于實現(xiàn)節(jié)氮、高效的綠色生產目標。【方法】檢測正常氮濃度及1/20正常氮濃度（15 mmol·L-1）條件下5個具有典型跨膜結構的花生NRT2基因（、、、和）的時空表達情況。以花育6309的cDNA為模板，對進行克隆和生物信息學分析，并通過亞細胞定位確定的表達部位。進一步構建異源過表達的擬南芥株系，分別在正常以及低氮脅迫條件下測定其葉綠素含量、氮積累量以及谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酸脫氫酶（GDH）5個氮代謝關鍵酶的活性。【結果】5個NRT2基因中有4個NRT2基因在花生響應低氮脅迫條件下大量表達。其中，能夠響應低氮脅迫，并在花生莖和葉中高表達。獲得的cDNA序列，全長為1 380 bp，編碼459個氨基酸。蛋白結構分析顯示其為具有12個典型跨膜結構域的膜蛋白。該氨基酸序列與栽培種花生（L.）相似性高達99.56%，其次是野生親本AA和BB基因組花生。亞細胞定位顯示其主要定位于細胞質膜上。構建異源過表達的轉基因擬南芥植株，在不同供氮條件下，成熟葉和幼葉葉片的葉綠素相對含量均顯著高于野生型擬南芥。同時，對上述5個氮代謝相關酶活性以及氮、磷、鉀積累量測定顯示，轉基因植株中2個氮代謝相關酶（GS和NR）的酶活性以及氮積累量均比野生型擬南芥有顯著升高。【結論】花生中4個NRT2基因響應低氮脅迫，其中能夠提高植物氮代謝過程的氮素利用率。的表達在促進氮代謝過程的同時，促使碳代謝作用的進一步加強。因此，適合作為花生氮素高效利用為目的的候選基因。

花生；；；氮素效率；氮代謝相關酶

0 引言

【研究意義】花生（L.）是重要的油料作物和經濟作物，在保障中國食用油脂安全方面具有重要作用[1]。花生除了根瘤菌固氮外，根系吸收土壤中的硝態(tài)氮也是氮素利用的一種重要方式，占花生需氮量的50%—60%[2-4]。氮素參與了氨基酸、蛋白質和磷脂等必需物質的合成過程，同時也作為信號分子調控植物的形態(tài)建成、生理響應以及相關基因的表達。因此，氮素是影響花生生長發(fā)育和產量形成的重要因素[5]。合理施用氮肥不僅可以提高花生的產量和品質，而且能夠更有效地發(fā)揮根瘤的固氮作用。然而，目前投入的氮肥僅約30%可以被吸收并轉化為農業(yè)生產力，過量施用氮肥不僅導致花生根瘤數目減少，自身固氮能力下降[6]，同時還造成一系列的環(huán)境污染問題，如土壤酸化板結、氮磷失衡、水體污染、病蟲害易發(fā)等[7-10]。因此，選育高氮素利用率（nitrogen use efficiency，NUE）的低氮耐受型花生新品種，對花生生產的綠色協(xié)調發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】陸地植物中氮素的吸收、轉運和儲存主要由硝酸鹽轉運蛋白（nitrate transporter，NRT）來完成[5]。當NO3-濃度低于1 mmol·L-1時，其吸收主要依靠由高親和硝酸鹽轉運蛋白（NRT2）轉運蛋白組成的高親和轉運系統(tǒng)（high-affinity transport system，HATS）完成。NRT2轉運蛋白屬于膜蛋白，一般具有典型的10—12個跨膜蛋白結構，且只把硝酸鹽作為特異性底物[11-12]。NRT2能夠在植物響應低氮脅迫時被激活并發(fā)揮主導作用[5, 13]，具有維持低氮條件下氮轉運的作用[14-15]。因此，NRT2基因適合作為篩選高氮素利用率的低氮耐受型花生新品種的目標基因。目前，植物高親和硝酸鹽轉運蛋白基因（NRT2）功能機制研究取得一定的進展。如，擬南芥（）7個AtNRT2家族基因成員中，和負責擬南芥中硝酸鹽的吸收，主要在主根的較老部分表達；在主根的幼嫩部分和側根的遠端區(qū)域表達；在主根和側根的根毛區(qū)表達，二者在受到低氮脅迫時才會誘導表達[16-17]。玉米（s）ZmNRT2.1與NAR2蛋白相互作用，在其初生根的誘導型高親和轉運系統(tǒng)（iHATS）的硝酸鹽吸收中起主要作用[18-19]。水稻（）的5個OsNRT2基因中，在根周圍的薄壁細胞中表達，負責木質部NO3-從根到地上部的長距離運輸[20]。在葉片韌皮部表達，在NO3-再活化和韌皮部pH平衡中起關鍵作用[21]。豆科植物苜蓿（）在根中高表達，并與苜蓿氮素吸收有關[22]。以上研究表明，不同作物中，各NRT2基因的表達部位具有組織特異性，多數作物的NRT2基因均具有在低氮條件下促進植物對硝酸鹽的吸收和轉運的功能，從而參與了響應低氮脅迫的生理過程[23-24]。除此之外，NRT2家族基因還可能與作物的氮素利用效率相關。Chen等[25]通過過量表達獲得轉基因植株，與野生型相比，其生物量、籽粒產量和氮素利用率均出現(xiàn)顯著提升。Fan等[21]發(fā)現(xiàn)在水稻中超表達能夠極大提高水稻的氮素利用率和產量。然而，目前尚未見有關花生基因與氮素利用效率的報道。【本研究切入點】栽培種花生屬于異源四倍體（AABB）植物，亞基因組間的高度相似性以及花生遺傳轉化技術不穩(wěn)定性對花生基因功能驗證造成了困難。近年來，研究表明花生基因組信息的釋放[26-28]以及擬南芥、煙草等模式植物轉基因異源研究體系為花生功能基因研究提供了有效途徑[29]。花生氮素利用相關基因功能研究是進行花生遺傳改良的重要理論基礎。目前已發(fā)掘和鑒定的花生氮素利用相關途徑關鍵基因還十分有限，相關基因的功能解析和表達調控的研究也尚未見報道。前期王娟等[30]利用栽培種花生全基因組關聯(lián)分析和不同組織的轉錄組信息共鑒定10個NRT2基因家族成員。其中，、、、和是具備典型跨膜結構的膜蛋白[31-32]。參與了硝態(tài)氮吸收和轉運，但是，該基因在花生中是否能夠響應低氮脅迫，相關生物學功能尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究以花育6309為試驗材料，對以上5個NRT2家族基因展開響應低氮脅迫的時空表達分析，并對進行克隆、序列分析和亞細胞定位，通過構建異源表達植株來解析其功能，為通過遺傳改良選育具有高氮素利用率的低氮耐受型花生新品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 正常氮和低氮條件下花生植株的培養(yǎng)

以花育6309為試驗材料，共選取100粒健康種子進行催芽處理，即在水中進行24 h浸種處理后，挑選60粒發(fā)芽一致的種子置于濾紙浸潤的培養(yǎng)皿上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待種子出芽后，將花生插入帶孔的水培方盒中長至四葉期時，摘除花生子葉，緩苗后在不同供氮條件下培養(yǎng)。正常氮處理為改良Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)（Coolaber，中國北京），低氮處理則為1/20正常氮濃度（15 mmol·L-1）的低氮Hoagland營養(yǎng)液，其中，缺少的Ca2+、K+分別用CaCl2·H2O和K2SO4補足。置于16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每2—3 d更換１次Hoagland營養(yǎng)液，培養(yǎng)過程中營養(yǎng)液保持通氣狀態(tài)。

1.2 不同供氮條件下花生表型測定

觀察不同供氮條件下花生植株的表型，測定內容如下：

根系形態(tài)：每個時期取3株花生植株的根系，用吸水紙吸干根系表面水分，用Epson7500雙面光源掃描儀（愛普生有限公司，中國北京）掃描根系并保存圖像，通過WinRHIZO根系分析系統(tǒng)（瑞金特儀器有限公司，加拿大魁北克）測定并計算不同直徑（0—1 mm、1—2 mm及> 2 mm）根長、根表面積及根體積。

干物質重：每處理取3株花生植株，并將莖葉和根分開，105℃殺青30 min，80℃烘至恒重后，分別稱重并記錄。

葉綠素含量測定：使用葉綠素含量測定儀（SPAD-502）對不同供氮條件下的花生成熟葉和幼葉中的葉綠素相對含量進行測定。每次重復測定4—5次，取平均值。使用Origin 9.8分析軟件進行數據分析，采用檢驗進行差異顯著性分析。

1.3 不同供氮條件下取樣策略及時空表達分析

為檢測NRT2家族基因在花生生長發(fā)育過程中的表達是否響應低氮脅迫，在正常氮/低氮條件下，以花育6309為材料，在不同發(fā)育時間的根、莖、葉等組織進行取樣，采用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa生物技術有限公司，中國北京）進行RNA提取，并使用PrimeScrit? RT Kit with gDNA eraser反轉錄試劑盒（perfect real-time, TaKaRa生物技術有限公司，中國北京）合成cDNA。利用Primer Premier 6.0設計實時熒光PCR特異引物，以為內參基因（表1）。使用TB Green Premix Ex Taq? Ⅱ試劑盒（TaKaRa生物技術有限公司，中國北京）進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測，反應體系為20 μL，包含TB Green Premix Ex Taq II 10 μL、引物（F/R）各0.8 μL、cDNA模板2 μL和ddH2O 6 μL。反應程序為95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 10 s，測熒光值，38個循環(huán)；95℃ 15 s，65—95℃每增加0.5℃讀取熒光1次，繪制熔解曲線。每個反應3個重復，采用2－△△CT法進行計算。利用Origin 9.8軟件和Microsoft Excel 2019軟件處理和分析試驗數據。

表1 5個NRT2基因及其引物序列

1.4 AhNRT2.7a的克隆

根據栽培種花生基因組測序注釋信息，結合NCBI數據庫相關序列，檢索獲得的CDS序列，使用Primer Premier 6.0設計特異引物，以花育6309的cDNA為模板進行基因片段擴增。擴增體系為2× EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL、DNA模板0.5 μL、正向引物（10 μmol·L-1）1 μL、反向引物（10 μmol·L-1）1 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應程序為95℃ 5 min；94℃ 50 s；58℃ 1 min，72℃50 s，34個循環(huán)；72℃ 7 min。用1%瓊脂糖（US EVERBRIGHT，中國蘇州）凝膠電泳檢測、回收，與pMD-18T載體連接，并轉化大腸桿菌DH5α，經過質粒提取和酶切鑒定后，將所獲得的陽性克隆送至華大科技公司測序。

1.5 花生AhNRT2.7a的生物信息學分析

利用NCBI Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）對測序結果進行檢索，DNAMAN軟件分析基因的全長序列和氨基酸序列。使用在線軟件Exon-Intron Graphic Make（http://www.wormweb.org/exonintron）繪制基因結構圖，采用在線軟件Compute pI/Mw（http://web.espasy.org/protparam）計算蛋白質分子量和等電點，SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）和PHYRE2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預測蛋白質二級結構和三級結構，PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位預測，TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質的氨基酸疏水性和跨膜結構，ProScale（http://web.expasy.org/protscale/）計算疏水性。對花生與其他物種中硝酸鹽轉運蛋白基因進行系統(tǒng)進化分析。利用Clustal X軟件的聚類比較和MEGA7.0軟件的鄰位相近法（Neighbor-Joining）建樹，研究與其他物種中同源基因的系統(tǒng)進化關系。

1.6 亞細胞定位

使用高保真酶Pfu擴增獲得去掉終止密碼子并在兩端連有酶切接頭的的CDS序列，通過酶切、連接進入pCAMBIA1301-eGFP載體，獲得AhNRT2.7a-GFP融合表達載體。對擬南芥植株進行原生質體提取，取330 μL原生質體，加入5—10 μg（20 μL）AhNRT2.7a-GFP融合表達載體，加入350 μL PEG4000溶液介導轉化，28℃，40 r/min暗培養(yǎng)20—24 h，將轉化好的細胞進行FM4-64染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄。

1.7 轉基因擬南芥的獲得

將克隆獲得的花生基因與改造過的過表達載體SN1301進行重組，并轉化農桿菌。采用蘸花法轉化擬南芥，用含潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基篩選轉化子。根據抗病或感病植株對潮霉素的分離比例，篩選出含有單一插入（全長編碼區(qū)）的株系，從而獲得純合株系，并進一步獲得轉基因擬南芥T3株系。

1.8 低氮處理下野生型和轉基因植株的氮積累量及氮代謝相關酶活性生理指標的測定

以無菌蛭石為基質，定期澆灌正常和低氮Hoagland營養(yǎng)液，分別培養(yǎng)野生型和轉基因擬南芥植株。待處理至8周左右，取正常和低氮條件下的轉基因和野生型擬南芥葉片，采用堿水解法、碳酸氫鈉浸提法和乙酸銨浸提法分別測定不同供氮條件下的氮、磷、鉀含量。同時，由于植物氮代謝過程與氮代謝相關酶的活性緊密相關，取不同供氮濃度下的轉基因株系和野生型擬南芥葉片（>50 mg），在液氮中研磨至粉末狀，置于PBS勻漿液（pH=7.2—7.4，濃度為0.01 mol·L-1），勻漿比為10%。勻漿后，冰浴5 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液，按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒（MDBio. Inc,，中國臺灣）操作步驟分別測定谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）這5種氮代謝相關酶的活性。使用BCA法蛋白含量測定試劑盒（ADS-W- SP002）檢測樣本中總蛋白的含量，并計算組織樣本每毫克蛋白中的酶活性表達量。

2 結果

2.1 低氮脅迫下花生植株的表型

通過對正常和低氮條件下花生地上和地下部的干重分別進行測定（圖1-a—b），花生地上和地下部分的干重均隨生長而持續(xù)積累，但是，與低氮條件相比，正常供氮條件下的花生地上和地下兩部分的干重顯著增加。此外，正常供氮條件下，花生葉的葉綠素含量基本保持穩(wěn)定，而低氮條件下，花生葉中葉綠素的含量呈顯著下降趨勢（圖1-c）。

正常供氮和低氮條件下，花生的根長、根面積和根體積均會隨著處理時間的增加總體呈上升趨勢（圖1-d—f）。正常供氮條件下，根長增加9.30倍，根體積增加3.61倍，根面積增加6.38倍；低氮條件下，根長增加4.31倍，根體積增加2.10倍，根面積增加2.99倍。通過檢驗，2種培養(yǎng)條件下，根長、根面積和根體積的生長差異顯著。

2.2 花生5個NRT2基因的表達模式

利用qRT-PCR對花生不同發(fā)育時期組織中NRT2基因的表達模式進行分析。與低氮條件相比，正常供氮條件下的表達水平顯著升高，說明花生可能受氮誘導表達（圖2）。雖然和為同源基因，但二者表達模式存在明顯差異。低氮脅迫條件下，在花生的根和莖中被誘導表達，而主要在莖和葉中被誘導表達，說明2個同源基因的表達部位存在差異。和2.7主要在花生的莖和葉中表達，且表達量均受低氮脅迫誘導，其在葉中大量表達的時期為第四周（w4），明顯晚于在莖中大量表達的時期（第三周，w3，圖2）。

2.3 AhNRT2.7a的cDNA全長克隆

鑒于能夠響應低氮脅迫，并在花生莖和葉中高表達。根據栽培種花生基因組基因注釋信息，設計引物并擴增、測序，獲得長度為1 380 bp的CDS全長序列（圖3），并且5′和3′端非編碼區(qū)長度分別為104和289 bp。

2.4 AhNRT2.7a氨基酸同源性及進化樹分析

根據NCBI網站BlastX的同源比對結果，構建花生高親和硝酸鹽轉運蛋白AhNRT2.7a與野生花生2個親本（，）、牧豆樹（）、開心果樹（）等NRT2.7蛋白的進化樹（圖4）。AhNRT2.7a蛋白的氨基酸序列與栽培種花生（，XP_025658933.1）相似性最高，達99.56%；其次與野生親本BB基因組花生（，XP_016207043.1）、野生親本AA花生基因組（，XP_020980850.1）的相似性分別為99.47%和97.36%。

運用ClustalX2對包含（At5g14570）在內的擬南芥7個NRT2家族基因與進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與擬南芥的氨基酸序列同源性較高（圖5），說明二者可能存在相似的理化性質。

2.5 AhNRT2.7a蛋白結構分析

DNAMAN軟件分析結果表明，該基因cDNA序列編碼459個氨基酸，預測具有12個典型跨膜結構域（圖6）。Compute pI/Mw在線軟件分析顯示，該蛋白分子量為49.35 kD，理論等電點為8.52。

經SPOMA在線軟件預測，分別對花生AhNRT2.7a和擬南芥AtNRT2.7的蛋白質二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)AhNRT2.7a蛋白質二級結構中α-螺旋約占44.23%，片層結構約占18.74%，β轉角約占6.54%，無規(guī)則卷曲約占30.50%。AtNRT2.7蛋白質二級結構中α-螺旋約占45.44%，片層結構約占17.85%，β-轉角約占5.68%，無規(guī)則卷曲約占31.03%（圖7-a和圖7-b）。使用PHYRE2在線軟件對三級結構建模，結果顯示，2種蛋白的三級結構比較相似，推測二者功能存在一定差異（圖7-c和圖7-d）。

a：地上部干重；b：地下部干重；c：葉綠素含量；d：根長；e：根面積；f：根體積。W1—W8：低氮處理后第一周到第八周。*：在0.05水平差異顯著；**：在0.01水平差異顯著。下同

2.6 AhNRT2.7a蛋白的亞細胞定位

通過構建AhNRT2.7a-GFP融合表達載體，進行原生質體瞬時表達，發(fā)現(xiàn)對照組GFP蛋白在整個原生質體內均有分布，而AhNRT2.7a-GFP融合蛋白主要位于質膜，因此，推測AhNRT2.7a蛋白主要定位于細胞的質膜上（圖8）。

2.7 AhNRT2.7a異源表達擬南芥植株的構建與生理參數的測定

將花生與改造的過表達載體SN1301連接。使用農桿菌介導轉化野生型擬南芥，獲得T1代陽性植株10株，T2代陽性植株6株。經過連續(xù)3代鑒定和潮霉素培養(yǎng)基篩選，成功獲得3株異源表達擬南芥株系1、株系2和株系6（圖9）。運用實時熒光定量PCR檢測，顯示在3個株系中均出現(xiàn)大量表達，其中，株系2和株系6的表達量分別是株系1的6倍和4倍（圖10）。

圖2 正常供氮和低氮條件下5個NRT2基因的時空表達分析

圖3 AhNRT2.7a的基因結構

CcNRT2.7：中華辣椒，XP_006446558.1；CsNRT2.7：黃瓜，XP_006470276.1；PvNRT2.7：開心果，XP_031286542.1；RcNRT2.7：月季，XP_002524664.1；JrNRT2.7：核桃，XP_002524664.1；QsNRT2.7：栓皮櫟，XP_023902820.1；QlNRT2.7：白櫟，XP_030953885.1；PaNRT2.7：白牧豆樹，XP_028772303.1；AhNRT2.7a：栽培種花生，XP_025658933.1，XP_025606205.1；AiNRT2.7a：野生花生，XP_016207043.1；AdNRT2.7a：野生花生，XP_020980850.1；AtNRT2.7：擬南芥，NP_196961.1；NsNRT2.7：美花煙草，XP_009757883.1；StNRT2.7：馬鈴薯，XP_006357155.1；SpNRT2.7：潘那利番茄，XP_015064439.1；SlNRT2.7：番茄，XP_004233327.2；FvNRT2.7：野草莓，XP_004306358.1；PaNRT2.7-like：白牧豆，PON41596.1

圖5 AhNRT2.7a與擬南芥NRT2家族基因氨基酸的序列比對

圖6 AhNRT2.7a蛋白跨膜區(qū)預測

a、b：AhNRT2.7a和AtNRT2.7的二級結構預測；c、d：AhNRT2.7a和AtNRT2.7的蛋白3D建模

以滅菌蛭石為培養(yǎng)基種植異源表達擬南芥以及野生型擬南芥，分別在正常氮含量和1/20氮含量的Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)8周左右，發(fā)現(xiàn)異源過表達株系的生長情況（植株大小、葉片數目和形態(tài)等）明顯優(yōu)于野生型（圖11-a）。2種供氮條件下分別取擬南芥野生型和轉基因株系的成熟葉和幼葉，異源表達株系中2組葉片的葉綠素相對含量均顯著高于野生型擬南芥（圖11-b），表明擬南芥中異源表達能夠顯著提高植株的葉綠素含量，而有研究已指出碳代謝與根瘤固氮呈密切正相關。

與低氮脅迫相比，在正常供氮條件下，野生型和轉基因擬南芥的地上部干重均增加（圖12）。低氮和正常供氮條件下，野生型的地上部干重均顯著小于3個轉基因擬南芥株系。低氮條件下，轉基因株系地上部干重約增長42%，而正常供氮條件下，轉基因株系地上部干重約增長35%。

圖8 AhNRT2.7a的亞細胞定位

a：T0代陽性苗鑒定；b：T1陽性苗鑒定；c：T2陽性苗潮霉素篩選

2.8 轉AhNRT2.7a擬南芥中氮代謝關鍵酶活性的變化

測定3個轉基因株系與野生型擬南芥的氮、磷、鉀積累量以及氮代謝相關酶（如谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酸脫氫酶（GDH））的活性，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥中硝酸還原酶（NR）活性、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、氮積累量均顯著升高（圖13）。結果表明，能夠影響擬南芥的氮吸收效率，即可能參與花生的氮代謝過程，又能夠通過影響氮的吸收，進一步影響其他元素的吸收和同化效率。

圖10 轉基因擬南芥株系AhNRT2.7a的表達分析

同時，在低氮脅迫條件下，與野生型擬南芥相比，轉基因株系氮的積累量顯著增高（圖14）。與正常供氮條件相比，野生型擬南芥在低氮脅迫下的氮積累量顯著下降，而3株轉基因株系的氮積累量幾乎沒有下降。此外，低氮脅迫下轉基因株系鉀的積累量也顯著升高，而磷的積累量幾乎沒有變化。

3 討論

氮素吸收與利用是作物的生長發(fā)育和產量形成的重要保證[2]。提高作物氮素利用率是作物育種重要的研究方向[8]。氮素利用率是一個涉及遺傳因素和環(huán)境因素的復雜性狀[5, 31-32]。隨著相關研究的深入，發(fā)現(xiàn)影響氮素利用率的主要瓶頸是作物本身，即作物不同品種之間的總吸氮量、氮轉化和同化有明顯的差異[33-35]。因此，選育低氮耐受型作物新品種，減少氮肥施用量，充分發(fā)揮其利用土壤中氮素的能力，能夠從根本上提高氮素利用率。由NRT2家族組成的高親和轉運系統(tǒng)負責低氮條件下硝態(tài)氮的吸收和轉運，是通過遺傳改良獲得低氮耐受型花生新品種的重要目標基因。但是，花生中該家族基因的功能研究尚未見報道。本研究對該家族能夠響應低氮脅迫的家族成員進行了篩選，并且對不同供氮條件下差異表達最顯著的進行功能分析，表明能夠提高植物氮代謝過程的氮素利用率，可為遺傳改良獲得高氮素利用率的花生新品種提供重要依據。

a：不同氮含量條件下擬南芥轉基因株系的生長情況；b：擬南芥轉基因株系成熟葉與幼葉葉綠素含量相關SPAD值的測定。N：正常氮；A：低氮。1、2、6：轉基因擬南芥株系；WT：野生型。下同

圖12 不同供氮條件下轉基因擬南芥株系地上部干重的變化

NR：硝酸還原酶；NiR：亞硝酸還原酶；GS：谷氨酰胺合成酶；GOGAT：谷氨酸合成酶；GDH：谷氨酸脫氫酶

圖14 不同供氮條件下轉基因株系中氮、磷、鉀積累的測定

3.1 低氮脅迫下NRT2家族基因的表達模式

栽培種花生全基因組基因注釋和轉錄組數據的釋放有利于花生中重要功能基因的挖掘[26-28]。前期根據預測的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其中5個NRT2具有家族典型的跨膜結構域[29]。本研究首先根據不同供氮條件下花生各個發(fā)育時期不同組織中基因的表達模式分析，發(fā)現(xiàn)主要受到氮的誘導表達；和可能參與花生的不同組織響應低氮脅迫；和在低氮條件下的花生莖葉組織中被誘導表達。總之，響應低氮脅迫且相對表達量升高最為顯著，更適合作為研究花生響應低氮脅迫的目標基因。

經過同源序列比對，花生和擬南芥屬于同源基因，該同源基因在擬南芥種子中特異性表達，并且是位于液泡膜中的唯一NRT2轉運蛋白[36-37]。突變體的種子硝酸鹽含量降低了35%—70%，說明負責將硝酸鹽轉運到液泡中[21]。有研究表明，擬南芥家族成員和在低氮脅迫下參與了高親和硝酸鹽吸收過程[17, 38]此外，小麥（）和在低氮脅迫下的表達量在不同的時間點均顯著上升，說明上述2個基因響應低氮脅迫并維持正常的生命活動[39]。水稻參與調控不同濃度的NO3-誘導的側根發(fā)生和NO3-在體內的轉運以及低氮條件下的氮素再分配[40]。綜上可知，NRT2家族基因在功能分化上是具有物種特異性的。并且，即使是同源的NRT2基因，在表達模式和生物學功能上存在物種水平的差異。

3.2 低氮脅迫下AhNRT2.7a功能解析

由于目前花生中尚未建立成熟的遺傳轉化體系，因此，將花生基因在擬南芥、煙草等模式植物中異源表達并研究相應的功能是花生功能基因研究的有效途徑。如Liu等[41]挖掘出與種子大小相關的關鍵基因并經擬南芥轉化研究表明是由增強脂肪酸和甘油三酯合成來增加種子重量。本研究通過構建擬南芥異源表達植株，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比，各項生理參數包括根長、干物質重以及固氮量有顯著提高，表明在擬南芥中異源表達能夠顯著提高植株的氮素利用率。無論是正常供氮還是低氮脅迫的條件下，植株的實際生長狀況也出現(xiàn)了明顯的改善。

植物的碳代謝和氮代謝的關系非常密切[42]。光合碳代謝與NO3-同化都發(fā)生在葉綠體內，碳氮代謝都需要消耗來自CO2同化和光合以及其他電子傳遞鏈的有機碳和能量。總之，碳代謝為根瘤固氮提供能量，而根瘤固氮為花生葉片提供氮素營養(yǎng)，二者共同調節(jié)花生碳氮代謝及營養(yǎng)平衡。通過在擬南芥中異源表達，植株中葉綠素含量顯著提高，增幅在5%—10%，這意味著的表達在促進氮代謝過程的同時，也促使碳代謝作用的進一步加強。

NO3-的同化過程中，先后被硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）還原成銨，再在谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）的催化下，形成其他氨基酸或含氮化合物[17, 33, 43]。因此，氮代謝相關酶活性是與植物的氮素利用率直接相關的。低氮條件下的酶活性要顯著強于正常氮條件下的酶活性，說明擬南芥本身就存在通過提高氮代謝相關酶活性來應對低氮脅迫的響應機制。而在擬南芥中異源表達，無論在何種供氮條件下，均能顯著提高氮代謝相關酶活性。這說明可能是通過促進氮代謝相關酶活性的方式，產生了異源表達擬南芥高效響應低氮脅迫的影響。同時，3個轉基因株系中酶活性情況并不完全相同：株系1和株系2在不同供氮條件下的酶活性仍然表現(xiàn)出一定的差異，即低氮條件下的酶活性要顯著強于正常氮條件下的酶活性；而株系6在不同供氮條件下的酶活性基本一致。關于這種差異的機理仍需要后續(xù)研究來解析。

4 結論

花生5個高親和硝酸鹽轉運蛋白基因（NRT2）中，響應低氮脅迫且相對表達量升高最為顯著，較適合作為研究花生響應低氮脅迫的目標基因。擬南芥同源基因在種子中特異性表達并且是液泡膜中的唯一NRT2轉運蛋白，而花生低氮條件下在莖、葉組織中顯著表達，說明即使是同源的NRT2基因，在表達模式和生物學功能上存在物種水平的差異。擬南芥異源表達能夠顯著提高植株的氮素利用率。并且，無論是正常供氮還是低氮脅迫條件下，轉基因植株的實際生長狀況均出現(xiàn)了明顯的改善。的表達在促進氮代謝過程的同時，還促使了碳代謝作用的進一步加強。表明適合作為花生氮素高效利用為目的的候選基因。

[1] 廖伯壽. 我國花生生產發(fā)展現(xiàn)狀與潛力分析. 中國油料作物學報, 2020, 42(2): 161-166.

LIAO B S.Analysis on development status and potential of peanut production in China. Chinese Journal of Oil Crops Sciences, 2020, 42(2): 161-166. (in Chinese)

[2] 李向東, 萬勇善, 張高英, 吳愛榮, 馬曉東. 夏花生覆膜對根瘤中固氮酶和葉片硝酸還原酶活性影響的研究. 作物學報, 1996, 22(1): 96-100.

LI X D, WAN Y S, ZHANG G Y, WU A R, MA X D. Effects of film mulching on nitrogenase and nitrate reductase activities in root nodules of peanut in summer. Acta Agronomica Sinica, 1996, 22(1): 96-100. (in Chinese)

[3] 李向東, 王曉云, 張高英, 萬勇善, 李軍. 花生衰老的氮素調控. 中國農業(yè)科學, 2000, 33(5): 1-7.

LI X D, WANG X Y, ZHANG G Y, WAN Y S, LI J. Regulation of nitrogen in peanut senescence. Scientia Agricultura Sinica, 2000, 33(5): 1-7. (in Chinese)

[4] ROY S, LIU W, NANDETY R S, CROOK A, MYSORE K S, LISLARIU C I, FRUGOLI J, DICKSTEIN R, UDVARDI M K. Celebrating 20 years of genetic discoveries inand symbiotic nitrogen fixation. The Plant Cell, 2019, 32(1): 15-41.

[5] WANG Y Y, CHENG Y H, CHEN K E, TSAY Y F. Nitrate transport, signaling, and use efficiency. Annual Review of Plant Biology, 2018, 69: 85-122.

[6] 劉穎, 張佳蕾, 李新國, 張正, 萬書波. 豆科作物氮素高效利用機制研究進展.中國油料作物學報, 2022, 44(3): 476-482.

LIU Y, ZHANG J L, LI X G, ZHANG Z, WAN S B. Research progress on nitrogen efficient utilization mechanism of leguminous crops. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2022, 44(3): 476-482. (in Chinese)

[7] CHEN C Z, LU X F, LI J Y, YI H Y, GONG J M.is another essential component in the regulation of nitrate reallocation and stress tolerance. Plant Physiology, 2012, 159: 1582-1590.

[8] 于飛, 施衛(wèi)明. 近10年中國大陸主要糧食作物氮肥利用率分析. 土壤學報, 2015, 52(6): 1311-1324.

YU F, SHI W M. Analysis of nitrogen use efficiency of main grain crops in mainland China in recent 10 years. Acta Pedologica Sinica, 2015, 52(6): 1311-1324. (in Chinese)

[9] WEST P C, GERBER J S, Engstrom P M, Engstrom P M, Mueller N D, Brauman K A, Carlson K M, Cassidy E S, Johnston M, Macdonald G K, Ray D K. Leverage points for improving global food security and the environment. Science, 2014, 345(6194): 325-328.

[10] 張衛(wèi)峰, 馬林, 黃高強, 武良, 陳新平, 張福鎖. 中國氮肥發(fā)展、貢獻和挑戰(zhàn). 中國農業(yè)科學, 2013, 46(15): 3161-3171.

ZHANG W F, MA L, HUANG G Q, WU L, CHEN X P, ZHANG F S. Nitrogen fertilizer development, contribution and challenge in China. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(15): 3161-3171. (in Chinese)

[11] LERAN S, VARALA K, BOYER J C, CHIURAZZI M, CRAWFORD N, DANIEL-VEDELE F, DAVID L, DICKSTEIN R, FERNANDEZ E. A unified nomenclature of NITRATE TRANSPORTER1/PEPTIDE TRANSPORTER family members in plants. Trends in Plant Science, 2014, 19: 5-9.

[12] GALVAN A, FERNANDEZ E. Eukaryotic nitrate and nitrite transporter. Cellular and Molecular Life Science, 2001, 58: 225-233.

[13] 張合瓊, 張漢馬, 梁永書, 南文斌.植物硝酸鹽轉運蛋白研究進展. 植物生理學報, 2016, 52(336): 4-12.

ZHANG H Q, ZHANG H M, LIANG Y S，NAN W B. Research progress of nitrate transporter in plants. Plant Physiology Journal, 2016, 52(336): 4-12. (in Chinese)

[14] OKAMOT M, KUMAR A, LI W B, WANG Y, SIDDIQI M Y, CRAWFORD N M, GLASS A D M. High-affinity nitrate transport in roots ofdepends on expression of the-like gene AtNRT3.1. Plant Physiology, 2006, 140: 1036-1046.

[15] FORDE B G. Nitrate transporters in plants: structure, function and regulation. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 2000, 1465(1/2): 219-235.

[16] ORSEL M, CHOPIN F, LELEU O, SMITH S H, KRAPP A, DANIEL-VEDELE F, MILLER A J. Characterization of a two- component high-affinity nitrate uptake system inPhysiology and protein-protein interaction. Plant Physiology, 2006, 142: 1304-1317.

[17] LEZHNEVA L, KIBA T, FERIA-BOURRELLIER A B, LAFOUGE F, BUOTET-MERCEY S, ZOUFAN P, SAKAKIBARA H, DANIEL-VEDELE F, KRAPP A. Thenitrate transporter NRT2.5 plays a role in nitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants. Plant Journal for Cell and Molecular Biology, 2014, 80(2): 230-241.

[18] PENUELAS J, SARDANS J. The global nitrogen-phosphorus imbalance. Science, 2022, 375: 6578.

[19] LIU J, CHEN F, Olokhnuud C, Glass A D M, Tong Y, Zhang F, Mi G. Root size and nitrogen uptake activity in two maize () inbred lines differing in nitrogen use efficiency. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 2009,172(2): 230-236.

[20] TANG Z, FAN X, LI Q, FENG H, MILLER A J, SHEN Q, XU G. Knockdown of a rice stelar nitrate transporter alters long-distance translocation but not root influx. Plant Physiology, 2012, 160(4): 2052-2063.

[21] FAN X, TANG Z, TAN Y, ZHANG Y, LUO B, YANG M, XU, G. Overexpression of a pH-sensitive nitrate transporter in rice increases crop yields. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2016, 113(26): 7118-7123.

[22] PELLIZZARO A, CLOCHARD T, PLANCHT E, LIMAMI A M, MORERLEORER-LE PAVEN M C. Identification and molecular characterization ofandfamilies. Physiologia Plantarum, 2015, 154(2): 256-269.

[23] VON WITTGENSTEIN N J, LE C H, HAWKINS B J, EHLTING J. Evolutionary classification of ammonium, nitrate, and peptide transporters in land plants. BMC Evolutionary Biology, 2014, 14: 11.

[24] 宋田麗, 周建建, 徐晨曦, 蔡曉峰, 戴紹軍, 王全華, 王小麗. 植物硝酸鹽轉運蛋白功能及表達調控研究進展. 上海師范大學學報(自然科學版), 2017, 46(5): 740-750.

SONG T L, ZHOU J J, XU C X, CAI X F, DAI S J, WANG Q H, WANG X L. Research progress on function and expression regulation of Nitrate transporter in plants. Journal of Shanghai Normal University (Nature Sciences), 2017, 46(5): 740-750. (in Chinese)

[25] CHEN J, ZHANG Y, TAN Y, ZHANG M, ZHU L, XU G, FAN X. Agronomic nitrogen-use efficiency of rice can be increased by drivingexpression with thepromoter. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(8): 1705-1715.

[26] ZHUANG W J, CHEN H, YANG M, WANG J P, PANDEY M K, ZHANG C, CHANG W C, ZHANG L S, ZHANG X T. The genome of cultivated peanut provides insight into legume karyotypes, polyploid evolution and crop domestication. Nature Genetics, 2019, 51(5): 865-876.

[27] BERTIOLI D J, JENKINS J, CLEVENGER J, Dudchenko O, Gao D y, Seijo G, Leal-Bertioli S C M, Ren L h, Farmer A D, Pandey M K, Samoluk S S, Abernathy B, Agarwa G, Ballén-Taborda C, Cameron C, CampbelL J, Chavarro C, Chitikineni A, Chu Y, Dash S, Baidouri M E, Guo B z, Huang w, Kim K D, Korani W, Lanciano S, Lui C G, Mirouze M, Moretzsohn M C, Pham M , Shin J H, Shirasawa K, Sinharoy S, Sreedasyam A, Weeks N T, Zhang X Y, Zheng Z, Sun Z q, Froenicke L, Aiden E L, Michelmore R i, Varshney?R K, Holbrook C C, Cannon E K S, Scheffler B E, Grimwood J, Ozias-Akins P, Cannon S B, Jackson S A, Schmutz J. The genome sequence of segmental allotetraploid peanutL. Nature Genetics, 2019, 51(5): 877-884.

[28] CLEVENGERl J, CHU Y, SCHEFFLER B, OZIAS-AKINS P. A developmental transcriptome map for allotetraploid. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1446.

[29] ZHAO Y H, MA J J, Li M, Deng L, Li G H, XIA H, ZHAO S Z, Hou L, LI P C, MA C L, YUAN M, REN L, GU J Z, GUO B Z, ZHAO C Z, WANG X J. Whole-genome resequencing-based QTL-seq identifiedgene encoding a R2R3-MYB transcription factor controlling peanut purple testa colour. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18: 96-105.

[30] 王娟, 石大川, 陳皓寧, 吳麗青, 閆彩霞, 陳靜, 趙小波, 孫全喜, 苑翠玲, 牟藝菲, 單世華, 李春娟. 花生高親和硝酸鹽轉運蛋白基因家族生物信息學分析. 中國油料作物學報, 2022, 44(2): 316-323.

WANG J, SHI D C, CHEN H N, WU L Q, YAN C X, CHEN J, ZHAO X B, SUN Q X, YUAN C L, MU Y F, SHAN S H, LI C J. Bioinformatics analysis of high affinity nitrate transporter gene family in Peanut. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2022, 44(2): 316-323. (in Chinese)

[31] LERAN S, VARALA K, BOYER J C, CHIURAZZI M, LACOMBE B. A unified nomenclature of NITRATE TRANSPORTER1/PEPTIDE TRANSPORTER family members in plants. Trends in Plant Science, 2014, 19: 5-9.

[32] WANG J, YAN C X, LI Y, LI C J, ZHAO X B, YUAN C L, SUN Q X, SHAN S H. GWAS discovery of candidate genes for yield-related traits in peanut and support from earlier QTL mapping studies. Genes, 2019, 10(10): 803.

[33] TANG W J, YE J, YAO X M, ZHAO P Z, XUAN W, TIAN T L, ZHANG Y Y, XU S, AN H Z, CHEN G M. Genome-wide associated study identifies NAC42-activated nitrate transporter conferring high nitrogen use efficiency in rice. Nature Communications, 2019, 10(1): 5279.

[34] 武姣娜, 魏曉東, 李霞, 張金飛, 謝寅峰. 植物氮素利用率的研究進展. 植物生理學報, 2018, 54(9): 1401-1408.

WU J N, WEI X D, LI X, ZHANG J F, XIE Y F. Research progress of nitrogen use efficiency in plants. Plant Physiology Journal, 2018, 54(9): 1401-1408. (in Chinese)

[35] TENG W, HE X, TONG Y. Transgenic approaches for improving use efficiency of nitrogen, phosphorus and potassium in crops. Journal of Integrative Agriculture, 2017, 16(12): 2657-2673.

[36] LI H, HU B, CHU C. Nitrogen use efficiency in crops: lessons fromand rice. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(10): 2477-2488.

[37] GABRIEL K, NIGEL M C, GLORIA M C, TSAY Y F. Nitrate signaling: adaptation to fluctuating environments. Current Opinion in Plant Biology, 2015, 13(3): 265-272.

[38] KECHID M, DESBROSSES G, ROKHSI W, VAROQUAN F, DJEKOUN A, TOURAINE B. Theandgenes are involved in growth promotion ofby the plant growth- promoting rhizobacterium (PGPR) strainSTM 196. New Phytologist, 2013, 198(2): 514-524.

[39] 軒紅梅, 王永華, 魏利婷, 楊瑩瑩, 王利娜, 康國章, 郭天財. 小麥幼苗葉片中硝酸鹽轉運蛋白和家族基因對氮饑餓響應的表達分析. 麥類作物學報, 2014, 34(8): 1019-1028.

XUAN H M, WANG Y H, WEI L T, YANG Y Y, WANG L N, KANG G Z, GUO T C. Expression analysis of nitrate transporterandfamily genes in response to nitrogen starvation in wheat seedling leaves. Journal of Triticeae Crops, 2014, 34(8): 1019-1028. (in Chinese)

[40] WEI J, ZHANG Y, FENG H, QU H, FAN X, YAMAJI N, XU G.encodes a dual-affinity nitrate transporter and functions in nitrate-regulated root growth and nitrate distribution in rice. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(5): 1095-1107.

[41] LIU Y Y, SHAO L B, ZHOU J, LI R C, PANDEY M K, HAN Y, CUI F, ZHANG J L, GUO F, CHEN J, SHAN S H, FAN G Y, ZHANG H, SEIM I, LIU X, LI X G, VARSHNEY R K, LI G W, WAN S B. Genomic insights into the genetic signatures of selection and seed trait loci in cultivated peanut. Journal of Advanced Research, 2022, https://doi.org/10.1016/j.jare.2022.01.016

[42] 鄭永美, 周麗梅, 鄭亞萍, 吳正鋒, 孫學武, 于天一, 沈浦, 王才斌. 花生主要碳代謝指標與根瘤固氮能力的關系. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2021, 27(1): 75-86.

ZHENG Y M, ZHOU L M, ZHENG Y P, WU Z F, SUN X W, YU T Y, SHEN P, WANG C B. Relationship between carbon metabolism and nitrogen fixation ability of peanut nodule. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2021, 27(1): 75-86. (in Chinese)

[43] CAMPBELL W H. Nitrate reductase structure, function and regulation: bridging the gap between biochemistry and physiology. Annual Review of Plant Biology, 1999, 50(1): 277-303.

Functional Analysis ofin Response to Low-Nitrogen in Peanut

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong;2College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266000, Shandong;3Qingdao Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266100, Shandong

【Objective】Nitrogen (N) plays a key role in determining biomass and yield in crop production., the high affinity nitrate transporter genes, are mainly activated under low nitrogen stress condition and have been implicated in nitrate absorption and remobilization. This study will screengene family responding to low-nitrogen condition (1/20 of the normal level) and conduct a preliminary functional analysis ofin order to provide target genes for breeding new peanut varieties with higher nitrogen utilization efficiency (NUE)，which will help to achieve the goal of to improve crop production with less N fertilizer demand and environmental degradation. 【Method】The spatio-temporal expression patterns under normal and low-nitrogen conditions of five peanut NRT2 genes,,,,and, were investigated. Using the cDNA of Huayu6309 as template, full length ofCDS was cloned and bioinformatic analyzed. Subcellular localization of AhNRT2.7a was conducted by construction of transient expression vector and transformation ofprotoplasts. In order to explore the gene function of, heterologous overexpression of thegene inwere performed. Transgenic plants were used to determine chlorophyll content, nitrogen accumulation and the enzymatic activities of glutamine synthetase (GS), glutamate synthetase (GOGAT), nitrate reductase (NR), nitrite reductase (NiR) and glutamate dehydrogenase (GDH) under normal and low-nitrogen conditions. 【Result】Four NRT2 genes of peanut were highly expressed in response to low nitrogen stress, andwas highly expressed in the stems and leaves. The total length of 1 380 bp was obtained, encoding a 459-amino acid protein with a molecular weight of 49.35 kD. The total of 12 typical transmembrane protein domains with hydrophobic regions was predicted. Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence had 99.56% sequence similarity with the cultivated peanut (L.), followed by the wild-parents AA () and BB (). Subcellular localization analysis revealed that AhNRT2.7a was located in the cell membrane. Transgenicplants for over-expressingwere conducted. Relative content of chlorophyll in mature and young leaves was significantly higher than that in wild-typeunder different nitrogen supply. Meanwhile, the activity of five enzymes involved in nitrogen metabolism were examined. Furthermore, uptake, assimilation and re-mobilization of N, concentration of phosphorus and potassium were determined. The results have revealed that the activity of the two nitrogen metabolizing enzymes (NR and GS) and nitrogen accumulation in transgenic plants were significantly higher than in wild-type. 【Conclusion】These results indicated thatcould enhance the nitrogen use efficiency (NUE) in plants, and also improve carbon metabolism.seems promising as a candidate gene in breeding new peanut varieties with higher NUE.

peanut; nrt2;; nitrogen efficiency; enzymes related to nitrogen metabolism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.003

2021-07-12；

2022-09-08

山東省自然科學基金面上項目（ZR2021MC124）、山東省泰山學者（ts201712080）、山東省良種工程（2020LZGC001）、山東省農業(yè)產業(yè)體系（SDAIT-04-02）、山東省農科院創(chuàng)新工程（CXGC2022E20）

王娟，E-mail：wangjuan_1984@163.com。通信作者李春娟，E-mail：peanutlab@163.com。通信作者單世華，E-mail：shansh1971@163.com

（責任編輯 李莉）