基于JAK2/STAT3的龍膽苦苷通路調控潰瘍性結腸炎小鼠巨噬細胞極化機制研究△

謝彥媛，邵穎穎，韓偉超，謝保城，何淑芬

廣東省東莞市人民醫院 藥學部，廣東 東莞 523059

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）具有病情反復、難以痊愈的特點，是一種發病機制尚未明確的腸道炎癥性疾病。中醫認為，UC 屬于“泄瀉”“久痢”范疇，常表現為濕熱蘊結于大腸而出現大便稀薄，故常用清熱利濕中藥對癥治療[1]。已有研究表明，UC與腸炎相關性結直腸癌有密切的聯系。臨床研究表明，由于腸道中炎性環境的長期存在，炎癥性腸病（inflammation bowel disease，IBD）惡化癌變腸炎相關性結直腸癌及患者死亡的風險明顯增加[2-3]。目前，對于UC 的治療藥物主要包括免疫抑制劑、糖皮質激素和5-氨基水楊酸等[4]，但有限的治療效果及長期服藥所導致的不良反應嚴重影響了患者的康復進程。因此，尋找一種有效、不良反應小的藥物尤為迫切。

巨噬細胞與UC 病程的發展密切相關。巨噬細胞具有可塑性和異質性，可極化為能夠分泌促炎因子的M1 型巨噬細胞和能夠分泌抗炎因子的M2 型巨噬細胞。在UC 發病早期，巨噬細胞被激活并向M1型巨噬細胞極化，通過分泌促炎因子和趨化因子，破壞結腸黏膜結構的完整性，并且能夠募集大量中性粒細胞到炎癥發生位置，加劇炎癥的發展[5]。M2型巨噬細胞則能通過分泌抗炎因子，抑制單核-巨噬細胞分泌一氧化氮和炎癥因子的水平，緩解局部環境炎癥反應的發生和發展。此外，M2型巨噬細胞能夠發揮吞噬和清除病原體的作用，抑制炎癥的進一步加劇[6]。因此，調控巨噬細胞極化對于UC 的治療及預后具有重要的意義。

龍膽是我國傳統中藥材，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，為清肝膽濕熱、瀉下焦郁火常用中藥[7]。龍膽苦苷為龍膽的主要活性成分，屬于裂環環烯醚萜苷類化合物。現代藥理學研究表明，龍膽苦苷具有抗炎、抗腫瘤、健胃和降血壓等作用[8-9]。已有研究表明，龍膽苦苷在多種炎癥性疾病的治療中均發揮了積極的作用，如膿毒血癥和糖尿病腎炎[10-11]。趙文娜等[12]研究發現，龍膽苦苷能夠明顯改善2，4，6-三硝基苯磺酸-乙醇溶液誘導的UC 小鼠腸道的炎性環境，減少結腸炎性細胞浸潤和充血水腫，改善結腸組織結構損傷。綜上所述，龍膽苦苷抗UC 具有良好的療效。基于此，本研究探討并分析龍膽苦苷對巨噬細胞極化的影響，進而對龍膽苦苷抗小鼠UC做初步機制闡述。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雄性小鼠60只，體質量20～23 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK（粵）2020-0005，動物飼養于SPF 級別動物房，飼養溫度為22～25 ℃，相對濕度為45%～55%，每日光照12 h，動物自由食用標準飼料和自由飲用蒸餾水。

1.2 儀器

HP300 型組織脫水機（奧華科技有限公司）；ES30 型組織包埋機（華速科技有限公司）；CU600型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊有限公司）；Elx808型全波長多功能酶標儀（廣州吉源生物科技有限公司）；ZE5 型流式細胞儀、DYC-Mini1 型垂直電泳槽、E1101 型電泳儀（美國Bio-Rad 生物科技有限公司）；Nano Drop 2000c 型超微量分光光度計、CFX96 型實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國賽默飛生物科技有限公司）；Tanon4600 型化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 試藥

龍膽苦苷（批號：20200703-2，純度≥98%）、硫酸葡聚糖（DSS，批號：H17061909）均購于默克Sigma Aldrich公司；白細胞介素-12（IL-12）測定試劑盒（批號：20200877）、IL-10 測定試劑盒（批號：20200427）、IL-6 測定試劑盒（批號：20200219）、IL-4 測定試劑盒（批號：20200214）均購于江蘇酶免實業有限公司；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（批號：7913216）、CD206 抗體（批號：7246276）、酪氨酸激酶2（JAK2）抗體（批號：1372864）、p-JAK2 抗體（批號：2563073）、信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）抗體（批號：4729976）、p-STAT3 抗體（批號：2944710）均購于美國CST 公司；APC anti-mouse CD45 抗體（批號：4332602）、PerCP-Cy 5.5 anti-mouse F4/80 抗體（批號：9273801）、APC/Cy7 anti-mouse CD206 抗 體（批號：40037611）、PE anti-mouse iNOS 抗體（批號：9928710）均購于美國BioLegend 公司；FITC anti-mouse CD11b 抗體（批號：4127642，Invitrogen公司）；磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號：8884，美國CST 公司；RIPA 裂解液（批號：P0013B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012S）均購于上海碧云天生物技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

BALB/c 雄性小鼠60 只，適應性飼養3 d，按體質量隨機分成對照組、模型組及龍膽苦苷低、中、高劑量（25、50、100 mg·kg-1）組，每組12只。實驗期間，對照組小鼠每天給予蒸餾水自由飲用，其余組小鼠每天給予2.5% DSS 溶液自由飲用，制備UC模型，以造模小鼠出現嚴重的稀便、便血和體質量明顯下降為造模成功。造模的同時，龍膽苦苷低、中、高劑量組小鼠灌胃給予相應的藥物，對照組與模型組同時灌胃給予等體積蒸餾水，持續7 d。每天記錄小鼠的體質量變化、稀便和血便程度，根據評分標準，按公式（1）作疾病活動指數（DAI）評分記錄，評分標準參考Chen 等[13]的研究，見表1。

表1 UC模型小鼠DAI評分標準

2.2 血液和臟器樣本采集

實驗結束后，對小鼠進行乙醚麻醉，眼眶取血，4 ℃、3500×g離心15 min 得血清，血清保存于-80 ℃冰箱中備用。小鼠脫頸椎處死后解剖，以回盲部下端為起始，以肛門端為結束，小心剝離結腸，將結腸平鋪舒展，沿腸系膜方向（縱向）剖開使腸腔暴露，剔除內容物，使用電子游標卡尺對回盲部至肛門的結腸進行長度測量并拍照記錄，對靠近肛門段的結腸進行厚度測量。

2.3 炎癥因子測定

取小鼠結腸組織約0.4 g加入到含有磷酸鹽緩沖液（PBS）500 μL 的離心管中，勻漿，將所得勻漿液3500×g離心10 min 得上清液。按照試劑盒說明書進行酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清和結腸上清液中IL-10、IL-4、IL-6和IL-12水平。

2.4 相關蛋白表達測定

將結腸組織加裂解液于冰上裂解30 min 提取細胞總蛋白，12 000 r·min-1（離心半徑6.3 cm）離心15 min，取上清液，采用BCA 試劑盒測定結腸組織蛋白質量濃度；經十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗（p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、iNOS、CD206 和GAPDH）4 ℃冰箱孵育過夜；次日加入相應二抗，孵育1 h，隨后顯色曝光，拍照并保存相應蛋白條帶，使用Image J軟件分析蛋白和磷酸化蛋白條帶的灰度值，與內參蛋白GAPDH的灰度值校準。

2.5 巨噬細胞亞群的測定

截取實驗結束后所得結腸1 cm，在預冷的PBS中，充分研磨后過200 目濾膜到PBS 中，均勻吹打得結腸單細胞懸液。將制備的結腸單細胞懸液以1×106個收集于流式管中，加入CD45 抗體0.5 μL、CD11b 抗體1 μL、F4/80 抗體0.5 μL 和CD206 抗體1 μL，混勻，37 ℃避光孵育25 min。待表面抗體孵育完成后，使用冷的PBS 洗滌細胞1 次。洗滌后每份流式管加入配置好的流式破膜固定液1 mL 并脈沖渦旋，室溫孵育60 min。每份流式管添加透化液2 mL，室溫條件下800 r·min-1離心5 min（離心半徑6.3 cm），棄上清。每份流式樣品重懸后添加iNOS（PE，3.5 μL）抗體，室溫避光孵育30 min。每份流式管添加透化液2 mL，室溫條件800 r·min-1離心5 min（離心半徑6.3 cm），棄上清，PBS 洗滌1 次。最后將樣品重懸于PBS 300 μL 中，使用流式細胞儀分析樣品。其中CD45 和CD11b 抗體為中性粒細胞的細胞標記物，F4/80為巨噬細胞的細胞標記物，iNOS 為M1 型巨噬細胞的細胞標記物，CD206為M2型巨噬細胞的細胞標記物。

2.6 統計方法

3 結果

3.1 龍膽苦苷對UC小鼠DAI評分的影響

實驗結束后DAI評分結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠DAI 評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量（25、50、100 mg·kg-1）均能顯著下調小鼠DAI 評分（P＜0.01），作用呈劑量依賴性。此外，模型組小鼠在實驗第五、六、七天均有1 只小鼠因潰瘍嚴重而死亡，龍膽苦苷低劑量組有1 只小鼠在實驗第七天因潰瘍嚴重而發生死亡，2 組小鼠病死率分別為25.0%、8.3%。動物死亡后的DAI 評分、血清和臟器數據不納入后續的實驗結果。龍膽苦苷各劑量均能一定程度降低結腸炎小鼠病死率，見圖1。

圖1 龍膽苦苷對UC小鼠DAI評分的影響（, n=9～12）

3.2 龍膽苦苷對UC小鼠結腸病變的影響

從結腸病變的結果可觀察到，與對照組比較，模型組小鼠結腸明顯縮短，且發生腫脹。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結腸縮短和腫脹均有一定程度的緩解，見圖2。與對照組比較，DSS能夠誘導小鼠結腸長度顯著縮短（P＜0.01），且厚度顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結腸縮短和結腸厚度增加的病理變化均發生顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），且改善作用呈劑量依賴性。見圖3。由此可見，龍膽苦苷能顯著改善DSS誘導的小鼠結腸損傷。

圖2 各組小鼠結腸形態

圖3 龍膽苦苷對UC小鼠結腸的影響（, n=9～12）

3.3 龍膽苦苷對UC小鼠腸道炎性環境的影響

結腸中炎性因子的結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠結腸中抗炎因子IL-10和IL-4表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，龍膽苦苷各質量濃度組小鼠結腸中抗炎因子IL-10和IL-4表達水平顯著升高（P＜0.01）。與對照組比較，模型組小鼠結腸中促炎因子IL-6 和IL-12 的表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，龍膽苦苷各劑量組小鼠結腸中促炎因子IL-6 和IL-12 表達水平顯著降低（P＜0.01）。此外，血清中相應的細胞因子水平變化與結腸組織中的趨勢相對應（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。基于此可得，龍膽苦苷能夠緩解DSS 誘導的結腸炎性環境，恢復結腸抗炎/促炎平衡，并且此作用具有劑量依賴性。

圖4 龍膽苦苷對UC小鼠腸道炎性環境的影響（, n=9～12）

3.4 龍膽苦苷對UC小鼠巨噬細胞極化的影響

流式細胞術的結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠iNOS+巨噬細胞比例顯著升高（P＜0.01），同時CD206+型巨噬細胞比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龍膽苦苷各劑量均能夠顯著降低小鼠結腸中iNOS+型巨噬細胞比例（P＜0.01），且明顯上調CD206+型巨噬細胞比例（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。此外，蛋白免疫印跡法（Western blot）的結果說明，龍膽苦苷各劑量均能提高CD206 的表達而降低iNOS 的表達（P＜0.05，P＜0.01），見圖6。結果表明，龍膽苦苷可調控結腸巨噬細胞極化，并使巨噬細胞向具有抗炎作用的M2 型巨噬細胞的趨勢極化。

圖5 龍膽苦苷對UC小鼠巨噬細胞極化的影響（, n=4）

圖6 龍膽苦苷對UC小鼠巨噬細胞iNOS和CD206蛋白表達的影響（, n=4）

3.5 龍膽苦苷對JAK2/STAT3通路磷酸化的影響

結果顯示，龍膽苦苷對JAK2 和STAT3 蛋白表達水平無明顯的影響，但能明顯下調p-JAK2 蛋白（P＜0.05）及p-STAT3（P＜0.05）蛋白的表達水平（圖7）。結果發現，龍膽苦苷可能通過下調JAK2/STAT3信號通路的磷酸化表達影響巨噬細胞極化。

圖7 龍膽苦苷對UC小鼠巨噬細胞JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化的影響（, n=4）

4 討論

龍膽苦苷是我國傳統珍貴中藥材龍膽的重要活性成分之一[7]。本研究結果顯示，對DSS 誘導的UC小鼠給予龍膽苦苷干預，能夠明顯改善小鼠結腸損傷，減輕腸道炎癥，并且作用機制可能是通過下調JAK2/STAT3 通路的磷酸化表達，進而上調腸道中M2 型巨噬細胞數量，下調M1 型巨噬細胞數量，調控巨噬細胞極化方向從而改善腸道炎性環境有關。

UC的中醫證候包括大腸濕熱、脾虛濕蘊、寒熱錯雜、脾腎陽虛、肝郁脾虛、熱毒熾盛和陰血虧虛。因此治療UC 應以清熱利濕、溫陽化濕為主[1]。龍膽性寒，味苦，清下焦郁火的功效尤為顯著。現代藥理研究表明，龍膽具有抗腫瘤、抗炎鎮痛的作用[14]。UC 屬于炎癥性腸病的范疇。病理研究顯示UC 患者腸黏膜屏障結構受損，從而影響免疫系統和神經內分泌系統，進一步導致腸道微環境受破壞，發生腸黏膜局部潰瘍。在本研究中，DSS 能夠誘導小鼠出現稀便、血便的癥狀，并且對結腸進行觀察發現DSS能夠縮短結腸長度，并使結腸厚度增加。利用疾病活動指數評價UC模型小鼠造模成功。同時，小鼠腸道屏障結構受損，腸道中抗炎因子IL-4和IL-10表達水平下降，促炎因子IL-6和IL-12表達上調，反映了UC 的發生。對UC 模型小鼠給予不同劑量的龍膽苦苷之后，其狀態發生明顯改變，稀便、血便癥狀減輕，DAI評分出現明顯的下降。與此同時，龍膽苦苷能夠下調UC小鼠腸道的促炎因子表達，并且上調抗炎因子的表達，緩解結腸縮短以及結腸厚度增加。值得留意的是，龍膽苦苷改善DAI、緩解腸道受損及腸道炎癥的程度與給藥劑量呈正比。綜上，龍膽苦苷治療UC具有顯著的療效，可明顯改善稀便、血便，并且能夠緩解結腸損傷，改善腸道炎性環境。

巨噬細胞是參與體液免疫和細胞免疫的一種重要的免疫細胞，極具可塑性和異質性。當機體局部環境受刺激時，成熟的巨噬細胞可進行極化以適應環境的變化[15]。根據極化后不同的細胞表明標記物及不同的細胞功能，可將極化后的巨噬細胞分為由干擾素-γ和脂多糖介導分化的M1 經典活化巨噬細胞和由白細胞介素和糖皮質激素等激活的M2 替代活化型巨噬細胞。M1型巨噬細胞可通過產生大量促炎因子參與初始炎癥反應，如IL-6和IL-12，并發揮吞噬、清除入侵微生物和抑制腫瘤發生免疫逃逸的功能。M2 型巨噬細胞則可分泌大量抗炎因子如IL-10 和IL-4，并能促進血管生成，加速傷口愈合[6,16-17]。由于M1 和M2 型巨噬細胞作為2 種對炎癥有著不同影響的巨噬細胞亞群，因此巨噬細胞被認為在多種炎癥性疾病中發揮著重要的作用，巨噬細胞極化也被認為是調控炎癥發展進程中的重要手段[18-19]，調控巨噬細胞極化可運用于多種炎癥性疾病以及炎癥導致的癌變研究中[20-25]。本研究中，UC 小鼠稀便、血便嚴重，結腸長度和厚度的改變以及促炎因子的增加表明結腸發生嚴重的病理變化，伴有大量的促炎因子浸潤，提示腸道中巨噬細胞極化方向更趨向于M1 型巨噬細胞，造成促炎/抗炎平衡破壞。對UC 小鼠給予龍膽苦苷之后，M2 型巨噬細胞比例上調且CD206 蛋白表達水平上升，提示腸道中巨噬細胞極化趨勢傾向于向M2 型巨噬細胞極化。龍膽苦苷恢復腸道中抗炎/促炎平衡，同時修復腸道損傷，改善小鼠稀便血便。結果提示龍膽苦苷對DSS誘導的UC小鼠的治療作用可能通過調控腸道中巨噬細胞的極化實現的。除此之外，炎癥因子和巨噬細胞基因差異性表達的結果顯示龍膽苦苷對炎癥的緩解和對巨噬細胞的極化具有劑量依賴性，即隨著龍膽苦苷劑量上調，作用越顯著。本研究結果顯示，龍膽苦苷高劑量（100 mg·kg-1）治療效果最好，提示龍膽苦苷劑量大于100 mg·kg-1或許能發揮更明顯的治療UC效果。

巨噬細胞的極化和功能調節是多種因素共同作用下完成的，涉及多種信號通路轉導和轉錄網絡的調控[26]。其中，最常見的為JAK2/STAT3 通路，JAK2是一種蛋白酪氨酸激酶，存在于細胞質中并調節下游STATs基因表達，其中可直接影響STAT3 的磷酸化水平，從而影響細胞增殖、遷移和侵襲[27]。已有研究表明，JAK2/STAT3通路可誘導巨噬細胞向M1 型巨噬細胞的極化，生成和分泌大量促炎因子，其潛在的機制可能與核轉錄因子-κB通路相關[25]。在本研究中，龍膽苦苷各劑量對JAK2 及STAT3 蛋白表達水平均無明顯影響，但能顯著下調蛋白磷酸化水平，提示通路的表達受到龍膽苦苷的抑制，進而減緩巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化的趨勢。與巨噬細胞極化的檢測相一致，龍膽苦苷100 mg·kg-1對JAK2/STAT3通路磷酸化水平抑制最明顯，進一步證實高劑量龍膽苦苷可更有效地調控巨噬細胞的極化趨勢。

綜上所述，龍膽苦苷通過抑制JAK2/STAT3 通路的磷酸化水平，促使巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化，從而下調腸道促炎因子的分泌，上調抗炎因子水平，緩解DSS 誘導的小鼠腸道損傷以及腸道炎癥，抑制UC 的發展。然而本研究對于龍膽苦苷調控巨噬細胞極化治療潰瘍性UC 只作初步探討，進一步探討龍膽苦苷治療UC 的機制，仍然需要進行體外細胞和在體動物的正向和反向驗證。