miR-146a多態性與糖尿病周圍神經病變及臨床療效的相關性研究

張馨允, 王澤華, 姚思宇

(開灤總醫院 內分泌科, 河北 唐山, 063000)

糖尿病為臨床常見的慢性疾病，隨著中國居民經濟水平的提高和生活方式的改變，近年來其發病率呈上升趨勢[1]。糖尿病周圍神經病變(DPN)是糖尿病最常見和最復雜的慢性并發癥之一，容易造成神經結構改變及功能障礙，引起麻痛、發涼、感覺減退等臨床癥狀[2]。2型糖尿病(T2DM)患者的DPN患病率為42.2%, 高于1型糖尿病患者[3], 且隨著病情惡化最終可導致足部潰瘍、壞疽，甚至有截肢致殘的風險[4]。DPN是多種因素協同作用的結果，確切的發病機制尚未完全闡明，其中遺傳易感性是DPN的發病基礎。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的非編碼RNA, 廣泛存在于動植物中，人類基因組中有20%～30%受miRNA調控。miR-146為多功能非編碼小分子RNA, 是參與天然免疫的調控因子，主要通過對核轉錄因子-κB(NF-κB)相關通路的靶基因進行調控而影響細胞代謝，特別是影響炎癥反應的進程[5]。T2DM患者外周血miR-146a水平較健康者普遍降低[6]，而miR-146a表達降低與T2DM的易感性有關[7]。miR-146a可通過作用于靶基因白介素受體相關激酶1(IRAK-1)和腫瘤壞死因子相關受體6(TRAF-6), 調控NF-κB通路參與DPN的發生發展[8]。編碼miRNA基因的單核苷酸多態性(SNP)可通過影響初級轉錄產物影響pre-miRNA及其加工過程，改變蛋白質表達，從而參與各種疾病的發生發展。目前, miR-146a基因多態性的報道多集中于自身免疫性疾病和癌癥方面，關于其與DPN相關性的研究則相對較少。本研究探討了miR-146a基因多態性與DPN易感性和臨床療效的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年12月在開灤總醫院內分泌科就診的524例T2DM患者作為研究對象，均符合1999年世界衛生組織(WHO)提出的糖尿病診斷標準[9]。將299例單純糖尿病患者納入單純T2DM組，將225例T2DM合并DPN患者納入DPN組。DPN組患者納入標準: ① 年齡≥18周歲者; ② 臨床診斷符合《糖尿病防治指南(2017版)》中DPN診斷標準[10]者; ③ 未合并其他嚴重疾病者。排除標準: ① 并發其他神經病變(如頸腰椎病變、中毒性末梢神經炎、感染性多發性神經炎、骨關節炎、腦卒中、格林巴利綜合征等)者; ② 并發其他對神經傳導產生影響的疾病(如慢性酒精中毒、藥物等)者; ③ 存在心臟、肝臟、腎臟功能嚴重障礙者; ④ 存在嚴重動靜脈血管性疾病(如靜脈栓塞、淋巴管炎等)者; ⑤ 合并惡性腫瘤、免疫系統或全身炎癥疾病者; ⑥ 哺乳期或妊娠期婦女; ⑦ 對治療藥物過敏者。本研究經過醫院倫理委員會審核批準，且患者均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集: 收集所有患者的年齡、性別、糖尿病病程、身高、體質量等臨床資料，并計算體質量指數(BMI)。

1.2.2 實驗室指標檢測: 清晨抽取所有患者空腹靜脈血5 mL置于普通采血管，室溫下靜置30 min, 待血液完全凝固后于高速低溫離心機上以3 500 轉/min離心15 min, 分離得血清。應用美國Roche公司7200-C全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平，應用美國Roche公司全自動化學發光免疫分析儀檢測空腹胰島素(FINS)水平。另取患者空腹靜脈血2 mL于抗凝管，采用高效液相離子層析法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR), HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 miR-146a 基因多態性檢測: 清晨抽取所有患者空腹靜脈血1 mL置于EDTA抗凝管，采用天根生化科技(北京)公司血液全基因組DNA提取試劑盒提取DNA。MiR-146a基因引物和探針序列由天根生化科技(北京)公司合成。MiR-146a基因上游引物和下游引物分別為5′-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3′和5′-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3′, 探針G allele序列為5′-FAM-TCAGACCTGTGAAATT-MGB-3′, 探針C allele序列為5′-HEX-TCAGACCTCTGAAATT-MGB-3′。應用Applied Bioststems公司的7500實時聚合酶鏈反應(PCR)系統對目的片段擴增及檢測基因型。PCR反應條件: 50 ℃預熱2 min, 95 ℃預變性10 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃ 退火40 s, 共55 個循環。采用雙盲法判斷TaqMan分型結果。

1.2.4 治療方法: 所有患者均按《糖尿病防治指南(2017版)》進行糖尿病飲食及運動干預，同時口服降糖藥控制血糖[目標為FPG<7.0 mmol/L, 餐后2 h血糖(2 hPG)<10.0 mmol/L]。DPN患者同時服用依帕司他片(50 mg/次，3次/d)和甲鈷胺片(0.5 mg/次，3次/d)，療程為3個月。

1.3 臨床療效評價

治療前后采用丹麥DNA TEC公司OISA 2000型肌電圖儀檢測DPN患者腓總神經、尺神經、脛神經、正中神經的運動神經和感覺神經傳導速度，各指標重復檢測3次，最后結果取平均值。采用多倫多臨床評分系統(TCSS)[11]評估DPN患者的臨床癥狀與體征，由專人登記每例患者治療前后各相關指標的數據并匯總分析。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 臨床資料比較

DPN組糖尿病病程長于單純T2DM組, FPG、HbA1c、FINS和HOMA-IR水平高于單純T2DM組，差異有統計學意義(P<0.05); 2組患者的性別、年齡和BMI、TG、TC、LDL、HDL水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床資料比較

2.2 miR-146a基因型和等位基因分布頻率比較

2組miR-146a基因型及等位基因分布頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05); DPN組患者GG基因型分布頻率高于單純T2DM組, CG基因型分布頻率低于T2DM組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者miR-146a基因型及等位基因分布頻率比較[n(%)]

等位基因百分率以每組各等位基因出現總頻次計算。

2.3 DPN患病風險的多因素分析

二分類Logistic回歸分析顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1c、HOMA-IR和miR-146a基因分型均為T2DM患者發生DPN的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 T2DM患者發生DPN風險的多因素分析

2.4 miR-146a基因多態性與DPN患病風險分析

GG基因型患者的DPN患病風險高于CC基因型患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組患者miR-146a不同基因型比較[n(%)]

2.5 DPN患者的臨床治療效果

治療3個月后, DPN患者腓總神經、尺神經、脛神經和正中神經的運動和感覺神經傳導速度均高于治療前, TCSS評分低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 225例DPN患者治療前后TCSS評分和運動感覺神經傳導速度比較

2.6 DPN患者臨床療效與miR-146a基因多態性的相關性分析

治療前, miR-146a不同基因型DPN患者的TCSS評分、運動感覺神經傳導速度比較，差異均無統計學意義(P>0.05); 治療3個月后, GG基因型患者運動感覺神經傳導速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS評分高于CC基因型和CG基因型患者，差異有統計學意義(P<0.05); 治療3個月后, CG基因型患者運動感覺神經傳導速度低于CC基因型患者, TCSS評分高于CC基因型患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 miR-146a不同基因型DPN患者治療前后運動感覺神經傳導速度和TCSS評分比較

3 討 論

糖尿病患者可能發生嚴重的慢性并發癥，其中DPN為糖尿病最常見的并發癥之一，長期高血糖狀態可導致周圍神經細胞供給紊亂，最終誘發周圍神經病變。研究[12]表明, DPN發病機制較復雜，可能是多種因素共同作用的結果，以遺傳易感性為基礎、糖脂代謝紊亂引起固有性免疫的長期慢性激活而導致慢性炎癥反應。早期發現和治療是延緩病情進展的重要措施，DPN早期表現不典型，臨床難以早期診斷，故如何有效篩選高危人群并及時干預是臨床關注的熱點。本研究結果顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1C和HOMA-IR均為T2DM患者發生DPN的獨立影響因素(P<0.05), 提示臨床應重點關注上述因素，必要時盡量控制，以延遲DPN的發生。

miRNA在多種人類疾病中發揮著重要作用，在臨床上常被用作診斷標志物或基因治療靶點。miR-146a基因位于人類5號LOC285628基因的第2個外顯子上(Chr. 5q34), 存在1個rs編碼為2910164的pre-miR-146a C/G變異，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病等疾病中發揮著重要作用[13]。國外研究[14-15]結果顯示, miR-146a rs2910164是印度南部人群DPN的易感基因, CC基因型和C等位基因與T2DM患病風險增加相關。另有研究[16]顯示，高加索人miR-146a基因多態性與DPN相關。王國鳳等[17]研究顯示, miR-146a基因多態性是糖尿病患者發生DPN的危險因素。本研究結果顯示, DPN組患者GG基因型分布頻率高于單純T2DM組, CG基因型分布頻率低于T2DM組，且GG基因型患者的DPN患病風險高于CC基因型患者，差異均有統計學意義(P<0.05), 因此GG基因型是DPN發病的危險因素，與上述研究結論基本一致。

DPN的臨床治療比較棘手，目前尚缺乏特效治療手段，以控制血糖、營養神經等對癥支持治療為主，但僅可以改善相關癥狀及體征。甲鈷胺是一種內源性輔酶B12，可修復受損的神經細胞，改善神經代謝及傳導[18]; 依帕司他可抑制醛糖還原酶活性，抑制多元醇通路的激活而減輕氧化應激反應，控制細胞炎性反應與程序性死亡，從而修復神經組織損傷[2]。本研究中, DPN患者接受甲鈷胺聯合依帕司他治療3個月后，腓總神經、尺神經、脛神經和正中神經的運動和感覺神經傳導速度均高于治療前, TCSS評分均低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05), 說明甲鈷胺聯合依帕司對DPN有較好的治療效果。王國鳳等[19]研究顯示, CC基因型DPN患者治療后的臨床有效率和神經傳導速度增加幅度顯著高于GG基因型患者。本研究中，接受甲鈷胺聯合依帕司他治療3個月后, GG基因型患者運動感覺神經傳導速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS評分高于CC基因型和CG基因型患者，差異有統計學意義(P<0.05), 說明miR-146基因多態性對甲鈷胺聯合依帕司他治療DPN的臨床效果具有一定影響。

綜上所述, miR-146a基因多態性與T2DM患者DNP易感性及臨床治療效果有關, GG基因型T2DM患者的DNP易感性較高且臨床療效較差。