紅景天苷對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型大鼠炎癥因子的影響

田詩(shī)琪, 趙慧源, 張 帆, 翟春影, 安 昊, 馬韜智,梁汶彬, 王金亮, 吳淑琴

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾, 161000)

阿爾茨海默癥(AD)是一種以認(rèn)知功能損傷為主的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1], 其病理學(xué)特征以神經(jīng)炎性斑(NP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)、神經(jīng)元死亡為主。有關(guān)AD發(fā)病機(jī)制的學(xué)說(shuō)有膽堿能學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、β淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、炎癥和免疫學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等。本研究主要傾向于β淀粉樣蛋白學(xué)說(shuō)、炎癥和免疫學(xué)說(shuō)。黃振波等[2]指出白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)可能會(huì)損害認(rèn)知功能，但I(xiàn)L-1β與認(rèn)知損傷的關(guān)系尚不十分清楚。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種炎癥介質(zhì)，在一定條件下可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)。紅景天苷是藏藥紅景天的一種有效活性成分，在抗氧化損傷、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力等方面有獨(dú)特的功效[3-4]。本研究觀察AD大鼠應(yīng)用紅景天苷前后的IL-1β、TNF-α水平變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性大鼠40只, 2～3月齡，體質(zhì)量(200.0±10.0) g, 由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SYXK(黑2016-001)。

1.2 藥物與AD模型制備

紅景天苷(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，批號(hào)110818-200404)、東莨菪堿氫溴酸鹽(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)S817762)、IL-1β ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號(hào)202010723)、TNF-α ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司，批號(hào)202010645)。采用腹腔注射東莨菪堿(SCOP) 2 mg/kg的方法, 建立中樞膽堿能系統(tǒng)障礙性AD模型大鼠[5-6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組以及紅景天苷高、中、低劑量組，每組8只。空白組和模型組均給予生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/(kg·d); 高、中、低劑量組分別給予75、50、25 mg/(kg·d)紅景天苷(需將純度>95%紅景天苷粉末與雙蒸水混合)。給予紅景天苷30 min后，除空白組外，其余4組大鼠均給予SCOP腹腔注射，劑量為2 mg/kg, 連續(xù)給藥21 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)檢測(cè): 行為學(xué)檢測(cè)在給藥21 d后開始進(jìn)行。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn): 圓形水池，直徑160 cm, 深50 cm, 站臺(tái)直徑10 cm, 水面高于站臺(tái)平面約2 cm, 水溫控制在(27.0±1.0) ℃, 水池周圍以布簾遮擋。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括適應(yīng)水迷宮(第1天)、定位航行實(shí)驗(yàn)(第2～5天)和空間探索實(shí)驗(yàn)(第6天)。實(shí)驗(yàn)前1 d將大鼠放置在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)，消除恐懼心理。定位航行實(shí)驗(yàn): 每只大鼠每天共進(jìn)行4次，頭面向池壁，分別從水池4個(gè)不同象限邊緣的中點(diǎn)放入水中; 大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上停留10 s; 若大鼠在90 s內(nèi)仍然沒有找到水面之下的平臺(tái)，引導(dǎo)其找到平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10 s; 記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及找到平臺(tái)時(shí)游過(guò)的距離。空間探索實(shí)驗(yàn)在第7天進(jìn)行，撤掉平臺(tái)，將大鼠由定位航行實(shí)驗(yàn)平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)放入，并記錄大鼠90 s內(nèi)在目標(biāo)象限(定位航行實(shí)驗(yàn)放置平臺(tái)的象限)所游的距離、在水池中所游的總距離及穿越目標(biāo)象限次數(shù)。以90 s內(nèi)在目標(biāo)象限游泳距離占總距離的百分比和穿越目標(biāo)象限次數(shù)作為空間學(xué)習(xí)與記憶的評(píng)價(jià)指標(biāo)[7-9]。

1.4.2 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu): 水迷宮實(shí)驗(yàn)12 h后(禁食不禁水)，分別將5組大鼠采用鍘刀斷頭儀處死，立即開顱取大腦、海馬組織、血清樣本。大腦及海馬組織在-80 ℃凍存，恒冷箱切片，甲醛溶液固定切片。蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.3 IL-1β及TNF-α測(cè)定: 取海馬組織，勻漿，離心取上清液，采用IL-1β、TNF-α的配套ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書方法檢測(cè)腦組織內(nèi)的遞質(zhì)含有量，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度(OD450 nm)值。以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品劑量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮運(yùn)動(dòng)軌跡

實(shí)驗(yàn)第2天，高劑量組行動(dòng)軌跡與空白組相似，大鼠對(duì)平臺(tái)位置的記憶能力優(yōu)于模型組。見圖1。

A: 模型組軌跡(密集遍布4個(gè)象限,大鼠未記住平臺(tái)象限位置,仍在摸索尋找平臺(tái)); B: 空白組軌跡(相對(duì)集中在平臺(tái)相鄰的第2象限內(nèi),軌跡相對(duì)稀疏,可能對(duì)平臺(tái)位置存在潛在記憶); C: 高劑量組軌跡(相對(duì)集中在平臺(tái)相鄰的第4象限內(nèi),行動(dòng)軌跡大致與空白組相似,對(duì)平臺(tái)位置的記憶能力優(yōu)于模型組)。圖1 模型組、空白組及高劑量組大鼠Morris水迷宮運(yùn)動(dòng)軌跡

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量組大鼠目標(biāo)平臺(tái)象限搜索時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)比均高于模型組，紅景天苷模型組大鼠長(zhǎng)于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明75 mg/kg紅景天苷能改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。見表1、表2、表3。

表1 各組目標(biāo)平臺(tái)象限內(nèi)的搜索時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)比情況

表2 各組大鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間 s

表3 各組大鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間 s

2.3 各組大鼠腦TNF-α、IL-1β及海馬區(qū)域切片比較

與空白組相比，模型組大鼠腦TNF-α、IL-1β水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與模型組相比，高劑量組和中劑量組大鼠腦TNF-α、IL-1β水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 大鼠海馬區(qū)炎癥因子的變化

A: 空白組,神經(jīng)細(xì)胞排列有序,染色密集,排列整齊緊密; B: 模型組,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,散在,排列不整齊,組織疏松; C: 低劑量組,少量神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù),但排列散在; D: 中劑量組,可見少量變形的神經(jīng)元,病理改變相較模型組不明顯; E: 高劑量組,神經(jīng)細(xì)胞普遍較細(xì),細(xì)胞排列整齊、規(guī)則、緊密。圖2 各組大鼠海馬區(qū)域切片HE染色結(jié)果(放大倍數(shù)400倍)

3 討 論

研究[2]表明IL-1β與認(rèn)知功能損傷有一定的聯(lián)系。在AD大鼠模型中, IL-1β、TNF-α水平顯著升高，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)、活化和炎癥瀑布反應(yīng)。本研究觀察AD大鼠IL-1β、TNF-α在紅景天苷給藥前后的變化，發(fā)現(xiàn)紅景天苷對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)及認(rèn)知能力有改善作用，也進(jìn)一步證明了IL-1β與認(rèn)知能力的關(guān)系。

AD的主要病變部位在大腦，β淀粉樣蛋白堆積是其主要病理特征之一[10]。紅景天苷具有抗衰老、抗疲勞、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、防輻射、抗疲勞、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能等藥理作用，其中抗炎作用可調(diào)節(jié)早期細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥反應(yīng)，通過(guò)阻斷核轉(zhuǎn)錄因子B和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶活化作用，從而減少TNF-α、IL-1β的分泌[11], 表明紅景天苷可用于治療炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙，也可緩解海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)。

相比于注射的制備方法, SCOP下的AD模型制備可以直接模擬AD患者的記憶能力減退和學(xué)習(xí)記憶能力消失，更好地判斷炎癥因子的改變，避免了顱內(nèi)手術(shù)造成的炎癥和神經(jīng)元損傷，手術(shù)創(chuàng)傷不僅激活了外周的免疫反應(yīng)，也激活了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。研究[12]顯示, IL-1β受體缺失大鼠術(shù)后神經(jīng)炎癥反應(yīng)減弱，認(rèn)知功能受損的發(fā)生率明顯下降。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腹腔注射SCOP可影響模型組、低劑量組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間等指標(biāo)。在最后1 d的定位巡航實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠尋找平臺(tái)潛伏期增加，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，且與紅景天苷治療劑量存在相關(guān)性，高劑量組與空白組變化趨勢(shì)相近，推測(cè)長(zhǎng)期給予SCOP但不給予紅景天苷治療后，大鼠存在相對(duì)的學(xué)習(xí)記憶損傷。研究[13]發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)有過(guò)量的炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)，同時(shí)可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并增加其他促炎癥因子的釋放。β淀粉蛋白沉淀引起的一系列神經(jīng)毒性作用可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂和死亡，并引發(fā)癡呆，腦內(nèi)慢性炎癥、氧化應(yīng)激機(jī)制等起著重要的作用[14]。神經(jīng)元受損是AD病變的一個(gè)關(guān)鍵癥狀[15], 海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷也是評(píng)估患者病情改善情況的重要指標(biāo)。

綜上所述，紅景天苷能顯著增強(qiáng)AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，調(diào)節(jié)中樞炎癥狀態(tài)，修復(fù)海馬神經(jīng)元的病理?yè)p傷，其機(jī)制可能與改善炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫功能有關(guān)。