3株耐鹽堿促生菌對綠豆根際微生態的影響

王艷宇，劉 爽，李 鑫，王思文，劉 權，殷奎德，張興梅

(1.黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

據統計，全球鹽堿土地面積約達10億公頃[1]，同時，灌溉方式不當、過度使用農藥化肥和亂砍亂伐等人為因素導致土壤鹽堿化程度更加嚴重。土壤中的大量無機鹽不僅會降低土壤肥力，還會影響植物的正常生理活動，最終造成糧食減產[2]。因此，利用生態友好且高效的途徑改良鹽堿地，是當前推動農業發展和生態環境恢復的重要舉措[3]。

微生物改良鹽堿地是當前的研究熱點，其基本原理是應用根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)來改善植物根系微環境，進而緩解鹽堿脅迫對植物生長的抑制作用，最終達到改良鹽堿土壤的目的。根際土壤作為土壤-植物根系-微生物三者間進行物質循環和能量轉化最活躍的區域，對保持生態系統養分動態平衡有著至關重要的作用[4]。PGPR是定殖于植物根系的有益菌[5]，具有提高營養元素可得性、分泌植物激素[6]、產生抗菌物質和誘導植物系統抗性等功能[7]。當PGPR到達植物根系時，土壤微生物群落結構和養分含量會發生改變，這一過程是其發揮促生作用的前提[8]。目前，國內外研究較多報道了PGPR在鹽堿脅迫下對植物生長的促生效果[9-11]，關于施用PGPR對植物根際土壤微生態影響的研究卻鮮有報道。因此，探究鹽堿脅迫下PGPR對植物根際微生物代謝功能和群落結構的影響，對明確PGPR的促生機制來說是必要的。

本研究利用耐鹽堿促生菌S29、KM1和NM8，通過盆栽試驗探究單一菌株與復合菌系對綠豆生長和土壤酶活性的影響，同時采用Biolog-Eco板和高通量測序技術檢測綠豆根際土壤細菌代謝功能和群落結構的變化，為提高綠豆耐鹽堿能力和改良鹽堿土壤提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 綠豆品種 試驗用的綠豆品種為“小明綠”，由國家雜糧中心提供。

1.1.2 菌株來源 盆栽試驗中接種的菌株S29、KM1和NM8由黑龍江八一農墾大學植物微生物互作實驗室提供，篩選自大慶地區鹽堿土，菌株S29為卓貝爾氏菌(Zobellella)，具有固氮、產鐵載體、產吲哚乙酸(IAA)和ACC脫氨酶功能；KM1和NM8分別為沙雷氏菌(Serratia)和芽孢桿菌(Bacillus)，均具有固氮、解磷、產IAA和ACC脫氨酶功能，3株菌均能夠在pH 9.5濃度為100 mmol·L-1NaHCO3的培養基上生長。

1.1.3 土壤樣品采集 用于綠豆盆栽試驗的土壤采集自大慶市植被生長較好的鹽堿地草原，pH 8.34，可溶性鹽含量1.5 g·kg-1，堿解氮、速效鉀和有效磷含量分別為86.00、398.00、19.20 mg·kg-1，有機質含量為33.70 g·kg-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的制備 將菌株S29、KM1和NM8接種于LB培養基，28℃、175 rpm·min-1培養24 h，用無菌水調節細菌數至108CFU·mL-1，將調節后的KM1、NM8和S29菌懸液等體積混合即為復合菌系。

1.2.2 盆栽試驗 共設4個處理組和1個對照組(CK)，處理組分別為接種菌株S29、KM1、NM8和復合菌。將取回的鹽堿土與沙子以2∶1的比例混合，裝入31 cm×25 cm方槽中，每個方槽裝7.5 kg混合土，綠豆種子經次氯酸鈉消毒后播種，播種密度為每槽30株，重復3次，播種后按照1 g土107CFU接種量菌株稀釋培養液，CK組加入等量培養基稀釋液，置于人工氣候室中培養。出苗15天后補接菌液1次，接種量為上一次的50%，同時澆灌Hoagland營養液500 mL，適時澆灌等量蒸餾水。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 綠豆的生長指標 綠豆生長至30 d時統計植株的株高、地上及地下部分的干重和鮮重。

1.3.2 綠豆根際土壤酶活性的測定 利用“抖根法”[12]收集不同處理下生長30 d的綠豆根際土，采集的土壤置于室內自然風干后，參照關松蔭[13]的方法進行堿性磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和脲酶活性測定。

1.3.3 綠豆土壤細菌對不同碳源利用情況的測定 取5 g綠豆根際土加入到裝有50 mL無菌水的三角瓶中，震蕩混勻后靜置片刻，吸取上清液用無菌水稀釋1 000倍。取115 μL上述稀釋液加入到Biolog-ECO微孔板中，30℃恒溫避光培養10 d，每隔12 h采用酶標儀測590 nm和750 nm處吸光值。土壤細菌群落對碳源利用的能力用每孔顏色變化率表示(Average well color development，AWCD)：

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中,Ci為所測定的每孔吸光值，R為對照孔吸光值，31為Biolog-Eco平板上供試碳源數。

1.3.4 綠豆根際土壤細菌多樣性測定 取不接種菌株處理下的綠豆根際土壤樣品，使用土壤基因組試劑盒提取土壤總DNA，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量；利用通用引物對515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTRAGTTT-3’)對DNA進行擴增，擴增區間為V4-V5區，PCR反應條件、體系和PCR產物的純化參照Hao等[14]的方法。將純化后的樣品采用Illumina HiSeq平臺進行高通量測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

獲得下機原始數據后，使用Trimmomatic軟件質控，再采用FLASH軟件進行拼接，得到優化數據后按照97%的相似性進行分類操作單元(Operational taxonomic units，OTU)聚類，用于微生物多樣性分析。

1.4 數據處理與分析

數據的計算與處理采用Microsoft Excel 2007軟件，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，柱形圖的制作使用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫下3株促生菌對綠豆生長的影響

由表1可以看出，單株菌S29處理下的綠豆根系鮮重較對照增加了19.27%，菌株KM1、NM8和復合菌處理下的綠豆根系鮮重分別增加了25.85%、22.93%和31.22%，根系干重分別增加了25.00%、22.73%和29.55%。可見，接種促生菌能夠促進鹽堿脅迫下綠豆根系的生長，復合菌促生效果比單株菌促生效果好。

表1 促生菌對綠豆植株生長的影響Table 1 Effects of PGPRs on the growth of mung bean plants

2.2 鹽堿脅迫下3株促生菌對綠豆根際土壤酶活性的影響

由表2可知，所有接菌處理均能夠顯著提升土壤堿性磷酸酶活性和蔗糖酶活性，其活性排序分別為S29>S+N+K>NM8>KM1>CK和S+N+K>NM8>S29>KM1>CK；菌株S29及復合菌處理能夠顯著增加土壤脲酶活性，脲酶活性排序為S+N+K>S29>NM8>CK>KM1，其中S29處理的土壤堿性磷酸酶活性較CK增加了25.23%，復合菌處理后的土壤蔗糖酶和脲酶活性分別是CK的1.35倍和1.16倍，而所有接菌處理的過氧化氫酶活性均為下降的趨勢。

表2 促生菌對綠豆根際土壤酶活性的影響Table 2 Effects of PGPRs on soil enzyme activities of mung bean rhizosphere

2.3 鹽堿脅迫下3株促生菌對綠豆根際土壤細菌利用碳源的影響

2.3.1 綠豆根際土壤細菌代謝活性 對單株促生菌、復合促生菌和未接菌處理的綠豆根際土進行了Biolog-Eco測定(圖1)。結果表明，隨著培養時間的延長，不同處理下的土壤細菌對碳源的利用率逐漸增大。菌液處理下的土壤AWCD值均高于對照組，且KM1的AWCD值最高，最高值為1.39。培養土壤細菌前84 h，不同處理下的AWCD值增長較快，具有較高的斜率，碳源被大量利用；120 h后AWCD值增長速率降低，曲線接近于平緩，說明細菌的代謝能力有所下降。從整體來看，菌液KM1處理下的AWCD值增長最為明顯，說明其土壤細菌代謝能力最強；在整個培養過程中，各處理下的AWCD值為：KM1>復合菌>S29>NM8>CK，說明菌液處理下的根際土壤細菌代謝能力較強。

圖1 綠豆根際土壤細菌平均吸光值變化Fig.1 Variation of average well color development of bacteria in mung bean rhizosphere soil

2.3.2 綠豆根際土壤細菌碳源利用種類 選取培養時間為240 h的AWCD值分析不同菌液處理下的土壤微生物對6類碳源的利用情況。由圖2可以看出，KM1、NM8和復合菌處理下的土壤細菌對6種碳源的利用率均高于對照組。在所有接菌處理中，施用菌液KM1后的土壤細菌對6種碳源的利用率最高，其大小順序依次為胺類、氨基酸類、酚酸類、羧酸類、多聚物類和碳水化合物類，AWCD值分別達到了1.61、1.49、1.46、1.41、1.35和1.25；NM8和復合菌處理土壤細菌群落中的優勢代謝碳源分別為酚酸類、胺類和氨基酸類，AWCD值分別1.20、1.17和1.15，1.31、1.37和1.23；S29處理對酚酸類利用率最差，但對于其他種類碳源的利用程度均高于對照組。因此，接菌處理會在一定程度提高土壤細菌對碳源的利用率。

圖2 綠豆根際土壤細菌對不同碳源的利用率Fig.2 Utilization ratio of different carbon sources by mung bean rhizosphere soil bacteria

2.4 鹽堿脅迫下3株促生菌對綠豆根際土壤細菌多樣性及群落結構的影響

2.4.1 綠豆根際土壤細菌Alpha多樣性和OTU 通過采用Illumina HiSeq平臺對不同接種處理下的綠豆根際土DNA進行測序，其覆蓋率均大于97%，說明測序結果足夠反應樣本的真實情況，存在遺漏的可能性較小。表3為測序土壤樣品Alpha多樣性指數結果，其中菌株S29、NM8、KM1以及復合菌處理的土壤Shannon指數均顯著高于對照土壤，Simpson指數則呈現相反的結果，說明接種不同的耐鹽堿促生菌能夠提高鹽堿脅迫下綠豆根際土壤的細菌多樣性；除此之外，4種接菌處理下的土壤的Chao1也得到了顯著提升，表明促生菌可以提高土壤細菌的物種豐富度。

表3 細菌群落Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of bacterial community

2.4.2 綠豆根際土壤群落組成 細菌門水平的相對豐度如圖3所示，在S29、KM1、NM8和S+N+K組土壤樣品中，放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度均小于其對照組，且3個菌門在復合菌處理的土壤中相對豐度最低，分別為16.16%、11.12%和3.82%；另外6個菌門在接菌處理土壤中的相對豐度均高于對照土壤，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和藍細菌門(Cyanobacteria)在S+N+K組土壤中的相對豐度較高，分別為42.67%、11.05%、5.93%、2.90%和1.07%。

圖3 綠豆根際土壤門水平的細菌群落組成Fig.3 Bacterial community composition of mung bean rhizosphcre soil in phylum level

屬水平上來看，不同處理間屬水平的細菌組成差異明顯。其中卓貝爾氏菌屬(Zobellella)在CK、KM1和NM8組的相對豐度為0，未被檢測到，在S29和S+N+K中相對豐度分別為2.51%和7.51%。同時沙雷氏菌屬(Serratia)僅存在于菌株KM1和復合菌處理的土壤中，相對豐度分別為1.36%和0.19%。此外，在4種接菌處理的土壤中，norank_c__Acidobacteria、norank_f__Anaerolineaceae、norank_f__MSB-1E8、Nocardioides、norank_o__JG30-KF-CM45、norank_f__Gemmatimonadaceae、Altererythrobacter和Marmoricola的相對豐度均高于CK。

2.4.3 綠豆根際土壤細菌Beta多樣性 對OTU數據進行PCA分析(Principal component analysis)，即主成分分析，結果如圖5所示。同一處理的3個樣本距離較近，重復性較好，且5個處理間有一定距離，表明樣本間存在一定差異。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的貢獻率分別為58.99%和18.68%，S+N+K組和S29組沿主成分1與NM8、KM1、CK組明顯區分，且NM8和KM1組沿主成分2與CK、S+N+K組明顯區分，表明組間微生物差異較大，而NM8組與KM1組距離不明顯，微生物差異較小。

圖5 綠豆根際土壤細菌菌群主成分分析Fig.5 Principal component analysis of soil bacterial flora in mung bean rhizosphere

3 討 論

目前利用PGPR促進植物生長已成為當下的研究熱點，然而單株菌在促生功能和環境適應上存在一定的局限性，因此將具有不同促生功能的菌株復合施用是當下提高其穩定性的重要手段[15]。劉冠一等[16]研究發現鹽堿脅迫下，復合菌對苜蓿的促生作用明顯優于單株菌?；ㄉ呐柙栽囼炛?，接種復合菌后花生的株高和鮮重較對照增加了37.60%和63.90%，土壤養分含量也得到顯著提高[17]。在本試驗中，在鹽堿土中接菌處理下綠豆根系鮮重和干重得到顯著提高，且復合菌處理下促生效果更明顯，反映了不同促生菌的共同施用能夠相互協同促進植物的生長。

圖4 綠豆根際土壤屬水平的細菌群落組成Fig.4 Bacterial community composition of mung bean rhizosphere soil in genus level

土壤酶作為植物與養分之間的紐帶，既能客觀地反映土壤的肥力情況，又能間接地影響土壤中營養元素的循環[18-19]，其活性受微生物數量和種類影響較大，同時也是衡量土壤微生物功能多樣性的指標[20]。在本試驗中，接菌處理后的綠豆根際土壤的堿性磷酸酶和蔗糖酶活性均高于對照；其中菌株S29、NM8和復合菌能夠增加土壤脲酶活性，且復合菌處理對土壤脲酶和蔗糖酶的提高比例高于單株菌。這是因為促生菌的施用一方面能夠加快土壤中有機物分解速度，為酶促反應提供底物，另一方面充足的碳源和氮源促進了微生物的生長繁殖，其代謝產物是土壤酶的重要組成[21]。過氧化氫酶能夠分解對植物有毒害作用的過氧化氫，在土壤和生物體中分布廣泛。試驗中所有促生單菌或復合菌處理后，土壤過氧化氫酶都有下降的趨勢，這可能由于施用促生菌后土壤微生態環境發生了變化，鹽堿脅迫得以緩解，對植物有害的過氧化氫含量有所減少?？傮w來看，耐鹽堿促生菌的施用提高了鹽堿脅迫下綠豆根際土壤酶活性，對改良鹽堿土壤有一定作用。

Biolog-Eco平板法能夠評價土壤微生物群落結構并獲得大量功能多樣性方面的信息[22]。施用微生物菌劑能夠使土壤微生物功能發生改變，形成不同代謝類型的土壤微生物種群，進而改變土壤微生物群落結構[23]。本試驗測定了240 h內不同接種處理下的土壤細菌對碳源的利用情況，菌株KM1、NM8和復合菌處理能夠增強其土壤細菌對六大碳源的利用率，其他研究也得到了相似的結果[24-25]。值得注意的是，菌株S29處理后，土壤細菌對酚酸類碳源的利用能力有所下降，其原因可能是不同菌株的施用影響了根系分泌物的數量和種類[22]，其與微生物之間的相互作用形成了差異性的效應。因此，探究接種不同促生菌對綠豆根際分泌物的影響將是今后研究的重要內容。

高通量測序技術能夠更加全面地揭示土壤微生物群落結構的復雜性和多樣性[26]。研究結果表明，所有接菌處理下的Shannon和Chao1指數高于對照，Simpson指數呈現相反的結果，說明接種促生菌能夠提高綠豆根際土壤細菌多樣性和豐富度。在一定范圍內，酸桿菌門的相對豐度與pH值成反比[27]，酸桿菌門在所有接菌處理的土壤中相對豐度均有所增加，猜想可能是促生菌的施用降低了鹽堿土的pH值，土壤環境更加適合酸桿菌的生長。雖然門水平上的接菌處理優勢細菌組成與對照組基本相同，但變形菌門、芽單胞菌門和藍細菌門等有益菌[28-29]的相對豐度在接菌處理組中表現為增加，復合菌處理表現得尤為明顯。卓貝爾氏菌和沙雷氏菌分別存在于菌株S29、KM1和復合菌處理的土壤中，芽孢桿菌在所有土壤中均被檢測到，表明試驗所施用的菌株均能夠在鹽堿條件下生存且在綠豆根際定殖。因此，試驗中接種的耐鹽堿促生菌能夠調節綠豆根際土壤細菌群落結構，增加土壤中有益菌的相對豐度，從而間接地促進綠豆生長。

4 結 論

研究結果表明，鹽堿脅迫下，促生菌能夠顯著增加根系鮮重和干重，復合菌促生效果更明顯。所有接菌處理均能夠提高土壤堿性磷酸酶和蔗糖酶活性，并增加綠豆根際土壤細菌對碳源的利用能力、土壤細菌多樣性和物種豐富度并促進有益菌的生長，說明促生菌的施用明顯改善了綠豆根際微生態，緩解了鹽堿脅迫對于綠豆生長的不利影響。