外源殼寡糖對低溫脅迫條件下煙草幼苗的保護作用

陳芊如， 丁蓬勃， 胡希好， 趙福彬， 邰振益， 趙忠利， 劉宗霞， 李義強， 鄒 平

(1.中國農業科學院煙草研究所，山東青島 266000； 2.山東青島煙草有限公司，山東青島 266000)

煙草是一種喜溫植物，其最適生長溫度范圍是25～28 ℃，當溫度下降至12 ℃以下時，煙草出苗率下降，苗期生長緩慢。低溫脅迫下，煙草幼苗體內產生大量活性氧(ROS)，生理代謝發生紊亂，葉片光合速率下降，能量產生和物質代謝受阻，最終導致植株葉片萎蔫甚至死亡。在福建省、江西省等南方煙區，在早春常有倒春寒等低溫危害發生；在西南、黃淮、東北煙區，苗床期低溫寡照的情況也時常發生，導致移栽后煙苗質量差，還苗期延長，煙葉的產量和質量受到影響。因此，如何緩解低溫脅迫對煙草植株尤其是煙草幼苗的傷害是煙草生產中亟待解決的問題。

幾丁質(別稱甲殼素)是一種天然聚合物，在地球上含量非常豐富，幾丁質脫乙酰基后降解產生殼寡糖(COS)。殼寡糖是一種水溶性的堿性寡糖，也是一種海洋來源生物刺激素，能夠促進植物生長，增強植物的抗病性和抗逆性。研究表明，殼寡糖能夠通過增強植株光合作用及抗氧化酶活性提高油菜、甘蔗、玉米、花生等作物的抗旱性。筆者所在實驗室前期研究發現，殼寡糖能夠通過調節離子轉運及滲透調節提高小麥幼苗的抗鹽性；還能夠增強小麥光合作用及抗氧化能力，從而提高小麥低溫抗性。在煙草上，相關文獻報道，殼寡糖能夠誘導煙草對煙草花葉病毒(TMV)的侵染產生系統抗性；對煙草赤星病病原菌菌絲生長、孢子萌發、產孢量均有一定的抑制作用；但對殼寡糖能否提高煙草抗低溫脅迫的研究還未見報道。針對煙草幼苗易受冷害影響的生產實際問題，本試驗選用低溫敏感的煙草品種為材料，研究低溫脅迫下殼寡糖對煙草幼苗生理指標的影響，以期為煙草苗期栽培管理提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草資源為H382，屬于低溫敏感材料，由中國農業科學院煙草研究所國家煙草種質資源中期庫提供。殼寡糖(脫乙酰度>95%，聚合度3～10)購自肇慶市生物科技有限公司。試驗于中國農業科學院煙草研究所人工氣候箱中進行，試驗時間為2020年10—12月。

1.2 試驗方法與測定指標

1.2.1 培養方法 用1%次氯酸鈉溶液將H382種子消毒10 min，再用蒸餾水反復沖洗后晾干，點種至育苗盤。待煙草幼苗長到4葉期時，將長勢一致的煙苗移栽到直徑為10 cm的塑料盆中，放入光照時間為14 h、晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃、光照度為 800 μm/(m·s)、相對濕度為(65±5)%的人工氣候培養箱中。

待煙草幼苗長出第6張葉片時，將其隨機分為3組(每組20盆)。對照組(CK)于人工氣候培養箱25 ℃培養；低溫脅迫組于人工氣候培養箱4 ℃培養，并分別噴施0(Chilling stress)、50(T1)、100(T2)、500 mg/L(T3)殼寡糖，24 h后移到4 ℃人工氣候培養箱培養。在低溫脅迫后24、48、72 h取葉片，迅速放入液氮中速凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用以測定各項生理指標，每個處理3次重復。在低溫脅迫7 d后，進行樣品采集測定其生物量。

1.3 統計方法

采用 SPSS(version 19.0)軟件中的Duncan’s多重比較分析法，對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 殼寡糖對低溫脅迫下煙草幼苗活性氧(ROS)含量的影響

2.2 殼寡糖對低溫脅迫下煙草幼苗MDA和脯氨酸含量的影響

從圖2可以看出，低溫脅迫下，煙草幼苗體內MDA含量呈現逐漸上升的趨勢，在脅迫24、48、72 h時，MDA含量分別比對照組高47.3%、62.9%、67.4%。殼寡糖處理能夠顯著降低煙草葉片中MDA含量，其中，100 mg/L殼寡糖效果最好，其處理組MDA含量顯著降低，與對照組沒有顯著性差異。在處理24、48、72 h時，T2處理組MDA含量分別比低溫脅迫組低26.6%、34.4%、37.6%(圖2-A)。隨著低溫處理時間的不斷延長，煙草幼苗中脯氨酸含量呈現先升高后降低的趨勢。在脅迫24、48 h 時，脯氨酸含量分別是對照組的1.37、1.85倍；脅迫72 h時脯氨酸含量有所下降，但仍然是對照組的1.48倍。在低溫脅迫下，施用不同濃度殼寡糖能夠顯著增加煙草葉片脯氨酸含量。其中，100 mg/L 殼寡糖處理組脯氨酸含量顯著高于其他濃度處理組，在處理24、48、72 h時，脯氨酸含量分別比低溫脅迫組高37.2%、19.6%、40.1%(圖2-B)。

2.3 殼寡糖對低溫脅迫下煙草葉片滲透調節物質的影響

從圖3可以看出，低溫脅迫24、48、72 h后，煙草幼苗葉片可溶性糖含量先升高后降低。在24、48 h 時，煙草葉片可溶性糖含量比對照組分別升高12.9%、12.7%；脅迫72 h后，煙草葉片可溶性糖含量比對照組略低，但與對照組之間無顯著性差異。不同濃度殼寡糖處理后，煙草葉片可溶性糖含量顯著升高；其中100 mg/L殼寡糖處理組在24、48、72 h時，可溶性糖含量比低溫脅迫組分別高19.9%、28.1%、64.6%(圖3-A)。在低溫脅迫下，煙草幼苗體內可溶性蛋白含量也呈現先升高后降低的趨勢；施用外源殼寡糖可以顯著提高煙草葉片可溶性蛋白含量(圖3-B)。

2.4 殼寡糖對低溫脅迫下煙草葉片抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下，煙草幼苗葉片中的SOD、POD、CAT及APX活性均呈現先上升后下降的趨勢。在低溫脅迫24、48 h時，SOD活性分別比對照組高30.3%、26.1%(圖4-A)；POD活性分別比對照組高12.6%、26.3%(圖4-B)；CAT活性分別比對照組高45.0%、53.1%(圖5-A)；APX活性分別比對照組高24.5%、33.1%(圖5-B)。在低溫脅迫 72 h 后，SOD、POD、CAT及APX活性均有所下降。不同濃度殼寡糖處理能夠繼續提升SOD、POD、CAT及APX活性。在100 mg/L殼寡糖處理的24、48、72 h 時，SOD活性分別比低溫脅迫組高48.0%、70.4%、124.3%(圖4-A)；POD活性分別比低溫脅迫組高36.0%、47.0%、92.2%(圖4-B)；APX活性分別比低溫脅迫組高13.9%、35.1%、51.6%(圖5-A)；APX活性分別比低溫脅迫組高59.6%、69.0%、79.6%(圖5-B)?？梢姡┯猛庠礆す烟强梢燥@著提高煙草幼苗體內抗氧化酶活性，其中，100 mg/L殼寡糖處理組中煙草幼苗抗氧化酶活性最高。

2.5 殼寡糖對低溫脅迫下煙草幼苗生物量的影響

對煙草幼苗繼續進行培養及低溫脅迫，在培養7 d時，處理組間煙苗表型差異明顯，低溫脅迫下，煙草幼苗長勢緩慢，植株矮小，葉片出現萎蔫。與對照組相比，煙草幼苗根長減少41.0%，地上部分和根系的鮮質量、干質量分別減少22.5%、24.9%和45.4%、49.1%(表1)。噴施不同濃度殼寡糖溶液能夠緩解低溫脅迫對煙草幼苗的傷害，促進植株與根系生長。從表1可以看出，殼寡糖處理能夠顯著增加根長，顯著提高煙草幼苗地上部分以及根系的鮮質量、干質量。其中，100 mg/L殼寡糖處理后，煙草幼苗根系的鮮質量和干質量與其他濃度殼寡糖處理組差異顯著。

表1 低溫脅迫下殼寡糖對煙草幼苗生物量的影響

3 討論與結論

植物在逆境脅迫下細胞滲透勢會發生改變。植物通過積累可溶性糖和可溶性蛋白等小分子物質，來降低細胞的水勢，維持細胞內水分平衡和膜的穩定性，從而動態調節細胞滲透勢；同時，糖類是細胞結構的重要組成部分，而且是能量和物質基礎。周培祿通過轉錄組和代謝組分析發現，在低溫脅迫下煙草氮代謝和糖代謝增強，提高了細胞內游離氨基酸和其他含氮物質甜菜堿的含量，增加了可溶性糖含量，從而調節了細胞滲透式，維持細胞水分平衡，提高了煙草抗寒性。本試驗中低溫脅迫24、48 h時，煙草幼苗體內滲透調節物質含量均明顯增加；而在脅迫72 h時，含量則開始下降，這可能是因為低溫抑制了植物體內酶活，造成滲透調節物質合成和代謝受阻。外源施用殼寡糖可以進一步顯著提高煙草幼苗滲透調節物質含量，有助于維持植物的滲透平衡和細胞膜穩定性。有研究表明，低溫脅迫下，噴施殼寡糖可以增加小麥體內可溶性糖含量，減弱低溫對植物組織液的冷滯效應，保證細胞中溶質的流動性。

在逆境脅迫下，脯氨酸發揮著多種生理學功能，游離脯氨酸具有強親水性，能夠降低細胞水勢，緩解逆境脅迫造成的細胞脫水；脯氨酸還能夠與蛋白質形成輸水的骨架，保護結構的穩定性，維護植物體內細胞膜結構的完整。有研究表明，外源施用脯氨酸能夠提高植物抗氧化酶活性，增強植株光合作用從而提高植物抗鹽性。有趣的是，脯氨酸處理組植株中內源脯氨酸含量升高，可溶性糖含量降低，說明脯氨酸可能限制了鹽脅迫植物對可溶性糖合成的需要，而由脯氨酸起重要的滲透保護作用。本試驗中低溫脅迫誘導產生的脯氨酸含量高于對照組，殼寡糖處理進一步提高了低溫脅迫下煙草幼苗的脯氨酸含量，以緩解低溫導致的滲透脅迫。外源施用褐藻寡糖、水楊酸、調環酸鈣均可以提高低溫脅迫下煙苗幼苗體內的脯氨酸含量，緩解低溫造成的滲透脅迫，提高植物抵抗低溫脅迫的能力。

綜上所述，施用外源殼寡糖可以降低低溫脅迫對煙草幼苗的氧化損傷，增加滲透調節物質含量，增強植株抗氧化活性，從而緩解煙草幼苗在低溫環境下受到的傷害。低溫脅迫下，殼寡糖對煙草幼苗的保護作用，為緩解煙草應對倒春寒等低溫災害提供了良好的思路。其中，100 mg/L殼寡糖對低溫脅迫下煙草幼苗的緩解作用最強，高濃度殼寡糖緩解效果反而降低；因此，在實際生產應用中，考慮到效益及成本，100 mg/L殼寡糖是最優選擇。為了更好地研究殼寡糖對煙草抗低溫能力的影響，其低溫緩解效應的分子機制、品種的響應差異還有待進一步研究闡明。