電子自旋共振波譜法檢測60Co-γ射線輻照中藥材

梁 倩， 李詠富， 何揚波， 龍明秀， 田竹希， 石 彬

(貴州省農業科學院現代農業發展研究所，貴州 貴陽 550006)

由于中藥材植物生長的特性，常含有大量的有機質，容易受到微生物的污染[1]，需要進行滅菌處理，常用方法有化學熏蒸滅菌、干熱濕熱滅菌、水洗除菌及輻照滅菌[2]，但均存在一定的局限性，對中藥材中易揮發、熱不穩定成分影響較大，而且會對環境造成一定的污染[3-4]。2015 年版《中國藥典》規定，輻照滅菌技術為原料藥滅菌方法之一，它是指將物品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法，具有穿透力強、無化學殘留、處理成本低、能耗少等優點[5-6]，適用于含有熱敏性成分、含糖成分高、易霉變的中藥材的滅菌[7-8]。

目前，中藥材輻照滅菌存在以下問題：企業在生產加工中藥材過程中衛生要求達不到標準，導致中藥材細菌數量嚴重超標，或者省去中藥材原材料的滅菌過程，對其進行加工成制劑后利用高劑量輻照對其進行處理，導致輻照劑量超過國家標準；中藥材輻照滅菌的效果不一，部分微生物例(如革蘭氏陽性微生物)很難殺死，大多數藥廠會因其不達標而進行重復輻照。中藥材輻照滅菌技術得到推廣應用的同時，其安全性問題也成為了關注點之一[9-10]。

常用于鑒定輻照物品和食品的檢測方法有光釋光法、熱釋光法、電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)波譜法等[11-12]，但目前對ESR波譜法的應用相對較少，它可以靈敏地檢測出自由基的產生[13-14]，其原理是樣品通過輻照產生的自由基被樣品中的骨頭、纖維素等固體或干硬物捕獲，從而被檢測出來，具有靈敏、便捷、對樣品無損傷等優點，已成功應用在干果[15-16]、植物[17-18]、肉類[19-20]、醫療器械[21]檢測中，但鮮有涉及中藥材。本實驗對輻照杜仲、金銀花、黑骨藤ESR信號強度與吸收劑量之間關系等進行研究，為中藥材輻照質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 微型電子自旋共振(ESR)波譜儀，德國Bruker公司；CX-100型高速多功能粉碎機，上海緣沃工貿有限公司；40目標準檢驗篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；60Co-γ輻射源，貴州省金農輻照技術有限公司。

1.2 藥材 杜仲、金銀花、黑骨藤購于貴州省貴陽市中藥材市場，經專家鑒定為正品，自然晾干后用粉碎機將其粉碎，過40目篩，聚乙烯自封袋包裝，備用。

1.3 方法

1.3.160Co-γ射線輻照 稱取3種藥材各10 g，裝入7組聚乙烯自封包裝袋中，每種6組，設置吸收劑量為1、3、5、7、9、12 kGy，對其進行60Co-γ射線輻照，室溫保存。采用重鉻酸銀劑量計標定，劑量計與中國計量科學院劑量計(NDAS)對比，要求誤差小于±3%。

1.3.2 ESR檢測 準確稱取輻照后樣品適量，裝入ESR管中，壓實，置于諧振腔中，每個樣品平行3份，重復測量3次。工作條件為中心磁場3 460 Gs；掃描寬度100 Gs；微波功率15～40 mW；調制振幅5.3 Gs；溫度室溫。

2 結果

2.1 ESR對杜仲60Co-γ射線輻照后的影響

2.1.1 信號強度與微波功率的關系 圖1顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率0.5～15 mW時波譜峰信號強度為1.2～13.47，信號強度越大，波譜峰振幅越明顯，故選擇15 mW。

圖1 微波功率對杜仲60Co-γ射線輻照后信號強度的影響

2.1.2 波譜信號 輻照處理后，植物中重點纖維素和多糖在60Co-γ射線作用下能誘導產生自由基，含有未成對電子，在外加磁場的作用下會產生自旋共振吸收現象[22]。不同劑量輻照后杜仲粉ESR波譜圖(0～12 kGy)見圖2，可知在0 kGy時在中心磁場出現1個特征峰，其中波譜特征參數g=2.006 8±0.001 9，正負峰高之間磁場寬度ΔH=49.32 Gs；經過0～12 kGy劑量輻照后，在中心磁場區域出現的波譜峰信號強度均增大，在12 kGy時更明顯。

2.1.3 信號強度與吸收劑量的關系 杜仲吸收劑量與ESR波譜信號強度呈正相關，二次擬合式為Y=-0.006 5X2+1.207 1X+6.778 7(r=0.984 3)，在0～12 kGy范圍內線性關系良好。

圖2 不同劑量60Co-γ射線輻照后杜仲ESR波譜圖

2.1.4 信號強度與貯藏時間的關系 貯藏時間是影響ESR強度變化的重要因素[23]，本實驗在相同貯藏條件下，檢測0～80 d內各藥材60Co-γ射線輻照后ESR信號強度，結果見表1。由此可知，在20 d時吸收劑量1 kGy的ESR信號強度衰變了44%，3～9 kGy衰變了60%左右，12 kGy衰變了80%；在20～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，所有吸收劑量的ESR信號強度衰變平均超過70%，其中12 kGy衰變了90%，表明杜仲最佳檢測時間在80 d內。

表1 60Co-γ射線輻照后杜仲在不同貯藏時間的ESR信號強度

2.2 ESR對金銀花60Co-γ射線輻照后的影響

2.2.1 信號強度與微波功率的關系 圖3顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率25 mW時波譜峰振幅較明顯，故選擇25 mW。

圖3 金銀花60Co-γ射線輻照后微波功率對信號強度的影響

2.2.2 波譜信號 金銀花經1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射線輻照后，ESR波譜信號強度見圖4。由此可知，輻照前在中心磁場出現1個特征峰，其中波譜特征參數g=2.006 5±0.001 0，正負峰高之間磁場寬度ΔH=41.3 Gs；輻照后中心磁場的波譜峰信號強度均發生改變，ESR波譜峰信號強度均有所增大；隨著吸收劑量增加，波譜峰信號強度、自由基總量升高，在特征峰兩邊出現較不明顯的對稱峰，這是由于纖維素輻照后產生的自由基特征峰[24]。

圖4 不同劑量60Co-γ射線輻照后的金銀花ESR波譜圖

2.2.3 信號強度與吸收劑量的關系 金銀花吸收劑量與ESR波譜信號強度呈正相關，二次項擬合式為Y=-0.032 4X2+1.707 8X+2.788 9(r=0.998 8)，在0～12 kGy范圍內線性關系良好。

2.2.4 信號強度與貯藏時間的關系 在0～80 d內60Co-γ射線輻照后金銀花ESR信號強度隨時間的變化規律見表2。由此可知，在20 d時，吸收劑量1～9 kGy的ESR信號強度衰變在50%～70%之間，12 kGy衰變了80%；在2～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，所有吸收劑量的ESR信號強度衰變均超過60%，并且與未輻照時的信號強度峰值接近，表明金銀花最佳檢測時間在80 d內。

表2 60Co-γ射線輻照后金銀花在不同貯藏時間的ESR信號強度

2.3 ESR對黑骨藤60Co-γ射線輻照后的影響

2.3.1 信號強度與微波功率的關系 圖5顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率0.5～70 mW時，波譜信號強度先明顯升高在40 mW后趨于平穩，而且微波功率過高會引起波譜峰的不穩定，故選擇40 mW。

圖5 黑骨藤60Co-γ射線輻照后微波功率對信號強度的影響

2.3.2 波譜信號分析 黑骨藤經1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射線輻照后，ESR波譜信號強度見圖6。由此可知，輻照前ESR波譜峰出現在磁場中心范圍，g=2.006 4±0.001 0，磁場寬度ΔH=51.68 Gs；輻照后譜峰信號強度升高；黑骨藤以根莖入藥，該部位有大量纖維，而在特征峰兩旁也產生了具有纖維素特征的對稱峰。

圖6 不同劑量60Co-γ射線輻照后的黑骨藤ESR波譜圖

2.3.3 信號強度與吸收劑量關系 黑骨藤吸收劑量與ESR波譜信號強度呈正相關，二次項擬合式為Y=-0.201 2X2+4.083 3X+9.426 9(r=0.940 4)，在0～12 kGy范圍內線性關系良好。

2.3.4 信號強度與貯藏時間關系 在0～80 d內60Co-γ射線輻照后黑骨藤ESR信號強度隨時間的變化規律見表3。由此可知，在20 d時，所有吸收劑量的ESR信號強度在吸收劑量1、3 kGy下衰變為40%，其余均衰變超過60%；在20～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，ESR信號強度衰變值均未達到輻照前水平。再考察ESR信號強度與貯藏時間的關系，結果見表4，發現最短檢測時間為97 d，表明黑骨藤最佳檢測時間在97 d內。

表3 60Co-γ射線輻照后黑骨藤在不同貯藏時間的ESR信號強度

3 討論

杜仲、金銀花、黑骨藤在射線的作用下能誘導自由基的產生，自由基中有未成對電子，在外加磁場作用下會產生自旋共振吸收現象，ESR檢測后信號強度反映了共振條件下樣品吸收的總能量，自由基含量越大，信號強度越大[25]。輻照后，3種中藥材ESR波譜峰振幅強度均發生改變，并且與未輻照的波譜峰振幅強度相比均有所增大，說明輻照產生的自由基含量隨著吸收劑量增加而增加，與輻照樹豆莢[26]一致。吸收劑量與波譜信號之間呈正相關，在輻照范圍內相關性均良好(r≥0.95)，與輻照中藥顆粒[27]一致，說明用ESR可以檢測輻照中藥材。李偉明[28]等發現，在15 d內葡萄皮ESR信號強度衰減為80%，葡萄籽和葡萄柄衰減為50%。貯藏時間直接影響了輻照后信號強度的衰變[29]，在80 d內杜仲與金銀花藥材的輻照信號強度衰變值與未輻照的信號強度值接近，因此≤80 d內對輻照杜仲、金銀花的檢測較為準確；通過線性擬合得出，黑骨藤最佳檢測時間為≤97 d。另外，微波功率對波譜信號強度有一定的影響，這與前期報道一致[30]。

表4 黑骨藤信號強度與貯藏時間的擬合結果

4 結論

本實驗探索杜仲、金銀花、黑骨藤輻照后ESR信號強度與微波功率、吸收劑量、貯藏時間之間的關系，證明誘導產生的自由基與波譜峰信號強度之間呈正相關，微波功率對波譜信號有一定的影響；吸收劑量與波譜信號之間呈正相關，在輻照范圍內相關性良好(r≥0.95)；貯藏時間對波譜信號有一定的影響。因此，建議在80 d內對輻照杜仲、金銀花，97 d內對輻照黑骨藤進行鑒定。