氧化苦參堿與安倍生坦聯用對野百合堿致肺動脈高壓大鼠右心室重構的作用

李本鵬， 徐玉平， 曾珠亮， 戴貴東

(凱里學院，貴州 凱里 556011)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)可導致機體肺循環功能障礙，引起肺血管阻力增加，誘發右心室超負荷、心室肥厚，最終發生右心衰竭[1-2]。RhoA是一種小分子蛋白質，屬于Rho蛋白家族成員。RhoA GTP酶及其下游ROCK與血管平滑肌收縮、應力纖維形成、細胞遷移及血壓調節等過程有關[3-4]，RhoA/ROCK蛋白的表達與高血壓引起的心肌肥厚有密切的關系[5-6]。苦參性苦、寒，氧化苦參堿是主要活性成分，具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調節等[7-8]，對心臟有正性肌力、減慢心率、抗心律失常作用[9]，氧化苦參堿具有較好的抗心肌缺血、腦缺血的作用[10-11]。安倍生坦是內皮素-1的選擇性抑制劑，對肝臟的毒性較小，生物安全性較高，近年來在治療肺動脈高壓上取得了良好的療效[12-13]。本研究在以野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓的基礎上，通過檢測RhoA/ROCK通路關鍵蛋白表達來探討氧化苦參堿聯合安倍生坦對心肌保護的可能分子機制，為該成分進一步的開發和利用提供依據。

1 材料

雄性SD大鼠，體質量180～200 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(川)2014-028，預養1周后進行實驗。氧化苦參堿(純度99.8%，批號20091028)購自寧夏紫荊花制藥有限公司；野百合堿(純度大于98%，貨號B101942)、安倍生坦(貨號EB0911)均購自上海士鋒生物科技有限公司。RhoA、ROCK1、ROCK2抗體均購自英國Abcam公司；相應二抗及內參β-actin均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2 方法

2.1 分組及建模 參考文獻[14-15]報道，60只大鼠隨機分成6組，分別為正常組、模型組、氧化苦參堿組、安倍生坦組、氧化苦參堿聯合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)、氧化苦參堿聯合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)。模型組和各給藥組皮下單次注射60 mg/kg野百合堿，正常組皮下注射等體積生理鹽水，安倍生坦組按10 mg/kg、氧化苦參堿組按25 mg/kg、氧化苦參堿聯合安倍生坦組分別按25 mg/kg+10 mg/kg、50 mg/kg+10 mg/kg灌胃給藥；正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，共28 d。所有大鼠在實驗期間自由飲水、飲食，飼養環境溫度保持在23 ℃左右，12 h/12 h光暗交替。

2.2 心臟肥厚指數檢測 末次給藥24 h后，烏拉坦腹腔注射給藥麻醉大鼠，股動脈取血后立即處死，開胸取心臟，用4 ℃生理鹽水清洗，剝離心臟上的其他結締組織，濾紙吸干殘余的生理鹽水后精密稱定全心質量 (HW)；分離右心室 (RV)、左心室和室間隔(LV+S)，計算全心質量/體質量 (HW/BW)及右心室質量/左心室和室間隔質量(RV/LV+S)比值。將右心室靠近心間的部分分離，放入4%多聚甲醛中固定48 h，剩余部分立即放入液氮凍存后，轉入-80 ℃冰箱中備用。

2.3 組織學觀察 將固定好的大鼠心肌組織用流水沖洗，經乙醇梯度脫水、石蠟包埋、4 μm切片、烤片后進行常規HE染色，顯微鏡下觀察形態學變化。

2.4 Western blot檢測右心室心肌組織中蛋白表達 取適量凍存的大鼠心肌組織，稱定質量后剪碎，放入研磨器中研磨，每100 mg加入冷裂解緩沖液1 mL，12 000 r/min離心10 min去除細胞碎片。取上清液，BCA法進行蛋白濃度測定，加入裂解緩沖液及上樣緩沖液使終質量濃度調至5 μg/mL，煮沸10 min，-20 ℃冰箱保存。取蛋白樣本100 μg，在8.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中電泳(80 V/100 V)分離，濕法轉膜，將條帶轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后分別用一抗 (RhoA，1∶600；ROCK1，1∶4 000；ROCK2，1∶500；β-actin，1∶2 000)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入二抗山羊抗兔(1∶5 000) 室溫孵育2 h，PBST洗膜4次后取出硝酸纖維素膜，加入化學發光劑顯色，曝光膠片，條帶以目的蛋白與相關β-actin光密度比表示，結果采用Image J軟件分析。

3 結果

3.1 氧化苦參堿聯合安倍生坦對肺動脈高壓大鼠體質量、心臟質量和心臟肥厚指數的影響 各實驗組大鼠初始體質量均無明顯變化(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠終末體質量降低(P<0.05)；與模型組比較，氧化苦參堿組、安倍生坦組大鼠終末體質量無明顯變化(P>0.05)，氧化苦參堿聯合安倍生坦組大鼠終末體質量增加(P<0.05)。與正常組比較，模型組大鼠心臟肥厚指數和右心室肥厚指數均增加(P<0.05)；與模型組比較，各聯合用藥組大鼠心臟肥厚指數和右心室肥厚指數均降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性關系；與安倍生坦組比較，各聯合用藥組和氧化苦參堿大鼠終末體質量、右心室肥厚指數均無明顯變化(P>0.05)，各聯合用藥組大鼠心臟肥厚指數降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質量、右心室肥厚指數、心臟肥厚指數比較

3.2 氧化苦參堿聯合安倍生坦對肺動脈高壓大鼠右心室組織形態的影響 如圖1所示，正常組大鼠右心室心肌細胞形態正常，排列緊密；模型組大鼠右心室心肌細胞間隔變大，排列順序紊亂、胞漿有腫脹,有些區域心肌纖維化增生；安倍生坦組及氧化苦參堿組大鼠心肌形態與模型組比較無明顯變化；各聯合給藥組大鼠心肌纖維排列間隔較模型組減小，胞漿腫脹也有不同程度的改善。

3.3 氧化苦參堿聯合安倍生坦對肺動脈高壓大鼠右心室心肌組織RhoA蛋白表達的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織內RhoA蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，安倍生坦組及氧化苦參堿組大鼠心肌組織內RhoA蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，氧化苦參堿聯合安倍生坦組大鼠心肌組織內RhoA蛋白表達降低(P<0.05)；與安倍生坦組比較，氧化苦參堿組大鼠心肌內RhoA蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，各聯合用藥組大鼠心肌細胞RhoA蛋白表達降低(P<0.05)。

注：A為正常組，B為模型組，C為氧化苦參堿組，D為安倍生坦組，E為氧化苦參堿聯合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)，F為氧化苦參堿聯合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與安倍生坦組比較，△P<0.05。圖2 各組大鼠右心室心肌組織中RhoA蛋白表達

3.4 氧化苦參堿聯合安倍生坦對肺動脈高壓大鼠心肌組織ROCK1、ROCK2蛋白表達的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織內ROCK1、ROCK2蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，氧化苦參堿組大鼠心肌組織內ROCK1、ROCK2蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，安倍生坦組及氧化苦參堿聯合安倍生坦組大鼠心肌組織內ROCK1、ROCK2蛋白表達降低(P<0.05)；與安倍生坦組比較，各聯合用藥組心肌細胞內ROCK1蛋白表達降低(P<0.05)。

4 討論

實驗結果顯示，皮下注射野百合堿可引起右心室肥厚，間質可見炎性細胞浸潤，心肌細胞間隙增大；氧化苦參堿聯合安倍生坦用藥可減輕由野百合堿致肺動脈高壓大鼠右心室病理損傷，尤其是高劑量的氧化苦參堿與安倍生坦聯合用藥組最為明顯。病理檢查顯示，氧化苦參堿聯合安倍生坦用藥對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右心室心肌損傷具有協同保護作用。

RhoA是一類具有GTP酶活性的小分子，分子量為24 kDa，在調節細胞的運動、增殖和凋亡上發揮著重要作用。作為RhoA的下游靶點，RhoA的主要效應底物Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases, ROCKs)介導RhoA誘導的張力纖維和細胞黏附的形成[14]，在心血管疾病中扮演重要角色，例如肺動脈高壓、動脈粥樣硬化和腦血管疾病也是肌動蛋白細胞骨架的重要調節因子，可以調節血管張力和重構、細胞增殖、炎癥和氧化應激[16-17]。

注：A為正常組，B為模型組，C為氧化苦參堿組，D為安倍生坦組，E為氧化苦參堿聯合安倍生坦組(50 mg/kg+10 mg/kg)，F為氧化苦參堿聯合安倍生坦組(25 mg/kg+10 mg/kg)。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與安倍生坦組比較，△P<0.05。圖3 各組大鼠右心室心肌組織中ROCK1和ROCK2蛋白表達

ROCK1和 ROCK2是最早發現的RhoA下游蛋白，具有高度同源性，其氨基酸排列順序具有65%的同源性，激酶結構域同源性可達92%[18]，兩者組織表達存在差異，ROCK1主要在免疫細胞、神經細胞、肺臟、肝臟上表達，ROCK2 在心肌、血管、腦組織中高度表達[19]。ROCK1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，常通過caspase-3介導途徑調控細胞凋亡，下調ROCK1可降低心肌細胞凋亡[20]，并可上調TGF-β1表達，調控心肌纖維化[21]。研究表明，高血壓、急性心肌梗死時，ROCK2表達會上調[22],并通過氧化應激誘導調控心肌細胞凋亡[21]。因此，RhoA/ROCK可能是預防或改善心肌肥厚和纖維化的潛在靶點。

本實驗結果顯示，模型組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達升高，說明野百合堿所致肺動脈高壓大鼠的心肌RhoA/ROCK通路被激活；氧化苦參堿聯合安倍生坦(25 mg/kg +10 mg/kg、50 mg/kg +10 mg/kg)可抑制野百合堿致肺動脈高壓大鼠心肌細胞中RhoA的表達，同時下調ROCK1和 ROCK2的表達，而且對ROCK2的影響要大于ROCK1，說明氧化苦參堿聯合安倍生坦用藥后可調控RhoA/ROCK通路上關鍵蛋白的表達，從而對肺動脈高壓引起的心肌肥厚有抑制作用。

綜上所述，氧化苦參堿聯合安倍生坦通過下調RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達，減輕心肌組織形態學結構的病理學異常改變，維護心肌結構的完整性，對野百合堿所致肺動脈高壓大鼠右心室肥厚具有抑制作用。