六味地黃苷糖片多糖部位相對分子質(zhì)量與組成分析

郝曉娟， 付 娟， 胡軍華， 王振中， 肖 偉1，*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001)

六味地黃方由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成，始見于《小兒藥證直訣》，由宋朝名醫(yī)錢乙首創(chuàng)，是中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典名方[1]。六味地黃苷糖片是在六味地黃湯的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)、藥效學(xué)活性評價(jià)，經(jīng)兩次醇沉、兩步層析提取分離，由水溶性多糖、以甘露三糖為主的寡糖，以莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷為主的糖苷類組成的創(chuàng)新中藥，其中多糖部位主要表現(xiàn)為免疫促進(jìn)作用[2]。

多糖是一類由多羥基醛或多羥基酮及其衍生物、聚合物的總稱，為中藥中主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3]，其分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性有明顯差異，近年來越來越受到關(guān)注。由于該成分生物活性、分子量與其分布和組成密切相關(guān)，故2015年版《中國藥典》已將相對分子質(zhì)量及其分布列入該成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)以六味地黃苷糖片中多糖部位為研究對象，對其相對分子質(zhì)量及組成進(jìn)行初步考察，不僅為進(jìn)一步研究該部位生物活性與其一級結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供基礎(chǔ)，又為提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

AL204、MS-105DU電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市康華電子儀器制造廠)；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；LC-28AB高效液相色譜儀，配置RID-10A示差折光檢測器(日本島津公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；HGC-36A型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Agilent7890B-7698A氣相色譜儀(美國安捷倫公司)；磷酸二氫鉀為色譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸為色譜純，購自美國天地公司；乙醇、丙酮、乙醚、吡啶、甲醇、硼氫化鈉、三氯甲烷等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丙胺購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。各相對分子質(zhì)量葡聚糖(T670、T410、T270、T110、T70、T40、T20、T5)購自美國Sigma-Aldrich公司、阿拉丁試劑(上海)有限公司；L-(+)-阿拉伯糖(批號(hào)WXBB0 276 V，純度≥99%)、L-鼠李糖(批號(hào)WXBB5 979 V，純度≥99%)均購自美國Sigma-Aldrich公司；D-無水葡萄糖(批號(hào)110833-201908，純度99.9%)、D-木糖(批號(hào)111508-201605，純度99.9%)、D-甘露糖(批號(hào)140651-201805，純度99.9%)、肌醇(批號(hào)190077-201501，純度99.6%)、半乳糖(批號(hào)100226-201807，純度100%)、D-葡萄糖醛酸(批號(hào)140648-201804，純度99.8%)、D-半乳糖醛酸(批號(hào)111646-201702，純度95.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院。

六味地黃苷糖片多糖部位(批號(hào)Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202)，購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司。

2 方法

2.1 分子量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) TSK-GEL G4000PWXL、TSK-GEL G1000PW色譜柱(7.8 mm×300 mm)串聯(lián)[6-8]；流動(dòng)相0.02 mol/L KH2PO4溶液；體積流量0.5 mL/min；RID檢測器；檢測器、柱溫箱溫度40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 多糖部位前處理 參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道。取多糖部位適量，60%乙醇洗滌，每次20 mL，渦流2 min后離心，重復(fù)以上操作至醇洗液呈無色(約洗滌16次)，轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中，分別用乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌，揮干，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取“2.1.2”項(xiàng)下醇洗多糖2.5 g，置于燒瓶中，精密加入流動(dòng)相100 mL，稱定質(zhì)量，100 ℃下回流提取1 h，放冷，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，14 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.1.4 對照品溶液制備 精密稱取不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖、D-無水葡萄糖對照品各50 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解后定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.4”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。采用GPC軟件，以對照品重均分子量的對數(shù)(logMw)為縱坐標(biāo)(Y)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到方程為Y=2.622 4×10-3X3-0.220 8X2+5.811 8X-43.186 6 (R2=0.995 2)，在5 000～670 000 Da范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，采用GPC軟件測得峰面積RSD為0.06%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，采用GPC軟件測得峰面積RSD為0.49%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取多糖部位樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定，采用GPC軟件測得峰面積RSD為0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 重均分子量測定 取六味地黃苷糖片多糖部位Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202進(jìn)行測定，測得重均相對分子質(zhì)量分別為113 912、146 446、151 939、191 694、177 122。

2.2 多糖組成分析

2.2.1 氣相色譜條件 ZB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氫火焰檢測器，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃；氮?dú)怏w積流量0.6 mL/min；分流比20∶1；程序升溫(200 ℃保持2 min，3 ℃/min升至245 ℃，10 ℃/min升至270 ℃，保持2 min)[10-13]；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品衍生物制備 精密稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、肌醇、甘露糖、無水葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸對照品各2 mg，置于10 mL具塞試管中，加入1 mL水溶解，再加入0.5 mol/L 碳酸鈉溶液78 μL，30 ℃下水浴45 min，加入4%硼氫化鈉溶液0.5 mL，室溫下放置1.5 h，滴加25%乙酸至無氣泡產(chǎn)生以除掉過量硼氫化鈉，將反應(yīng)液過陽離子交換樹脂柱，并用8 mL水洗脫，洗脫液濃縮至干后加入3 mL甲醇，濃縮至干，重復(fù)5次以除凈過量乙酸。將濃縮至干的樣品于85 ℃下真空干燥2 h，加吡啶、正丙胺各1 mL，55 ℃下水浴30 min，放冷后于55 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑舆拎ぁ⒁宜狒?.5 mL，95 ℃下水浴1 h，放冷后于25 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?0 ℃下真空干燥3 h，取無水硫酸鈉干燥24 h 的0.3 mL氯仿溶解樣品，取10 μL，氯仿稀釋至200 μL，即得，并進(jìn)行GC分析[14-15]。

2.2.3 樣品衍生物制備 精密稱取樣品5 mg，加入0.4 mol/L三氟乙酸3 mL，100 ℃下水浴4 h，加入甲醇3 mL濃縮至干，反復(fù)4～5次以除凈三氟乙酸，加1 mL水充分溶解，從“加入0.5 mol/L 碳酸鈉溶液78 μL”開始，其余操作同“2.2.2”項(xiàng)下，即得。

2.2.4 單糖組成測定 取六味地黃苷糖片多糖部位Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 單糖組成測定結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 相對分子質(zhì)量測定

3.1.1 流動(dòng)相選擇 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液、“2.1.4”項(xiàng)下對照品溶液，分析采用TSK-GEL G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)色譜柱；流動(dòng)相Na2SO4、NaH2PO4、KH2PO4溶液；體積流量0.5 mL/min；RID檢測器、柱溫箱溫度40 ℃，結(jié)果見圖1。由此可知，Na2SO4溶液洗脫時(shí)供試品溶液在保留時(shí)間20.5 min附近有1個(gè)固定倒峰，可影響葡聚糖出峰，而NaH2PO4、KH2PO4溶液洗脫時(shí)不存在倒峰，故選擇磷酸鹽溶液作為流動(dòng)相。

圖1 各流動(dòng)相下T40 HPGPC色譜圖

3.1.2 供試品提取方式選擇 取“2.1.2”項(xiàng)下多糖樣品，加流動(dòng)相渦流2 min，制成每1 mL含25 mg單糖的供試品溶液，離心，取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。由此可知，多糖樣品直接渦流后進(jìn)樣時(shí)色譜圖分離度較差，重均相對分子質(zhì)量20 000～70 000，可能是因?yàn)闇u流不能將大分子量的多糖提取完全。

圖2 渦流提取多糖分子量HPGPC色譜圖

3.1.3 串聯(lián)色譜柱選擇 固定流動(dòng)相為KH2PO4溶液，檢測器、柱溫箱溫度均為40 ℃，體積流量0.5 mL/min，RID檢測器，考察單用TSK-GEL G4000PWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm)及串聯(lián)TSK-GEL G1000PW色譜柱(7.8 mm×300 mm)的分離效果，結(jié)果見表2、圖3～4。由此可知，單根色譜柱的分離度低于串聯(lián)色譜柱，不能很好地表明多糖部位的重均相對分子質(zhì)量，故本實(shí)驗(yàn)選擇串聯(lián)色譜柱。

表2 單根色譜柱分子量測定結(jié)果

圖3 單根色譜柱多糖樣品HPGPC色譜圖

圖4 串聯(lián)色譜柱多糖樣品HPGPC色譜圖

3.2 單糖組成分析

3.2.1 多糖部位酸水解種類選擇 分別采用硫酸、三氟乙酸對多糖部位進(jìn)行酸水解并衍生后，采用紫外檢測器測定各單糖含量，結(jié)果見表3。由此可知，三氟乙酸水解后除半乳糖醛酸含量低于硫酸水解后外，其他單糖的量均更高，而且該試劑腐蝕性小，沸點(diǎn)較低，容易除去，故本實(shí)驗(yàn)選擇其對多糖部位進(jìn)行水解。

表3 硫酸、三氟乙酸水解多糖后單糖含量比較

3.2.2 水解條件選擇 分別以0.4 mol/L三氟乙酸、2 mol/L三氟乙酸對多糖部位水解2、4、6 h，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備衍生物，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4。由此可知，0.4 mol/L三氟乙酸水解4 h、0.4 mol/L三氟乙酸水解6 h、2 mol/L三氟乙酸水解6 h得到的單糖種類相同，綜合考慮成本和效率，本實(shí)驗(yàn)選擇0.4 mol/L三氟乙酸水解4 h。

表4 水解條件考察結(jié)果

3.2.3 結(jié)果分析 多糖部位經(jīng)過三氟乙酸水解后采用GC-MS進(jìn)行分析，并與NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，結(jié)合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后比對保留時(shí)間，初步鑒定出7種單糖衍生物，色譜圖見圖5，GC-MS裂解碎片與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的對比見圖6，由于阿拉伯糖、木糖均為五碳醛糖，甘露糖、葡萄糖、半乳糖均為六碳醛糖，衍生后質(zhì)譜碎片相似，故在NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中得到的結(jié)構(gòu)信息也相似。表5、圖5顯示，多糖水解液在鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡

1.鼠李糖 2.阿拉伯糖 3. 木糖 4. 肌醇 5. 甘露糖 6. 葡萄糖 7. 半乳糖 8.葡萄糖醛酸 9. 半乳糖醛酸圖5 各單糖GC色譜圖

注：圖中央橫線上方數(shù)字為樣品裂解數(shù)據(jù)，下方數(shù)字為數(shù)據(jù)庫裂解數(shù)據(jù)。圖6 各色譜峰GC-MS裂解碎片與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比較

萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸7種單糖相同保留時(shí)間處均存在對應(yīng)色譜峰，并且多糖水解液中葡萄糖含量最高。

任鳳霞[16]等報(bào)道，六味地黃湯中多糖部位由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成，而未檢測到木糖與甘露糖；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多糖水解液中木糖、甘露糖含量較低，表明GC法可提高檢測靈敏度。

4 討論與結(jié)論

六味地黃苷糖片是按照由“中藥飲片組方(飲片配伍)向中藥復(fù)方活性成分群組方(組分配伍)發(fā)展”的中藥經(jīng)典方劑“二次開發(fā)”思路，多糖部位是該制劑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要部位，但該成分具有難氣化、無紫外吸收等特點(diǎn)，導(dǎo)致相關(guān)研究成為中藥領(lǐng)域的難點(diǎn)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇、丙酮、乙醚對六味地黃苷糖片多糖部位進(jìn)行脫脂，并除去色素及小分子雜質(zhì)。由于HPGPC測定多糖部位相對分子質(zhì)量以Na2SO4溶液為流動(dòng)相時(shí)，在固定位置有倒峰，從而影響測定，故本實(shí)驗(yàn)選擇磷酸鹽溶液作為流動(dòng)相。僅以TSK-GEL G4000PWXL色譜柱為固定相時(shí)，色譜峰分離度差，而串聯(lián)TSK-GEL G1000PW色譜柱后峰形和分離效果較好，最終測得其相對分子質(zhì)量在10萬～20萬之間。再通過GC-MS法對六味地黃苷糖片多糖部位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成，其中葡萄糖含量最高，而且結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸，推測該聚糖可能主要由葡萄糖組成，同時(shí)各批次之間單糖組成無明顯差異。

表5 單糖標(biāo)準(zhǔn)液、多糖水解液中單糖GC保留時(shí)間比較(min)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)完善了六味地黃苷糖片多糖部位原料及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為該制劑質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。